基于新一代測(cè)序的SNP單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥PGD中的應(yīng)用

陳林君，刁振宇，徐志鵬，周建軍，顏桂軍，孫海翔

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210008)

基于新一代測(cè)序的SNP單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥PGD中的應(yīng)用

陳林君，刁振宇，徐志鵬，周建軍，顏桂軍，孫海翔*

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210008)

目的 探討基于新一代測(cè)序(NGS)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥(CCA)種植前遺傳學(xué)診斷中的有效性。 方法 對(duì)活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞采用多重置換擴(kuò)增(MDA)的方法擴(kuò)增全基因組，應(yīng)用基于NGS的SNP單體型分析和直接測(cè)序兩種方法對(duì)MDA產(chǎn)物進(jìn)行CCA的種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)。 結(jié)果 應(yīng)用MDA方法對(duì)活檢的4枚囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞成功地進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增；通過(guò)基于NGS的SNP單體型分析發(fā)現(xiàn)，其中兩枚是未感染CCA的囊胚，另兩枚是感染CCA的囊胚；單體型分析結(jié)果與直接測(cè)序法結(jié)果一致。取卵5個(gè)月后患者移植一枚基因型正常的冷凍囊胚，于妊娠的第38周經(jīng)剖宮產(chǎn)成功分娩一體重為2 850 g的健康嬰兒。 結(jié)論 基于NGS的SNP單體型分析是單基因病的種植前遺傳學(xué)診斷的有效篩查工具。

種植前遺傳學(xué)診斷； 先天性攣縮性蜘蛛樣指癥； 多重置換擴(kuò)增； 新一代測(cè)序； 單核苷酸多態(tài)性

(JReprodMed2017，26(1)：59-63)

先天性攣縮性蜘蛛樣指癥(congenital contractural arachnodactyly，CCA)是一種常染色體顯性遺傳的結(jié)締組織病，以皺耳、蜘蛛樣指、關(guān)節(jié)攣縮(尤其是肘和膝關(guān)節(jié))、窄體型和脊柱側(cè)彎為特點(diǎn)[1-2]。CCA是由原纖維蛋白2(fibrillin 2，F(xiàn)BN2)基因的突變引起的，這些突變(包括無(wú)義和錯(cuò)義突變、插入/復(fù)制以及拼接位點(diǎn)突變)主要分布于FBN2基因的22至36外顯子之間[3-4]，目前還沒(méi)有有效的治療方法。因此，開(kāi)展種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)仍是目前最好的應(yīng)對(duì)策略。通過(guò)PGD可以移植基因型完全正常的胚胎，這樣可以避免產(chǎn)前診斷中因發(fā)現(xiàn)患病胎兒而終止妊娠對(duì)母體造成的身心傷害。單體型分析可以將單基因病中的致病基因所在的染色體與正常染色體區(qū)分開(kāi)來(lái)[5]，也可以避免直接檢測(cè)中因等位基因脫扣(allele dropout，ADO)或基因重組(recombination)而導(dǎo)致的誤診[6-7]，特別是對(duì)于常染色體顯性遺傳病的PGD具有更重要的臨床意義。本文闡述了基于NGS的SNP單體型分析對(duì)CCA的種植前遺傳學(xué)診斷的方法。

資料和方法

一、研究對(duì)象

患者夫婦：女方正常，男方患有CCA，夫婦育有一CCA患兒，父子均具有典型的CCA臨床癥狀，其外周血基因組DNA(gDNA)經(jīng)一代測(cè)序發(fā)現(xiàn)CCA的致病基因(FBN2基因)33號(hào)外顯子發(fā)生一錯(cuò)義突變(c.4274 G>A，p.Cys1425Try)。該夫婦于2014年6月來(lái)我中心要求行PGD治療。

二、研究方法

1.促排卵、體外受精和胚胎培養(yǎng)：患者采用長(zhǎng)方案降調(diào)節(jié)，于黃體中期皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)必佳，F(xiàn)erring，德國(guó))進(jìn)行降調(diào)。當(dāng)降調(diào)滿足要求后，給予促性腺激素(Gn)重組人卵泡刺激素(rFSH，果納芬，Merck Serono，瑞士)150 ～ 225 U/d，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到18 mm時(shí)給予HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)10 000 U，36 h后行陰道超聲介導(dǎo)下取卵術(shù)。成熟卵母細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，ICSI后16～18 h評(píng)估受精結(jié)果，以出現(xiàn)兩個(gè)原核(2PN)的受精卵為正常受精的胚胎，胚胎采用G1/G2(Vitrolife，瑞典)序貫培養(yǎng)法，在37℃、三氣(6% CO2，5%O2，89%N2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢、囊胚冷凍和全基因組擴(kuò)增：用激光在ICSI后第3天胚胎的透明帶上打一個(gè)孔徑為11 μm的小孔，以便滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠從此孔疝出。于ICSI后第5天上午對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞疝出的囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。用活檢針吸取5～10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞，并用激光輔助切割；活檢下來(lái)的滋養(yǎng)層細(xì)胞用PBS(SAGE，美國(guó))漂洗3次并迅速轉(zhuǎn)移至0.2 ml PCR管中于-80℃保存。活檢后的囊胚采用Kitazato玻璃化冷凍試劑盒(Kitazato Biopharma，日本)冷凍保存于液氮中。

全基因組擴(kuò)增采用多重置換擴(kuò)增(MDA)方法，MDA試劑盒采用REPLI-g單細(xì)胞試劑盒(Qiagen，德國(guó))。MDA產(chǎn)物純化后可以直接PCR或-20℃保存。

3.基于NGS的SNP單體型分析：在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/) 中的FBN2基因上下游5 Mb區(qū)域篩選來(lái)自CHB(北方漢人)和CHS(南方漢人)的58個(gè)最小等位基因頻率均大于0.2的SNP高頻突變位點(diǎn)和一個(gè)致病位點(diǎn)(FBN2的33號(hào)外顯子突變位點(diǎn)c.4274 G>A)。登陸網(wǎng)站(https：//www.ampliseq.com/)提交這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。隨后進(jìn)行DNA純化，應(yīng)用試劑盒Ion AmpliSeq(Life Technologies，美國(guó))建庫(kù)和PGM(Life Technologies，美國(guó))測(cè)序，選擇若干有效位點(diǎn)建立單體型。

4.直接測(cè)序法：采用PCR方法擴(kuò)增FBN2基因的33號(hào)外顯子。

上游引物為5’-CACCCTCAGTAGAAGTCAGAATG-3’，下游引物為5’-TACATAGTCACCTGCAAGTCAAG-3’。

PCR反應(yīng)體系為50 μl∶5 μl的MDA產(chǎn)物(100倍稀釋)或100 ng gDNA，5 μl的10×PCR buffer，1.5 μl的50 mmol/L MgCl2，1 μl的10 mmol/L dNTP mix，1 μl的10 μmol/L引物，1.5 U Taq DNA polymerase(Invitrogen，美國(guó))。PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min；隨后以(96℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)×40；最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工測(cè)序。

5.凍胚移植與隨訪：于取卵5個(gè)月后，患者口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，Bayer，德國(guó))6 mg/d準(zhǔn)備內(nèi)膜進(jìn)行凍融胚胎移植(FET)。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d。當(dāng)黃體酮補(bǔ)充至第6天時(shí)進(jìn)行凍融胚胎移植。

在移植后的第14天測(cè)血清β-HCG水平確定妊娠情況。移植后第42天經(jīng)超聲檢查孕囊有胎心確定為臨床妊娠。妊娠21周時(shí)進(jìn)行羊水穿刺。

結(jié) 果

一、體外受精、胚胎培養(yǎng)

患者共獲取卵17枚，其中16枚成熟卵母細(xì)胞行ICSI授精。ICSI后16～18 h觀察有9枚正常的2PN受精卵。ICSI后第3天有4枚胚胎發(fā)育至8-細(xì)胞，另外5枚胚胎分別發(fā)育至10-細(xì)胞、9-細(xì)胞、7-細(xì)胞、6細(xì)胞、2-細(xì)胞。ICSI后第5天有3枚胚胎發(fā)育至囊胚(編號(hào)分別為：B4、B5、B10)，第6天有1枚胚胎發(fā)育至囊胚(編號(hào)為：B13)。對(duì)這4枚囊胚成功進(jìn)行了滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。

二、CCA診斷結(jié)果

采用MDA方法成功對(duì)4枚活檢囊胚(B4、B5、B10、B13)的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增。

在單體型分析時(shí)，我們選擇58個(gè)SNP高頻突變位點(diǎn)和一個(gè)致病位點(diǎn)(c.4274 G>A)對(duì)父親、母親和CCA患兒的外周血gDNA進(jìn)行檢測(cè)。選擇父親在某個(gè)SNP位點(diǎn)上為雜合，而母親在該位點(diǎn)上為純合或雜合，同時(shí)結(jié)合CCA患兒的SNP位點(diǎn)，最終選擇符合要求的15個(gè)SNP位點(diǎn)和致病位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建該家系單體型(表1)。

根據(jù)家系單體型結(jié)果對(duì)4個(gè)活檢囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞的MDA產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)B4和B10為正常囊胚，而B(niǎo)5和B13為感染CCA囊胚(表1)；同時(shí)在囊胚B13中發(fā)生了來(lái)源于母源的基因重組現(xiàn)象(表1中B13的3號(hào)SNP位點(diǎn))，但該重組并沒(méi)有影響PGD結(jié)果。

直接測(cè)序法結(jié)果與單體型分析結(jié)果完全一致(圖1)。

三、隨訪結(jié)果

在妊娠38周時(shí)剖腹產(chǎn)一體重為2 850 g的健康嬰兒，新生兒手指外型正常，其外周血gDNA中也未見(jiàn)致病基因突變，而父親和CCA患兒均表現(xiàn)為屈曲指(圖2)。

表1 基于NGS的SNP單體型分析

SNP位點(diǎn)父親母親CCA患兒B4B5B10B133GAAAAAAGAAAGAA12CTTTTTTCTTTCTT13GCGGGCGGGCGGGC16AGAAAGAAAGAAAG20TCCTCCTTTCCTCC21CACCCACCCACCCA22TCTTTCTTTCTTTC27(致病位點(diǎn))GAGGGAGGGAGGGA37CACCCACCCACCCA43TATTTATTTATTTA45TCCTCCTTTCCTCC47CGGCGGCCCGGCGG54GCCCCCCGCCCGCC56GCGGGCGGGCGGGC58TATTTATTTATTTA59TCTTTCTTTCTTTC

B4和B10為正常基因型囊胚；B5和B13為CCA囊胚圖1 囊胚活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞的直接測(cè)序結(jié)果

箭頭示父親及患兒的屈曲指圖2 家庭成員的手指外型

討 論

CCA的發(fā)病率目前無(wú)法估計(jì)，因?yàn)樗c另一種遺傳疾病馬凡氏綜合征(Marfan syndrome，MFS)在臨床表型上有部分重疊，而MFS是由原纖維蛋白1(FBN1)突變引起的[8]。因此，可以從基因水平上區(qū)分這兩種遺傳病。在我們的報(bào)道中，CCA是由FBN2基因的33號(hào)外顯子發(fā)生一錯(cuò)義突變(c.4274 G>A)引起的。

PGD幾乎能診斷所有已知突變的遺傳病，但仍有一些因素會(huì)導(dǎo)致PGD誤診[9]。ADO是導(dǎo)致PGD誤診的因素之一，對(duì)于顯性遺傳病而言，ADO會(huì)導(dǎo)致移植含有致病基因的胚胎。一旦發(fā)生誤診將會(huì)對(duì)患者造成經(jīng)濟(jì)上，尤其是精神上無(wú)法挽回的傷害。在診斷單基因病時(shí)一般采用多個(gè)多態(tài)(STR或SNP)位點(diǎn)結(jié)合致病位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析來(lái)發(fā)現(xiàn)ADO等誤診因素并防止誤診[10-11]。在我們的研究中，我們采用單體型分析和直接測(cè)序法兩種方法對(duì)CCA進(jìn)行診斷，確保PGD的準(zhǔn)確性。

單體型分析方法除了可以發(fā)現(xiàn)ADO外，還可以區(qū)分致病基因所在的染色體和正常染色體，單倍體胚胎和二倍體胚胎。Qubbaj等[12]報(bào)道用直接測(cè)序法和單體型分析由純合突變引起的先天性高胰島素癥(congenital hyperinsulinism)。他們對(duì)活檢的卵裂球的MDA產(chǎn)物行直接測(cè)序，同時(shí)選用了7個(gè)連鎖的STR位點(diǎn)來(lái)驗(yàn)證直接測(cè)序的準(zhǔn)確性。其中4個(gè)胚胎中的一個(gè)胚胎經(jīng)直接測(cè)序診斷為正常的胚胎，而通過(guò)單體型分析發(fā)現(xiàn)該致病基因所在染色體的胚胎僅僅只有來(lái)源于父源等位基因，即該致病基因所在的染色體為單倍體或單體，這個(gè)胚胎是部分單體不能被用來(lái)移植。這就是單體型分析方法的優(yōu)勢(shì)所在，而直接測(cè)序法是無(wú)法做到的。此外還有一個(gè)潛在的誤診因素(基因重組)也是直接測(cè)序法無(wú)法發(fā)現(xiàn)的。減數(shù)分裂重組也會(huì)引發(fā)誤診[7]，由于多態(tài)位點(diǎn)并不是致病基因本身，兩者雖然緊密連鎖但仍相距一定的距離，減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生的基因重組可能會(huì)將多態(tài)位點(diǎn)與致病基因分割開(kāi)來(lái)，甚至相距1 Mb的距離都會(huì)有1%的重組發(fā)生[13]。為了防止因基因重組而引發(fā)的誤診，在單體型分析時(shí)應(yīng)盡可能選擇更多且離致病基因上下游較遠(yuǎn)距離的多態(tài)位點(diǎn)。在我們的研究中，我們沒(méi)有采用STR作為多態(tài)位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行單體型分析，而是選擇在人基因組中數(shù)量更多且分布更廣的SNP位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序(NGS)來(lái)進(jìn)行單體型分析。由于SNP在不同人群中發(fā)生的頻率是有變化的，我們?cè)谀戏綕h人和北方漢人基因組中選擇致病基因FBN2上下游5 Mb范圍內(nèi)的58個(gè)SNP高頻突變位點(diǎn)和致病位點(diǎn)(c.4274 G>A)，通過(guò)NGS獲得每個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因型，最終選擇了其中的15個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建家系單體型來(lái)確定致病位點(diǎn)所在染色體(表1)，通過(guò)家系單體型再來(lái)分析囊胚感染CCA的情況(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊胚B4和B10是沒(méi)有感染CCA的正常胚胎，而囊胚B5和B13是感染CCA的胚胎。此外，我們?cè)谀遗連13中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來(lái)源于母源性重組現(xiàn)象(表1)，但這個(gè)重組并沒(méi)有影響PGD的結(jié)果。單體型分析與直接測(cè)序法結(jié)果完全一致(圖1)，但單體型分析可以將致病位點(diǎn)(c.4274 G>A)所在的染色體和正常染色體區(qū)分開(kāi)來(lái)，同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)重組，保證PGD的準(zhǔn)確性，而直接測(cè)序法沒(méi)有這些優(yōu)勢(shì)。因此，單體型分析結(jié)合致病基因檢測(cè)可以作為單基因病PGD的一種策略。

雖然PGD已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，但是產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)PGD仍有誤診存在。據(jù)歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(huì)(ESHRE)PGD聯(lián)盟報(bào)道[14]，基于PCR和FISH的PGD周期中分別有0.14%和0.06%的誤診。一般建議接受PGD治療的患者在妊娠期間做產(chǎn)前診斷以確保PGD的準(zhǔn)確性[15]。我們報(bào)道的患者于妊娠的21周行羊水穿刺，在培養(yǎng)的羊水細(xì)胞gDNA中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CCA致病基因的突變。此外，新生兒出生后具有完全正常的手指外型，其外周血gDNA也未見(jiàn)CCA致病基因的突變(圖2)，這些都說(shuō)明CCA的PGD是完全準(zhǔn)確的。

總之，采用基于NGS的SNP單體型分析結(jié)合致病基因檢測(cè)進(jìn)行CCA的PGD，可以保證基因診斷的準(zhǔn)確性，為該技術(shù)在其他單基因病診斷中的臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

致謝

特別感謝北京嘉寶仁和醫(yī)療科技有限公司在單體型分析上提供的技術(shù)支持。

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[編輯：侯麗]

Application of NGS-based SNP haplotyping for preimplantation genetic diagnosis of congenital contractural arachnodactyly

CHEN Lin-jun， DIAO Zhen-yu， XU Zhi-peng， ZHOU Jian-jun， YAN Gui-jun， SUN Hai-xiang*

ReproductiveMedicineCenter，DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalCollege，Nanjing210008

Objective： To investigate the effectiveness of next generation sequencing (NGS)-based single nucleotide polymorphism (SNP) haplotyping for preimplantation genetic diagnosis (PGD) of congenital contractural arachnodactyly (CCA).Methods： Multiple displacement amplification (MDA) was performed for whole genome amplification (WGA) of biopsied trophectoderm cells. NGS-based SNP haplotyping and direct mutation detection by sequencing were used for PGD of CCA.Results： MDA was successfully performed for WGA of biopsied trophectoderm cells from four blastocysts. NGS-based SNP haplotype found that two blastocysts were unaffected by CCA， while another two blastocysts were affected by CCA. These diagnostic results were consistent with the results of direct mutation detection by sequencing. One blastocyst was transferred in the subsequent frozen embryo transfer (FET) cycle five months after oocyte retrieved. A weight of 2 850 g of healthy baby was born by cesarean section at the 38thweek of gestation.Conclusions： NGS-based SNP haplotyping is an effective screening tool for PGD of monogenic disorders.

Preimplantation genetic diagnosis； Congenital contractural arachnodactyly； Multiple displacement amplification； Next generation sequencing； Single nucleotide polymorphism

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.011

2016-06-26；

2016-07-19

陳林君，男，江蘇金壇人，碩士，助理研究員，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*