阿爾茨海默病小鼠模型海馬組織AtP5a1基因甲基化改變

唐曉琴+唐紅+鄧飛+阮思蓓+李昕+陳波+楊朝鮮+熊小明+唐明希

[摘要]目的初步探討中期阿爾茨海默病（AD）的presenilin-1/presenilin-2雙基因條件性敲除小鼠（dKOmice）模型中海馬組織Atp5al基因的甲基化改變情況。方法運用簡化的表觀亞硫酸鹽測序技術（RRBS）檢測3只12月齡雌性dKO mice和3只同系同齡雌性野生型小鼠海馬組織基因組DNA異常甲基化情況，利用Bismark（v0.7.4）軟件進行對照分析獲取異常甲基化基因。結果二代測序結果顯示12月齡中度神經退行性病變AD dKO mice海馬中Atp5al基因呈低甲基化狀態（P<0.05）。結論Atp5al基因在中期ADdKO mice的海馬中呈低甲基化狀態，提示低甲基化的Atp5al基因可能作為參與中期AD病程的潛在候選基因。

[關鍵詞]Atp5al基因；阿爾茨海默病；DNA甲基化；dKO inlce

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種以進行性記憶障礙及認知功能減退為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病，典型病理改變是大腦皮層和海馬細胞外主要由β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，A p）沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結。其發病機制復雜，涉及遺傳因素、環境因素、成千上萬個基因表達的改變及多種信號途徑的調節，如Aβ的沉積、tau蛋白的過度磷酸化、氧化應激、炎癥、能量代謝及細胞凋亡周期異常等。Mastroeni D等以同卵雙胞胎作為研究對象，發現正常的和患AD的雙胞胎盡管遺傳基因相同，但是他們的表觀遺傳修飾卻不同，AD患者的雙顳側皮層神經元中DNA甲基化水平顯著低于正常的同卵同胎，而且，其發病年齡、臨床表現和病程都相差很大。可見，表觀遺傳機制在AD的發病過程中扮演著十分重要的角色。

隨著高通量測序技術的開展，AD相關基因的甲基化分析已經取得一些進展。本研究采用簡化的表觀亞硫酸鹽測序技術（reduced representationbisulphite sequencing，RRBS）初步構建起了中期AD dKO mice海馬組織基因組DNA甲基化圖譜，從中發現Atp5a1基因呈低甲基化狀態，可為后續進一步驗證并探討AD的表觀遺傳學機制提供潛在候選靶基因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

美國Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）為本實驗提供了親代小鼠（基因型為fPSl/fPSl，PS2-/-，Cre+/-），其遺傳背景為B6CBAFl，是利用Cre/loxP系統條件性敲除前腦presenilin-1（PS1）基因，所得雜合子與利用基因打靶技術將presenilin-2（PS2）基因進行全身性敲除所得雜合子雜交而來。子代dKO mice的飼養、繁殖與基因型鑒定等如我們已報道所述。實驗分組：12月齡雌性dKOmice（體重=35.0±2.6g）和同齡雌性野生型小鼠（體重=37.0±1.8g）各3只用于RRBS測序檢測。

1.1.2海馬組織的準備（1）乙醚麻醉后快速斷頸處死實驗小鼠；（2）用組織剪剪開皮毛，暴露頭骨；（3）更換剪刀撥開顱骨，暴露全腦；（4）用眼科剪剝離全腦組織，轉移至放于碎冰上的無菌平皿中；（5）用手術刀沿矢狀縫把左右半球分開，迅速分離海馬組織，裝入已標記好的凍存管中，用封口膠封口，置于液氮罐中約30min后，轉入-80℃冰箱中保存。

1.2方法

1.2.1 DNA提取TIANamp DNA提取試劑盒（貨號DP304）購自天根生化科技有限公司。提取海馬組織基因組DNA主要步驟包括：（1）將組織處理成細胞懸液；（2）裂解：在變性條件下用蛋白酶K裂解樣本；（3）吸附：DNA吸附于純化柱中的硅膠膜上；（4）清洗：將硅膠膜上吸附的蛋白、脂質等雜質洗掉；（5）洗脫：利用洗脫液TE將高純度的DNA從硅膠膜上洗脫。運用紫外分光光度計測量OD值（0D260/280和0D260/230）和0.8%瓊脂糖凝膠電泳（100V，40min）進行DNA質量檢測。

1.2.2RRBS測序將純化后的DNA提交到杭州聯川生物技術有限公司進行甲基化譜RRBS測序（Illumina HiSeq 2500）。RRBS測序原理：運用限制性內切酶MsPI處理基因組DNA，產生末端包含CpG二核苷酸的片段后，在末端修復并加A尾和接頭，根據大小（40-220bp）選擇CpG豐富DNA片段，經重亞硫酸鹽處理及PCR擴增后使用Illumina基因組分析儀進行測序。測序完成后，采用NGSQCToolkit_v2.3軟件進行測序數據的質量控制，將5%以上堿基質量數低于30的序列過濾掉，并在Bismark（v0.7.4）軟件中將過濾后的高質量測序數據比對到小鼠參考基因組序列上，分別計算每個樣本Atp5al基因發生甲基化的碳（C）數比上總C數而得到其相對甲基化水平，再提取6個樣本的相對甲基化水平，采用edgeR軟件進行差異分析，獲得異常甲基化基因。發生甲基化的篩選標注為P<0.05。

2結果

2.1海馬組織DNA質量鑒定結果

經紫外線分光光度計測定，用于RRBS檢測的海馬組織基因組DNA樣品滿足：0D260/280≥1.8，0D260/230≥1.5（表1）。將提取的DNA進行0.8%瓊脂糖電泳檢測（100V，40min），結果顯示：DNA樣品電泳條帶完整清晰，符合RRBS檢測及單基因甲基化檢測要求（圖1）。

2.2Atp5a1基因甲基化篩選結果

RRBS檢測完成后，利用Bismark（v0.7.4）軟件同小鼠參考基因組序列進行對比分析，篩選出異常甲基化基因Atp5a1呈低甲基化狀態。如表2所示，Atp5a1基因位于第十八號染色體外顯子起始位點為77778732，終止位點為77778899，通過Bismark（v0.7.4）軟件中將過濾后的高質量測序數據比對到小鼠參考基因組序列上，利用實驗組與對照組測序結果，采取edger軟件進行相對甲基化率差異分析，獲得異常甲基化基因Atp5a1（P<0.05）。

3討論

隨著人口老齡化的日益加重，對AD發病機制的研究也越來越緊迫。流行病學調查顯示，2014年用于護理患AD和其他癡呆患者的費用超過2170億美元，預計到2015年用于65歲及以上AD患者的衛生保健、長期護理和臨終關懷等服務的總費用將達2260億美元。目前，每67秒就會有一個人被診斷為AD患者，預計到2050年，這個時間將縮短為33秒，每年將導致近100萬新發病例。顯然，AD已經成為一個舉世矚目的社會和醫學問題。dKO mice模型已被證實具有AD樣神經退行性疾病的典型表型，如大腦皮質和海馬萎縮、側腦室和第三腦室擴大、嚴重神經元的損失、神經膠質過多癥、tau蛋白的過度磷酸化、學習和記憶功能喪失等。該動物模型容易存活、飼養和繁殖，于2個月齡時開始出現輕度記憶障礙，6個月齡時大腦皮層明顯變薄，皮層神經元丟失達18%左右；12月齡時表現出中期AD樣表型。本實驗運用RRBS測序檢測12月齡dKO mice和野生型小鼠海馬組織中基因組DNA異常甲基化分布情況，利用相關生物軟件對照分析，發現了存在于第十八號染色體外顯子的Atp5al（ATP synthase-a）基因呈低甲基化狀態。

Atp5a1基因編碼的是ATP合成酶的a-亞基，ATP合成酶廣泛分布于線粒體內膜上，負責將呼吸鏈中的ADP合成為ATP，Atp5a1基因缺失將導致該酶失活，使細胞凋亡。研究表明，Atp5a1在多種腫瘤細胞中表達異常，如在結直腸癌的腫瘤細胞中表達減少，而在膠質母細胞瘤、食管癌的腫瘤細胞中高度表達。此外，Seth R等還發現高水平的Atp5al表達與某些單核苷酸多態性（SNPs）和TP53突變有關，能促進宮頸上皮內瘤變（CIN）的發生，從而發展為腫瘤，而Atp5a1低水平的表達可能促進基因的微衛星不穩定性（MSI）腫瘤的發生。目前尚未發現有關該基因在AD發生機制中的研究報道，本實驗RRBS測序結果顯示，Atp5a1基因在12月齡dKO mice的海馬中呈低甲基化狀態，初步提示中期AD dKO mice模型的病理過程中低甲基化的Atp5a1基因可能發揮著一定作用。但由于本實驗目前僅限于二代測序結果，研究樣本量又有限，要進一步確定Atp5a1基因是否真正參與到中期AD dKO mice的病程，還需進一步采用甲基化特異性PCR、單基因甲基化測序、RT-PCR、免疫組化及免疫印跡等方法進一步驗證并分析該基因甲基化狀態、轉錄水平及蛋白水平等改變等情況，并將進一步擴大樣本量，且結合早期及晚期dKO mice相應基因甲基化改變情況進行對比分析，為全面了解Vps33b基因的甲基化狀態在中期AD中的生物學功能提供候選基因。

綜上所述，RRBS測序結果初步顯示Atp5a1基因在中度神經退行性病變AD dKO mice的病理進程中呈低甲基化狀態，為進一步證實、篩選及研究AD發生的表觀遺傳機制、病理進程，以及AD基因靶向預防、治療、預后判斷等提供重要的候選線索。