玻璃化凍融提前解凍并優選胚胎移植對移植結局的影響

張 娟，彭 娟，朱立宇，李 輝

（株洲市中心醫院生殖中心，湖南 株洲 412000）

現如今，冷凍胚胎移植（FET）已經成為了臨床常用輔助生殖技術[1]。其不但能減少多胎妊娠以及限制新鮮周期移植胚胎數量，還能提升單次取卵周期累積妊娠概率。為受試者節省治療費用。

解凍后的胚胎移植受多方面原因影響，例如接受移植期間激素含量較高、子宮膜厚度不符合要求等等。但其中最關鍵的是胚胎是否具有發育的潛能[2]。本研究全面探討玻璃化凍融提前解凍并優選胚胎移植對移植結局的影響情況，旨意為相關學者的研究工作提供參考意見，現將具體結果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月～2017年10月我院生殖中心接收的357例行凍融胚胎移植術患者為研究對象。就不孕不育原因來看，女方原因為：排卵異常、輸卵管阻塞、子宮內膜異位癥。男方原因為少精癥、無精癥等。

1.2 方法

控制性超促排卵技術：該技術的實現依照我院內常規方案實施。結合病患自身情況，擇取不同時間段方案開展控制性超促排卵技術治療。超聲引導條件下，開展經陰道穿刺取卵子手術，完成后，開展IVF以及ICSI處理以及胚胎培養。

冷凍胚胎選擇原則：冷凍胚胎質量評分標準依照文獻[3]內的說明進行，擇取I-II級胚胎，次日細胞數量在2以上，3日后細胞數量5以上。碎片率在20.00%以下，符合上述條件的胚胎，進行冷凍處理。

胚胎冷凍和解凍方式：實驗使用美國庫克公司生產的玻璃化冷凍試劑套裝為實驗材料，對胚胎進行冷凍處理。將冷凍杯視為載體，冷凍按照庫克公司（COOK，美國）操作說明進行。

（4）囊胚培養和評估：囊胚培養在6%CO2，5%O2的三氣培養箱（COOK，美國）中進行，培養時間為 2-4 天。囊胚評級：使用文獻[4-5]提出的Gardner評分系統開展相關工作。結合囊腔擴張水平，分為6個時期，詳細為：1期：囊腔在總囊胚體積的1/2以下。2期：囊腔在總囊胚體積的1/2以上。3期：囊腔占據總囊胚體積4期：囊腔生長擴張，透明帶菲薄。5期：少部分囊胚透明帶內孵出。6期：全部囊胚孵出。

對于3-6期囊胚結合滋養層細胞質量以及細胞團開展分級，詳細為：A級：細胞排列較為緊密，基數大。B級：細胞數量不多，排列相對松散。C級：觀察可見細胞數量極少。滋養細胞分級情況為：A級：上皮細胞層結構緊密，細胞數量較多。B級：上皮細胞結構松散，細胞數量較少。C級：上皮細胞極為疏松。

選擇3CC以上囊胚開展移植以及冷凍處理，5d后，最佳囊胚評分為4AA。冷凍胚胎標準為：受精后D5達到3cc級以上的囊胚冷凍。倘若沒有取得D5標準，應當培養到6-7d后結合上述標準觀察和冷凍。將評分在3BB的胚胎確定為優質胚胎。將評分在3CC以上的囊胚記為可利用囊胚。

（5）分組：1）根據胚胎解凍的時間，分為2組：提早解凍兩管胚胎，18小時過夜后挑選發育的胚胎移植的為提前解凍培養過夜組（A1，n=194），當天解凍移植的為對照組（A2，n=163）。2）根據囊胚培養的胚胎來源分為3組：解凍后胚胎經過夜培養，挑選胚胎移植后剩余胚胎培養的為解凍剩余胚胎組（B1，n=194），新鮮周期凍存2管優質胚胎后剩余胚胎行囊胚培養的為鮮胚剩余胚胎組（B2，n=37），全部胚胎行囊胚培養的為全胚培養組（B3，n=183）。

（6）黃體和內膜準備步驟：在自然周期內，自女性月經10d起，開展檢測工作。當主導卵泡直徑達到14mm以上后,測定血清中LH值，排卵后第3d行FET。倘若主導細胞發育到16～20mm后，依舊沒有測定出LH峰，則注射5000-10000U的HCG，排卵后第3天行FET。

激素代替周期內，從女性月經第3天行陰道B超及查性激素，無異常者給予口服補佳樂，當子宮內膜厚度到8mm后，可肌肉注射40-80mg的黃體酮。在肌肉注射第4天行D3的胚胎移植。

（7）妊娠確定以及隨訪：移植術后第14天，行血清β-HCG檢測，若無妊娠，停止注射黃體酮。倘若β-HCG檢查提示妊娠，則繼續使用黃體酮。完成移植術后28天，經超聲檢查胚芽以及孕囊。確定宮內妊娠，并繼續進行黃體支持直至妊娠10～12周。

1.3 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件進行分析，計數資料采用x2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者一般情況

受試者各項基線資料，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組不孕患者基本情況比較（±s）

表1 兩組不孕患者基本情況比較（±s）

組別 總周期數 年齡（歲） 不孕年限（年） Gn用量（支） 內膜厚度（mm） 基礎FSH（mIU/ml）A1 194 30.98±4.66 3.34±3.12 33.58±10.36 9.86±2.62 8.53±1.64 A2 163 29.72±4.81 3.79±3.48 34.72±11.61 10.58±2.37 8.42±1.33

2.2 提前解凍與當日解凍移植結局比較

A1組與A2組優質胚胎率（85.2%，82.3%）無統計學差異，其臨床妊娠率分別為56.3%、42.2%，著床率分別為46.9%、29.3%，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同解凍時間FET結局比較

2.3 囊胚培養結果的比較

414例囊胚培養B1、B2和B3組比較比較，各組間成囊胚率，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 囊胚培養結果

3 討 論

和以往相比，我國近幾年醫學技術得到了迅猛發展。和既往程序冷凍技術相比，胚胎玻璃化冷凍保存技術在解凍之后，胚胎的卵裂球完整性強，胚胎復蘇率高。且這種檢查方式用時短，更為簡單。當前這種技術已經成為了首選冷凍技術。對FET造成影響的因素有很多，其中包含病患年齡、移植子宮內膜適宜性以及胚胎質量好壞等等。綜合考慮以上多種因素，凍融胚胎移植臨床妊娠主要取決于解凍后胚胎發育潛在性能力[6,7]。需要提前對胚胎進行解凍處理，過夜完成培養之后，應當跟進性觀察復蘇之后的胚胎是否能繼續生長，這一點對于評價胚胎種植來講，有著相當重要的現實意義。國外學者[8]指出，復蘇之后的卵裂球如果能夠保持繼續發育狀態，對于子宮內膜和子宮著床的同步性更加有幫助。值得說明的是，Fauzdar A等[9]等對完成復蘇之后還沒有成長的胚胎開展原位雜交，證實上述胚胎存在染色體異?，F象。其中僅有20.00%為二倍體?；诖?，建議工作人員在胚胎在完成復蘇之后，跟進性查看其生長情況。排除未能進一步生長的胚胎，留取優質樣本。本實驗中，提前解凍組挑選第二天能夠發育到桑葚胚期的胚胎移植，臨床妊娠率顯著高于當天解凍胚胎移植組。這表明通過延長培養時間，盡可能挑選出具有發育潛能的胚胎，優化所移植胚胎中好的胚胎比率可以明顯提高臨床妊娠率。

1985年，Cohen J等就首次報道了人類囊胚的冷凍[10]。隨著良好的培養體系的建立，使得囊胚移植成為可能，并且能獲得更高的著床率和妊娠率。和其他方式相比，囊胚培養移植的優點主要為：第一、就當前技術而言，單從胚胎細胞團數和形態上，還無法準確評價胚胎情況，只有到達囊胚階段，才能發現哪個胚胎個體潛能高。把卵裂期胚胎復蘇處理之后，序貫培養48～96h，對其發育潛能進行觀察，排除無優秀發育潛能以及遺傳缺陷胚胎，擇取優良胚胎移植，能全面提升凍胚復蘇后移植周期種植以及妊娠率，進而實現降低多胎妊娠。

在自然條件下，處于第一階段卵裂期胚胎應該在輸卵管內完成發育，達到囊胚期之后，才能進入到子宮腔內。對卵裂期胚胎體外培養時，能減少胚胎植入后續發育和種植時間差，囊胚期胚胎和子宮內膜中的“種植窗”相互協調，這一點符合自然生殖法則，可減少異位妊娠。

多次卵裂期凍融胚胎復蘇之后移植失敗者，可以考慮將剩下的胚胎開展囊胚培養，后進行移植。可以挑選出具有發育潛能的胚胎，改善患者臨床結局與降低醫療費用。

第四、當前，我國已經全面開放二胎政策，超過最佳生育年齡的夫婦可以將D3卵裂期胚胎進行序貫培養，直至達到單囊胚移植要求，能減少多胎妊娠風險。

雖然體外的培養環境不能完全模擬體內的環境，但能夠形成囊胚的胚胎代表了該胚胎具有更高的發育潛能。挑選出優質的胚胎移植正是本研究的目的，能顯著提高臨床妊娠率。本研究比較了解凍后移植剩余胚胎組、全胚囊胚培養組和凍存2管優質胚胎后剩余胚胎組的成囊胚率。其中全囊胚培養組最高，凍存兩管胚胎后剩余胚胎組次之，解凍剩余胚胎組最低，結果具有統計學意義。這說明解凍挑選發育到桑葚胚胚胎移植后，剩余停滯發育的胚胎可能普遍具有一定的異常，最終導致了低的成囊胚率。這說明我們提前解凍后觀察胚胎的發育情況，再從中挑選發育良好的胚胎移植可以篩選出具有發育潛能的胚胎，從而提高解凍胚胎移植整體的臨床妊娠率。同時，提前解凍胚胎移植可以避免全囊胚培養所面臨的無囊胚形成從而無胚胎移植的風險，因為體外的培養環境還不能完全代表體內胚胎的生長環境。

綜上所述，復蘇D3卵裂期胚胎，經過夜培養，有卵裂球細胞生長的胚胎能夠獲得較高的種植率及妊娠率。采用同時解凍兩管胚胎，從中挑選具有發育潛能的胚胎移植，剩余胚胎繼續行囊胚培養，可以篩選出質量較好的胚胎進行抑制，是提高凍融胚胎妊娠結局的關鍵。

[1] 林洪波,李 蓉,錢衛平.冷凍胚胎移植周期中不同內膜準備方案對助孕結局的影響[J].生殖與避孕,2014,4:457-460．

[2] 張夢苑,陳柯屹,臘曉琳.新鮮胚胎與冷凍胚胎移植在體外受精周期中療效比較的Meta分析[J].中國組織工程研究,2013,53:9245-9250．

[3] 陸小激,馮 云,張愛軍.以胚胎質量評分預測體外受精-胚胎移植妊娠結局[J].上海醫學,2006,3:169-172．

[4] 李 云,全 松.形態學低評分胚胎體外囊胚形成的相關因素及應用價值研究[J].實用婦產科雜志,2015,3:185-188．

[5] 劉艷麗,李君芳,張玉超.凍融胚胎移植周期臨床結局的影響因素[J].鄭州大學學報(醫學版),2017,4:434-438．

[6] 郝 麗,黃元華.凍融胚胎移植前子宮內膜準備的研究新進展[J].中國優生與遺傳雜志,2017,6:126-128．

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[9] Fauzdar A, Sharma RK, Kumar A, Halder A,et al.A preliminary study on chromosome aneuploidy & mosaicism in early pre-implantation human embryo by fluorescence in situ hybridization[J].Indian J Med Res.2008,128:287-293.

[10] Cohen J,Simons RF,Edwards RG,et al.Pregnancies following the frozen storage of expanding human blastocysts[J].J In Vitro Fert Embryo Transf.1985,2:59-64.