MiRNA—351在小鼠卵泡發育中的調控作用實驗

董靜文+黃青

[摘要]目的探究MiRNA一351在小鼠卵泡發育中的調控作用。方法選取60只雌性白鼠開展實驗，分別于出生第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），獲取卵巢后經相應處理并采取RT-PCR測定不同時刻MiRNA-351表達情況，并分析該基因表達在小鼠卵泡發育中調控作用。結果不同卵泡發育階段MiRNA-315表達水平差異均有統計學意義（P<0.05）；不同卵泡發育階段顆粒細胞凋亡水平差異有統計學意義（P<0.05）；和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠遠降低，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。結論MiRNA-351在小鼠卵泡發育各個過程中可能均有參與，且對增殖和凋亡水平均有調控作用，值得進一步深入探究。

[關鍵詞]MiRNA-351；小鼠；卵泡發育；調控作用

雌性哺乳動物生殖過程十分復雜，并且呈現動態性周期變化。在卵巢生長發育過程中，卵母細胞生長、成熟、受精以及著床等均是維持正常妊娠必不可少的過程，而卵泡是卵巢生殖功能最為重要的部分，承擔著生命繁衍的重要使命。近年來隨著對人類生殖功能研究不斷深入，人們對微小RNA在卵泡發育過程中作用認識也不斷深入。據相關研究報道，MiRNA-351作為一種重要的調控因子，在細胞凋亡、增殖、分化等生理過程中均起著重要參與作用。為進一步探究MiRNA-351在卵泡發育中的調控作用，本研究特以小鼠模型為對象開展實驗探究，旨在為卵泡發育機制研究提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料

選取60只雌性小白鼠作為研究對象，均購自南京大學實驗動物中心，品系為C57 black 6，批號為000659。室溫條件下，12h光照、12h黑暗下飼養，自由采食和飲水，并嚴格控制溫度、濕度、光照條件。入選標準：（1）健康雌性白鼠；（2）經我院實驗動物倫理審查。排除標準：（1）未足月分娩幼鼠；（2）卵巢先天畸形，或發育異常。

1.2方法

1.2.1所有幼鼠均注射PMSG和HCG，劑量均為10IU，并于出生后第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），在顯微鏡下分離出小腔前卵泡（直徑100～130μm），大腔前卵泡（直徑200～280μm），有腔卵泡（直徑450～550μm）和成熟卵泡（直徑500～600μm），各15只。

儀器：切片機（德國Leica RM2135型）；移液器（美國Thermo Finnpipette型）；顯微鏡（日本Nikon 80i型）；微波爐（中國GalanzP7021TP-6型）；恒溫箱（中國福馬GHX-9270B-1型）；恒溫冰箱（中國榮事達BCD-245F）。

1.2.2主要試劑和設備（1）試劑：異丙醇、無水乙醇、β-強基乙醇、氯仿、氯化鉀、磷酸氫二鈉等均從我院實驗室領取；a-MEM培養液、胎牛血清、雙抗、胰酶等均購自美國Gibco公司、mRNA分離試劑盒購自美國Qiagen公司；（2）細胞培養皿和培養板購自美國康寧公司，恒溫水浴鍋（杭州朗越儀器HH-501型）、酶標儀（北京普朗新9602A型）、高壓滅菌鍋（濟南展康BKQP-75L型）、工作臺由我院實驗室提供、離心機（德國HERML Eppendorf 5418型）、電泳儀（美國Bio-rad 164-5070型）、超低溫冰箱（中國榮事達BCD-245F）、培養箱（中國福馬GHX-9270B-1型）、熒光顯微鏡（日本Nikon 80i型）等；（3）緩沖液配置：PBS、細胞培養液、卵泡成熟培養液以及卵泡分離液等均參照《現代實驗動物學技術》中相關方法配置。

1.2.3實驗方法參照《現代實驗動物學技術》依次行引物設計、卵泡MiRNA提取、顆粒細胞分離和體外培養、顆粒細胞轉染MiRNA、顆粒細胞凋亡和增殖水平檢測等，（1）引物設計（由大連寶生物技術有限公司設計合成）；（2）卵泡MiRNA提取：首先行樣品處理，然后采用PBS緩沖液行裂解處理，將已反轉錄好的模板行RT-PCR反應，反應程序：95℃條件下預變性（時間為5min）、95℃條件下變性（時間為10s），60℃條件下退火（時間為30s），共進行40個循環后持續緩慢升溫至95℃，自然冷卻。結果分析：利用擴增倍數公式，重復三次計算樣品中MiRNA-351表達量；（3）顆粒細胞分離和體外培養：使用胰酶、培養液等進行顆粒細胞分離、體外培養和傳代；（4）顆粒細胞轉染MiRNA：轉染前應首先行接種處理，然后將細胞置于培養基孔中，搖勻后在培養箱中37℃條件下孵育，注意需要每隔4～6h更換一次培養基；（5）顆粒細胞凋亡和增殖水平檢測：分別采用流式細胞儀和酶標儀對上述轉染后的細胞進行凋亡和增殖水平檢測，檢測前需要將顆粒細胞進行PBS緩沖液沖洗，離心分離。

1.3觀察指標

觀察不同卵泡發育階段MiRNA-315表達水平，共分為小腔前卵泡、大腔前卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡等；對比MiRNA-315對顆粒細胞凋亡和增殖水平的影響。

1.4統計學分析

采用SPSS17.0國際專用統計學軟件處理數據，表達水平、增殖效能等計量資料均用（x±s）的形式描述，多樣本比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。當P<0.05時，認為差異具有統計學意義。

2結果

2.1不同卵泡發育階段MiRNA-315表達

不同卵泡發育階段MiRNA-315表達水平差異均有統計學意義（P<0.05），其中以大腔前卵泡MiRNA-315表達水平最高，小腔前卵泡、有腔卵泡次之、成熟卵泡最低，詳情見表1。

2.2MiRNA-315對顆粒細胞凋亡水平的影響

不同卵泡發育階段顆粒細胞凋亡水平差異有統計學意義（P<0.05），其中有腔卵泡凋亡水平最高、小腔前和成熟卵泡次之、大腔前卵泡最低，詳情見表2。

2.3MiRNA-315對顆粒細胞增殖水平的影響

和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠遠降低，兩組間差異有統計學意義（P<0.05），詳情見表3。

3討論

雌性哺乳動物剛出生時卵巢內便存在有大量的卵泡，此類原始卵泡將會隨著時間的延長和卵泡池的建立逐漸開始啟動生長、凋亡等一系列生理過程。原始卵泡同時也會隨著時間的延長和年齡的增長不斷消亡耗竭，只有極少數能夠發育至成熟。而另外巨大部分卵泡由于GCs的凋亡在發育過程中出現閉鎖。GCs凋亡在卵泡發育過程中的調控作用已在小鼠模型中得到驗證，并且隨著研究不斷深入，相關抗凋亡因子和促凋亡因子及其作用也逐漸被挖掘明確。其中MiRNAs在不同出生天數，即不同卵巢發育程度時間表達譜中顯示顯著差異，并且在其它動物體外實驗研究中得到證實。MiRNA-351作為其中較為重要的一份子，在小鼠卵泡發育過程中具有顯著作用。

MiRNA-351具有多重功能，在前脂肪細胞及干細胞增殖、分化、凋亡及激素分泌調節中均具有顯著作用。該因子水平過度表達將會導致相應細胞局部形態學方面變化，并且在卵巢卵泡細胞分化、轉錄和調控作用中均有參與。據國外相關研究資料表明，將小鼠中的MiRNA-351基因敲除，將會使得卵泡細胞增殖受抑，并且在分化向凋亡轉換進程將會被明顯縮短，且在MiRNA過表達小鼠卵巢中發現卵泡細胞發育進程也同樣發生異常，在凋亡和增殖分化過程中也同樣涉及MiRNA表達及調控作用。此外，MiRNA-351表達由于在小鼠卵泡發育過程中作用不同，故而其表達水平和調控機制也不相同，在特定階段可能對復雜基因均有調控作用，從而影響其卵泡凋亡和增殖水平。MiRNA-351在不同生理發育過程和特定時間內才會表達，并參與復雜基因調控機制，從而促進卵泡生長發育。Mimics-351屬于一種模擬酶，可通過抑制相關基因表達對卵泡細胞生長產生負向調控作用，同時還可抑制其增殖和生長，推測該因子可能通過降解相關基因mRNA以調控卵泡細胞發育狀態；而Inhibitor-351為MiRNA-351基因受體，主要通過翻譯抑制和蛋白質調控途徑發揮作用，從而控制卵泡發育和閉鎖平衡。當前，關于MiRNA-351對小鼠卵泡發育中調控作用機制認識尚不夠深入，但是對于Mimics-351和Inhibitor-351二者在卵泡發育中異常表達已得到一致肯定，將為雌性動物卵巢中卵泡生長機制發育和病理改變研究提供奠定基石。

本研究結果中，不同卵泡發育程度MiRNA-315表達水平存在顯著差異，且MiRNA-315對顆粒細胞凋亡和增殖水平的影響也顯而易見，推測該因子表達水平和小鼠卵泡發育程度、細胞增殖和凋亡作用及機制均有顯著調控作用。綜上，MiRNA-315可能參與小鼠卵泡發育過程內在調控，在一系列生理改變過程中均有明顯作用。但是本研究仍存在不足：目前Mimics-351和Inhibitor-351具體作用機制尚不明確，且MiRNA-315和卵巢卵泡細胞病理改變臨床關系仍需要進一步研究探索，而隨著分子生物學發展不斷深入，上述問題將會成為今后研究重點和發展方向。