養肝解毒丸微生物限度檢查法的驗證實驗

劉廣文+苑艷飛

[摘要]目的建立適合養肝解毒丸微生物限度檢查的方法，保證方法的科學性和檢查結果的準確、可靠。方法按照《中國藥典》2015年版四部規定的微生物限度檢查法對微生物限度和控制菌進行檢查，以5種試驗菌的回收率對檢驗方法的有效性進行驗證和確認。結果在3次獨立的平行試驗中，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數驗證中各試驗菌每次試驗的比值在0.5～2的范圍內；試驗組可以檢出控制菌大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門菌。結論需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查采用薄膜過濾法，控制菌檢查可采用常規法。

[關鍵詞]養肝解毒丸；微生物限度檢查；方法學驗證

微生物試驗的結果易受試驗條件的影響，特別是制劑中含有較強的抑菌成分時，只采用常規方法進行微生物限度檢查，其結果不能真實反映其污染的微生物狀況Ⅲ?？诜苿┲形⑸镂廴緺顩r的控制是藥品質量控制的重要指標。中藥口服制劑尤其易受到微生物的污染，因此中國藥典2015年版四部通則中規定微生物限度是中藥丸劑的必檢項目。

近年來，關于中成藥微生物限度檢查的方法學驗證試驗的報道表明，通過方法學驗證試驗可以消除藥物的抑菌作用，使檢驗結果更具有效性。養肝解毒丸是由山藥、龍膽草、敗醬草、夏枯草、靈芝、牡丹皮、山茱萸等十二味中藥組方組成的復方制劑。其主要功能是滋腎，解毒?，F根據《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法規定，必須對其檢查方法進行驗證，筆者通過對養肝解毒丸進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數及相關控制菌的測定建立了適合的微生物限度檢查方法并對方法進行驗證，確保了檢測方法的可行性。

1試驗材料

1.1儀器

GNP-9270BS-Ⅲ型隔水式恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司；101A-1型數顯電熱鼓風干燥箱，深圳市億博蘭電子有限公司；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋。

1.2試藥

養肝解毒丸（泰安市中醫醫院，批號：151201，151202，151203）。

1.3培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104593）；胰酪大豆胨液體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104633）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104369）；沙氏葡萄糖液體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3103279）；腸道菌增菌液體培養基培養基；（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104601）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104591）；麥康凱液體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104449）；麥康凱瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104517）；RV沙門菌增菌液體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104566）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3104616）。

1.4稀釋劑、沖洗劑

氯化鈉一蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術有限責任公司，批號：140424）、0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5菌種

實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

以下菌株均購自山東省食品藥品檢驗研究院（符合藥典標準規定）。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003第4代]；銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104第4代]枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501第4代]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102第4代]；乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50 094第4代]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001第4代]；黑曲霉[CMCC（F）98 003第4代]。

2驗證方法與結果

2.1菌液的制備方法

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌和沙門菌的新鮮培養物至10mL胰酪大豆胨液體培養基中，將上述各培養基均置于隔水式恒溫培養箱（30～35℃）中培養18～24h。分別取各培養物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數為小于100cfu的菌懸液。

取白色念珠菌的新鮮培養物至10mL沙氏葡萄糖液體培養基中，置生化培養箱（20～25℃）培養2～3d，取培養物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數小于100cfu的菌懸液。

取黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中，置生化培養箱（20～25℃）培養5～7d，使大量的孢子形成。用5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，過濾孢子懸液至無菌試管內，取該孢子液1mL，加含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含孢子數為小于100cfu的孢子液。

2.2供試液的制備方法

每批樣品從兩個最小包裝里取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，作為1：10供試液。

2.3培養基適用性檢查

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的菌液各不大于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養18～24h，計數；取白色念珠菌、黑曲霉的菌液各不大于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，棍勻，凝固，置20～25℃培養5～7d，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。見表1。

2.4驗證方法：薄膜過濾法

試驗組：取上述1：10的供試液10mL過濾，用pH 7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中加入上述稀釋的5種菌的菌懸液1mL（小于100cfu），過濾，取出濾膜，貼于相應的培養基中，胰酪大豆胨瓊脂培養基置30～35℃培養3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養基置20～25℃培養5～7d，測定試驗菌數。

供試品對照組：取上述1：10的供試液10mL過濾，用pH 7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗濾膜，取出濾膜，貼于相應的培養基中，胰酪大豆胨瓊脂培養基置30～35℃培養3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養基置20～25℃培養5～7d，測定試驗菌數。

菌液對照組：將pH 7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液100mL置于過濾器中，加入不大于100cfu的試驗菌液，過濾后取出濾膜貼于相應的培養基中，胰酪大豆胨瓊脂培養基置30～35℃培養3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養基置20～25℃培養5～7d，測定試驗菌數。

驗證結果：依照下列公式，計算五種菌的回收率，結果見表2～4。

試驗組菌比值=（試驗組平均菌落數一供試品對照組的平均菌落數）/菌液對照組的平均菌落數。

由表2～4可見，采用薄膜過濾法對養肝解毒丸進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數比值的測定，五種菌的比值均在0.5～2的范圍內，符合《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查驗證要求，故薄膜過濾法可用于養肝解毒丸的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查。

2.5控制菌（耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌）檢查方法的驗證

耐膽鹽革蘭陰性菌：取1：10的供試液100mL，混勻，在20～25℃培養2h。取供試液3份，每份10mL，加入100mL腸道菌增菌液體培養基，其中一份加入1mL大腸埃希菌作為陽性對照，一份加入1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養24～48h后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，依法培養，觀察菌落形態。

大腸埃希菌：取1：10的供試液3份，每份10mL，加入100mL麥康凱液體培養基，其中一份加入1mL大腸埃希菌作為陽性對照，一份加入1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養24～48h后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，依法培養，觀察菌落形態。

沙門菌：取10g供試品接種至100mL胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30～35℃培養18～24h。取上述培養物3份，每份0.1mL，加入10mL RV沙門菌增菌液體培養基，其中一份加入1mL乙型副傷寒沙門菌作為陽性對照，一份加人1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養24～48h后，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，依法培養，觀察菌落形態。

驗證結果：見表5。

由表5可見，采用常規法，控制菌能正常檢出，陰性對照未檢出，符合《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查控制菌檢查驗證要求，所以常規法可用于養肝解毒丸的控制菌檢查。

通過以上驗證實驗證明，養肝解毒丸的微生物限度檢查方法，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查可采用薄膜過濾法，采用常規法控制菌也能正常檢出，由此確定驗證方法成立，本實驗室建立的該項目的檢查方法符合規定。

3討論

按照2015年版《中國藥典》四部的要求，在進行藥品微生物限度檢查時，只有在該檢驗條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長時，才能使供試品中的微生物得到真實反映，從而保證檢驗結果的科學性和準確性。有很多文獻就具有抑菌成分的中成藥的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢驗方法進行了探索和研究。中藥制劑是含有多種成分的復合制劑，其中任何成分具有抑菌作用均可影響微生物限度檢查的準確性，因此必須對藥品的微生物限度檢查方法進行嚴格的驗證，才能保證檢查方法的完整性和可靠性。

3.1實驗室的檢驗環境對試驗方法的影響

2015年版《中國藥典》對微生物限度檢查的環境提出了明確的要求：應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區域內進行，B級區域的空氣供給應通過終端高效空氣過濾器（HEPA）。應嚴格按照相關國家標準進行定期的環境監測，并制定清潔、消毒和衛生的標準操作規范，防止檢驗過程中環境造成檢品的假陽性。

3.2預處理

在進行薄膜過濾時須先將供試液采用適宜的方法進行預處理，然后再移至帶有沖洗液的濾罐中充分混勻后再進行減壓抽濾，否則由于供試液雜質太多造成濾罐堵塞引起濾罐爆裂，可能造成人員傷害。在過濾完后必須進行二次沖洗，以保證抑菌成分的徹底清除。可將取出的濾膜正面向上貼于培養基上，經多次試驗證明，這樣培養出的菌落大并且清晰，特別是在菌落數較多時，菌落會向周圍的培養基擴散，不至于菌落都堆積在一起，不利于菌落計數。

3.3菌落計數誤差對驗證方法的影響

當細菌生長小而密集時，極易發生計數誤差。故菌落計數時應仔細觀察，必要時借助放大鏡或低倍顯微鏡，以排除藥渣和小氣泡干擾計數；如難區別，可適當延長培養時間。

3.4藥品微生物檢驗用的試驗菌

試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業派生菌株。工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代（從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第0代），以防止過度的傳代增加菌種變異的風險。制備后的菌液若在室溫下放置，應在2h內使用；若保存在2～8℃，可在24h內使用。

養肝解毒丸在檢查需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數時，其組分中有抑菌成分，故需通過薄膜過濾法將抑菌成分清除，方能達到檢驗目的，因此實驗證明本研究建立的方法適用于養肝解毒丸的微生物限度檢查。另外當藥物的生產方法變更、制劑組分改變、檢查法修訂或檢驗條件發生改變時檢查方法也應該進行重新驗證。