山奈酚對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制探討

張 君，程 笑，楊 歡，楊瀅霖，趙廷坤，王 奇，王月華，杜冠華

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405;3.濰坊醫(yī)學(xué)院藥理系，山東 濰坊 261053)

山奈酚對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制探討

張 君1,2，程 笑1，楊 歡1，楊瀅霖1，趙廷坤3，王 奇2，王月華1，杜冠華1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405;3.濰坊醫(yī)學(xué)院藥理系，山東 濰坊 261053)

目的 探討山奈酚(kaempferol, KAE)對慢性腦缺血大鼠的作用及其機(jī)制。方法 采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(bilateral common carotid arteries occlusion, 2VO)建立大鼠慢性腦缺血動物模型；Morris水迷宮、抓握實驗檢測大鼠行為學(xué)；尼氏染色及HE染色觀察腦組織病理改變；比色法檢測MDA含量和SOD活性；Western blot檢測腦組織DJ-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與2-VO模型組比較，KAE明顯改善慢性腦缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙和抓握能力損傷。此外，KAE明顯減輕2VO大鼠腦組織病理損傷，增高腦組織中SOD活性，提高海馬和皮層中抗氧化蛋白DJ-1的表達(dá)水平。結(jié)論 KAE明顯改善慢性腦缺血誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙、四肢平衡能力障礙及病理損傷，其機(jī)制可能與提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。

山奈酚；血管性癡呆；慢性腦缺血；慢性腦低灌注；雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎模型；學(xué)習(xí)記憶；超氧化物歧化酶；DJ-1蛋白

慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是指腦組織供血長期低于生理閾值，出現(xiàn)慢性腦缺血性神經(jīng)系統(tǒng)損傷。CCH是一種常見的病理生理狀態(tài)，是許多缺血性腦血管病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。研究表明，慢性腦組織血流供應(yīng)不足是導(dǎo)致血管性癡呆(vascular dementia, VD)及阿爾茲海默病的重要因素，而且腦血流量降低程度與老年癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)[1-2]。雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(bilateral common carotid artery occlusion, 2VO)致慢性腦低灌注大鼠模型是目前公認(rèn)度較好的慢性腦缺血模型，模型動物出現(xiàn)神經(jīng)病理性改變、腦血流量降低以及腦白質(zhì)損傷，這些改變與慢性腦血管疾病患者病理改變非常相似[3-5]。

山奈酚(kaempferol, KAE)是一種黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山奈的根莖，在其他植物中也廣泛存在。已有研究表明，KAE具有抗癌、抗糖尿病、抗腦缺血等多種藥理活性[6-7]。本研究應(yīng)用2VO大鼠模型，探討KAE對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能、運動協(xié)調(diào)能力及其神經(jīng)保護(hù)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級♂ Wistar大鼠，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號：SCXK京2012-0001)。試驗期間大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.1.2 藥物和試劑 KAE購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度98%)，應(yīng)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備混懸溶液；SOD和MDA檢測試劑盒為碧云天生物科技公司產(chǎn)品；DJ-1蛋白抗體為Abcam產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Morris水迷宮檢測儀器為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制；SpectraMax M5酶標(biāo)儀為美國MD公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)為美國Beckman公司產(chǎn)品；SDS-PAGE電泳裝置、電轉(zhuǎn)移裝置及分析系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 2VO模型制備 采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎建立大鼠慢性腦缺血損傷模型，同時設(shè)立假手術(shù)組(Sham)；術(shù)后21 d采用Morris水迷宮實驗篩選2VO模型大鼠[8-9]。

1.2.2 動物分組與給藥 將2VO模型成功大鼠隨機(jī)分為3組：2VO模型組灌胃給予溶劑對照；灌胃給予KAE 10 mg·kg-1劑量組(KAE-L)；灌胃給予KAE 30 mg·kg-1劑量組(KAE-H)；Sham組灌胃給予溶劑對照。連續(xù)給藥4周后進(jìn)行行為學(xué)測試，測試完畢處理動物進(jìn)行其他指標(biāo)的檢測。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 采用Morris水迷宮方法測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，實驗包括隱蔽平臺實驗及空間探索實驗兩部分[8]：① 隱蔽平臺實驗每只大鼠每天訓(xùn)練3次，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏期)，3次測得潛伏期均數(shù)作為1 d的成績，進(jìn)行統(tǒng)計分析;② 空間探索實驗：隱蔽平臺實驗結(jié)束后，于d 6撤去平臺。記錄每只動物第1次到達(dá)平臺位置的時間(潛伏期)，以及60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)，作為衡量其學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.2.4 抓握實驗 長約700 mm尼龍繩(直徑約1 mm)水平懸掛固定于鼠盒上方，盒內(nèi)裝上足夠多的墊料。大鼠前爪抓住繩子后，立刻松開大鼠，記錄大鼠在繩子上的維持時間并評分[1]。評分標(biāo)準(zhǔn)：動物在10 s內(nèi)從繩上掉下為0分；前爪掛在繩上為1分；試圖爬上尼龍繩為2分；前爪和至少1只后爪同時掛在繩上為3分，四肢及尾巴繞在繩上為4分；試圖逃到水平部的末端為5分。

1.2.5 病理組織形態(tài)學(xué)觀察 大腦標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋、切片，然后進(jìn)行HE染色及尼氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察皮層、海馬病理學(xué)組織形態(tài)變化[7]。

1.2.6 Western blot分析 分別提取腦組織海馬、皮層總蛋白，測定蛋白濃度，加入5×Loading buffer，100℃金屬浴10 min。每孔上樣20 μg，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳；濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；含5% BSA的TBS-T溶液37℃搖床封閉1 h；加入anti-DJ-1抗體溶液(1 ∶1 000)于4℃孵育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體溶液，37℃搖床孵育2 h；TBS-T洗膜，采用ECL法檢測蛋白條帶，GelPro31凝膠分析軟件分析條帶。

2 結(jié)果

2.1 KAE對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 在Morris水迷宮隱蔽平臺實驗中，與Sham組大鼠比較，2VO組大鼠在d 3、d 4、d 5潛伏期延長(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。與2VO組大鼠比較，KAE 30 mg·kg-1組大鼠在d 3和d 5縮短2VO大鼠潛伏期(P<0.05,P<0.05)。見Fig 1A。

在Morris水迷宮空間探索實驗中，與假手術(shù)組大鼠比較，2VO大鼠60 s內(nèi)第1次穿越平臺所在位置的潛伏期延長(P<0.01)，而且在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)降低(P<0.01)；與2VO組大鼠比較，KAE 30 mg·kg-1縮短2VO大鼠空間探索實驗中潛伏期(P<0.01)，且在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)增加(P<0.01)。見Fig 1B和Fig 1C。空間探索實驗中各組大鼠游泳速度差異無顯著性(Fig 1D)。

2.2 KAE對2VO大鼠抓握能力的影響 采用抓握實驗評價大鼠肢體肌力及協(xié)調(diào)運動能力。與Sham組大鼠比較，2VO組大鼠在繩子上維持時間較短，行為能力評分降低(P<0.01)。與2VO組大鼠比較，KAE 10 mg·kg-1及30 mg·kg-1給藥組大鼠抓握能力評分均增高(P<0.01，P<0.01)，這表明KAE對慢性腦缺血大鼠的肌力具有較好的改善作用，見圖2。

2.3 KAE對2VO誘導(dǎo)大鼠腦組織病理損傷的影響 大鼠海馬CA1區(qū)和皮層神經(jīng)元HE染色結(jié)果如Fig 3所示，Sham組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，核仁清晰，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)無紅染；而2VO模型組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞體積縮小，核不規(guī)則，核固縮深染的變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多。與2VO模型組比較，KAE各給藥組對神經(jīng)元損傷具有一定改善作用，其中KAE 30 mg·kg-1組對神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改善作用尤為明顯，細(xì)胞排列整齊，深染細(xì)胞核數(shù)目明顯減少。

大鼠海馬CA1區(qū)和皮層神經(jīng)元尼氏染色如Fig 4所示，Sham組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊、緊湊，基本沒有尼氏體破裂現(xiàn)象；而2VO模型組大鼠神經(jīng)元排列散亂，細(xì)胞帶出現(xiàn)斷裂，出現(xiàn)尼氏體碎裂現(xiàn)象的神經(jīng)元數(shù)目增多，細(xì)胞核深染數(shù)目增多。與2VO模型組比較，KAE各給藥組對神經(jīng)元損傷具有一定改善作用，其中KAE 30 mg·kg-1組對神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改善作用尤為明顯，深染細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，尼氏體較完整清晰。

A:escape latency from day 1 to day 5;B:escape latency in the probe test;C:the number of crossing platform in the probe test;D:swimming speed in the probe test.#P<0.05,##P<0.01vsSham group;*P<0.05,**P<0.01vs2VO group

##P<0.01vsSham group;**P<0.01vs2VO group

Fig 3 Effects of KAE on hippocampus and cortex lesions induced by 2-VO

Representative photographs of tissue sections stained with HE staining(200×)

Fig 4 Effects of KAE on hippocampus and cortex lesions induced by 2-VO

Representative photographs of tissue sections stained with Nissl staining(200×)

2.4 KAE對2VO大鼠腦組織MDA含量和SOD活性的影響 2VO模型組大鼠腦組織中MDA含量較Sham組有升高趨勢，KAE各給藥組腦組織中MDA含量較2VO組有降低趨勢，但各組之間差異未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 5A)。

與Sham組比較，2VO模型組大鼠腦組織中SOD活性下降(P<0.01)。與2VO模型組比較，KAE 30 mg·kg-1給藥組SOD活性升高(P<0.05)。見Fig 5B。

2.5 KAE對2VO大鼠海馬和皮層中DJ-1蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較，2-VO模型組大鼠海馬中DJ-1表達(dá)水平降低(P<0.01)；與2VO模型組比較，KAE 10 mg·kg-1及30 mg·kg-1給藥組海馬中DJ-1蛋白表達(dá)水平均增高(P<0.01，P<0.01)。見Fig 6A。

與Sham組比較，2-VO模型組大鼠皮層中DJ-1表達(dá)水平降低(P<0.05)；與2VO模型組比較，KAE 30 mg·kg-1給藥組皮層中DJ-1蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，而KAE 10 mg·kg-1給藥組皮層組織中DJ-1蛋白表達(dá)水平有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Fig 6B。

3 討論

慢性腦缺血是指各種原因誘發(fā)長期腦血流灌注不足，在血管性癡呆及阿爾茲海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用。2VO模型已成為經(jīng)典的研究慢性腦缺血疾病及評價相關(guān)治療藥物的重要動物模型。長期腦組織低灌注狀態(tài)導(dǎo)致一系列生理病理變化，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，同時也會出現(xiàn)協(xié)調(diào)運動功能障礙[10-11]。因此，本研究采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力來評價動物的認(rèn)知功能，采用抓握實驗檢測抓握能力來評價大鼠的協(xié)調(diào)運動功能。研究結(jié)果表明，2VO誘導(dǎo)慢性腦缺血模型大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能和運動功能障礙，而KAE可以明顯改善慢性腦缺血引起的認(rèn)知功能障礙和協(xié)調(diào)運動功能障礙。

Fig 5 Effect of KAE on content of MDA and

A:MDA content in brain tissue;B:the activity of SOD in brain tissue.##P<0.01vsSham group;*P<0.05vs2VO group

永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)缺血/缺氧性損害，在腦組織海馬和皮層區(qū)尤為明顯。這些部位的腦組織由于長期處于缺血性低灌注狀態(tài)，使該部位的神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性壞死，從而逐漸出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[12]。本實驗中，采用HE染色和Nissl染色觀察海馬CA1區(qū)及皮層神經(jīng)元數(shù)目和形態(tài)。結(jié)果表明，大鼠腦組織慢性低灌注后，海馬和皮層神經(jīng)元正常形態(tài)破壞，排列紊亂，細(xì)胞連接疏松，并出現(xiàn)神經(jīng)元明顯丟失的現(xiàn)象，而KAE能改善海馬和皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷和破壞。

Fig 6 Effect of KAE on DJ-1 protein expression

A:DJ-1 protein expression in hippocampus;B:DJ-1 protein expression in cortex.#P<0.05，##P<0.01vsSham group;*P<0.05，**P<0.01vs2VO group

慢性腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，刺激線粒體產(chǎn)生過多的超氧陰離子，產(chǎn)生大量氧自由基，作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，造成蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起缺血后神經(jīng)元壞死。SOD是機(jī)體內(nèi)存在的超氧自由基清除因子，它通過一系列生理反應(yīng)把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)主要成分[13]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，2VO組大鼠腦組織中MDA含量表現(xiàn)出增高趨勢，KAE給藥組較模型組腦組織中MDA含量表現(xiàn)出降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由于檢測動物數(shù)偏少，提示在后期相關(guān)研究中，需要增加檢測動物樣本數(shù)。此外，本研究結(jié)果表明2VO模型組腦組織中SOD活性明顯降低，表明慢性低灌注腦組織抗氧化能力降低，而KAE給藥組可提高2VO大鼠腦組織中SOD活性，推測KAE可能通過提高抗氧化活性發(fā)揮保護(hù)腦組織的功能。

DJ-1蛋白是一個氧化還原性敏感蛋白，與細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，最重要功能是在氧化應(yīng)激下維持線粒體復(fù)合酶I的活性，從而降低線粒體氧化應(yīng)激。已有研究表明，DJ-1蛋白是抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，可能成為中風(fēng)的重要治療靶點[14]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，2VO大鼠腦組織中線粒體功能明顯降低，降低復(fù)合酶I的活性[15]。因此，在本研究中檢測了海馬、皮層中DJ-1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2VO模型組海馬、皮層中DJ-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而KAE可以改善提高DJ-1蛋白的表達(dá)水平，其中海馬部位更為明顯，推測KAE可能通過提高機(jī)體大腦抗氧化水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，KAE可改善2VO誘導(dǎo)的慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙和協(xié)調(diào)運動功能障礙，其機(jī)制可能與其提高腦組織抗氧化能力相關(guān)，對缺血性中風(fēng)具有一定的治療潛能。

(致謝：本文實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室完成，程笑、楊歡、楊瀅霖、趙廷坤參與了本實驗工作。)

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Effects of kaempferol on learning and memory in rats with chronic cerebral ischemia and possible mechanisms

ZHANG Jun1,2, CHENG Xiao1,YANG Huan1, YANG Yin-lin1,ZHAO Ting-kun3, WANG Qi2, WANG Yue-hua1, DU Guan-hua1

(1.BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetIdentificationandDrugScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China;2.SecondClinicalMedicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China;3.DeptofPharmacology,WeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261053,China)

Aim To investigate the effects and possible mechanisms of kaemperol in the rats with chronic cerebral ischemia.Methods Chronic cerebral hypoperfusion model was produced by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries(2VO) in rats. After KAE treatment, the rats underwent Morris water maze and prehensile traction test. Neuronal morphology was observed using Nissl and HE staining. The activity of SOD and the content of MDA in brain tissue were determined. The DJ-1 protein expression was assayed by Western blot.Results Compared with 2VO model group, KAE significantly improved learning and memory and the grasping ability. In addition, KAE significantly reduced brain tissue pathological injury induced by 2VO. Furthermore, KAE significantly increased SOD activity and enhanced antioxidant protein DJ-1 expression in brain tissue.Conclusions KAE could significantly attenuate the cognitive impairment, limb balance dysfunction and pathological injury in rats with chronic cerebral ischemia. The mechanism may be related to improving the antioxidant systeminvivo.

kaempferol;vascular dementia(VD); chronic cerebral ischemia; chronic cerebral hypoperfusion(CCH); bilateral common carotid arteries occlusion(2-VO); learning and memory; superoxide dismutase(SOD); DJ-1 protein

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.016.html

2016-09-05,

2016-10-27

國家自然科學(xué)基金面上項目(No 81473383，81573645)；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 2012ZX09103101-078)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(No 2016-I2M-3007)

張 君(1990-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)；E-mail：june20101@qq.com; 王月華(1972-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物發(fā)現(xiàn)及心腦血管藥理學(xué),通訊作者,E-mail：walling@imm.ac.cn； 杜冠華(1956-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物發(fā)現(xiàn)及心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：dugh@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.008

A

1001-1978(2017)01-0039-06

R-332；R284.1；R322.81；R338.64；R743.31；R749.16