GLP-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞凋亡的保護作用研究

張 軍，谷 翔，黃問銀，張普華，殷嫦嫦 ,于 歡，張義平，王麗麗，李衛東

(1. 九江學院附屬醫院心內科, 江西 九江 332000；2. 南昌大學研究生院醫學部, 江西 南昌 330006；3. 九江學院基礎醫學院,江西 九江 332000)

GLP-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞凋亡的保護作用研究

張 軍1,2，谷 翔1，黃問銀1，張普華1，殷嫦嫦3,于 歡3，張義平3，王麗麗3，李衛東3

(1. 九江學院附屬醫院心內科, 江西 九江 332000；2. 南昌大學研究生院醫學部, 江西 南昌 330006；3. 九江學院基礎醫學院,江西 九江 332000)

目的 研究胰高血糖素樣肽素-1(glucogon like pep tide-1，GLP-1)對晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)誘導H9C2心肌細胞凋亡的保護作用機制。方法 體外培養H9C2細胞，實驗分為4組:正常對照組、100 mg·L-1AGEs試驗組、AGEs(100 mg·L-1)+GLP-1(10 nmol·L-1)組、 AGEs(100 mg·L-1)+NAC(5 mmol·L-1)組，處理24 h。通過CCK-8比色法檢測細胞存活率，相差顯微鏡觀察細胞形態，雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡攝片觀察細胞內活性氧(ROS)水平；RT-PCR法測定Bax、Bcl-2 mRNA基因的表達；運用Hoechst 33258檢測試劑盒及流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡率，Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達量。結果 與正常組相比，100 mg·L-1AGEs組降低H9C2細胞生存率，活性氧(ROS)生成量增加；與 AGEs 組相比，AGEs+GLP-1組細胞生成率提高，活性氧(ROS)生成量減少。與正常組相比，AGEs組促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2減少,細胞凋亡率升高；AGEs+GLP-1組較AGEs組下調促凋亡蛋白Bax，上調凋亡抑制蛋白Bcl-2,細胞凋亡率減少。結論 GLP-1對AGEs誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用，其保護機制與減少活性氧(ROS)有關。

胰高血糖素樣肽素-1； 糖基化終產物；活性氧； H9C2心肌細胞； 凋亡； 心肌保護；機制

大量研究表明晚期糖基化終產物(advanced glycation end proudct, AGEs)在糖尿病心肌病的發生發展過程中發揮關鍵的作用[1-2],AGEs是機體在長期高糖狀態時蛋白質和還原糖之間經過非酶性糖基化反應生成的物質；AGEs誘導心肌氧化應激，活性氧形成，進而導致細胞損傷、甚至凋亡。因此，發現抑制AGEs誘導心肌氧化應激并對其損傷性小的藥物尤為關鍵。

越來越多的研究證實,過多活性氧在心血管疾病發生發展中起到重要作用。如：動脈粥樣硬化、心力衰竭[3-4]等。另外心力衰竭、心肌病等心血管疾病的發生、發展與心肌細胞凋亡現象有關。心肌細胞凋亡是心肌缺血損傷機制中的一個重要環節,是引發心力衰竭的重要誘因; 其中活性氧 ( ROS) 介導的氧化應激在心肌細胞凋亡的病理過程中發揮了重要的作用[5-6]。

胰高血糖素樣肽-1(glucogen like peptide-1,GLP-1)是機體中一種具有“腸促胰素效應”的腸源性激素，在發揮綜合降糖作用外，GLP-1對心血管系統也有保護作用；在血管內皮細胞中GLP-1能降低RAGE表達，阻斷AGEs/RAGE軸造成的細胞損害[7-8]；同時發現GLP-1也可減少急性冠脈綜合征患者心肌梗死面積[9-10]。但 GLP-1對AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷的作用未見報道。本實驗通過建立AGEs誘導H9C2心肌細胞損傷模型，探討GLP-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞損傷性保護作用及其可能機制。為GLP-1臨床上有效治療糖尿病心血管并發癥提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 H9C2大鼠心肌細胞株由南昌大學第二附屬醫院實驗室細胞庫惠贈。AGEs (121800，Calbiochem,美國)，DMEM-F12培養基( Hyclone公司，美國), 胎牛血清(BI公司，以色列)，GLP-1(Sigma公司,美國)，Hoechst 33258試劑盒購自南京建成生物工程研究所，N-acety-L-cysteine( NAC)、活性氧檢測試劑盒、細胞計數CCK-8試劑盒均購于碧云天生物技術研究所，細胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PIKit(北京莊盟)，兔抗老鼠GAPDH(10494-1-AP，Peprotech公司產品，美國)，Bax、Bcl-2(12789-1-AP) 多克隆抗體為Peprotech公司產品，CDI-165M 三氣細胞培養箱、BIO-BEST200E凝膠成像系統(SIM公司)，TS100-F倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本), 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，冷凍高速離心機( 珠海黑馬醫學儀器有限公司)，水平電泳儀( 北京六一儀器廠)，PCR儀(BIO-RAD公司)，BDFACSCalibur流式細胞儀( BD公司，美國)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 H9C2細胞培養于含體積分數為0.15胎牛血清的DMEM-F12培養液，37 ℃、CO2體積分數0.05、飽和濕度條件下培養。細胞貼壁80%以上時,0.25%胰酶消化、計數、傳代,每3～4 d傳代1次。取接種對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞成活率 取對數生長期細胞，以2×107·L-1細胞濃度接種96孔板，各實驗組設4個復孔，另設無細胞培養液孔為空白對照。根據CCK-8試劑盒說明書,處理結束后每孔加入10μL CCK-8工作液。37 ℃培養2 h，酶標儀( El×800，BioTek，USA) 記錄 450 nm波長處的吸光度。取4孔光密度( optical density，OD) 的平均值，按下列公式計算細胞存活率:生存率/% = (OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD 空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3 細胞內ROS 水平的測定 根據實驗需要給予相應的處理：(1) 實驗對照組； (2)100 mg·L-1AGEs處理24 h； (3) 10 nmol·L-1GLP-1與100 mg·L-1AGEs處理24 h； (4) 抗氧化劑(NAC)與100 mg·L-1AGEs處理24 h。均包括3個復孔。處理完成后，用PBS漂洗6孔板2次，用10 μmol·L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育20 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，用 Image J 1.410 軟件分析4個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析。

1.2.4 Hoechst 33258核染色法檢測心肌細胞凋亡 H9C2心肌細胞經不同因素處理后,小心棄去培養基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗后，加入5 mg·L-1Hoechst 33258 試劑，室溫輕搖30 min。在熒光顯微鏡 ( BX50-FLA,Olympus,Japan)下攝片,染色質均勻分布,核被染成均勻藍色的細胞認為是正常細胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞認為是凋亡細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.2.5 RT-PCR檢測凋亡相關基因 Bax、Bcl-2 mRNA的表達 將H9C2細胞按1×106/孔接種于6孔板中，實驗分組同上，刺激細胞24h后，按RNA快速提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA,采用兩步法RT-PCR:以Olig(dT)為引物，以M-MLV反轉錄合成cDNA，0.01瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性再行 PCR擴增，PCR反應體系: cDNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL，總體積25 μL。擴增產物采用0.01瓊脂糖凝膠電泳25～30 min，凝膠成像系統照相，Image J軟件進行灰度分析。如 Table1所示

Tab 1 Primer sequences and products

1.2.6 Western blot 測定 Bax、Bcl-2 蛋白表達 收集H9C2 細胞，預冷的 PBS 洗滌3次，RIPA全細胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA 法進行蛋白定量。每孔蛋白上樣量 30 μg，在0.1聚丙烯酰胺凝膠( SDS-PAGE)中進行電泳70V，電泳15-20 min，待指示劑到濃縮膠與分離膠交界處后，改為 120V 繼續電泳，直至溴酚藍完全到凝膠底部停止電泳。置于電轉液中，在250 mA恒定電流下將蛋白轉移至 PVDF 膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，Bax、Bcl-2一抗( 1 ∶1000 稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次,ECL顯色。用ECL 檢測液發光顯影定影后，用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集H9C2 細胞，預冷的PBS洗2次,每次均需300 g,4℃離心 5 min,加入100 μL 1× Binding buffer 重懸細胞。再加入5 μL Annexin V-FITC 和 PI Staining solution,輕輕混勻。避光，室溫反應10 min。后再加入400 μL 1× Binding buffer 混勻，樣品在1 h內用流式細胞儀檢測

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 倒置相差顯微鏡觀察發現: 正常 H9C2細胞呈梭形，排列規整，大小均一,胞核、胞質境界清楚。AGEs 損傷組細胞大小不規則，胞體變圓、皺縮。胞核增大，胞質有空泡出現。AGEs+GLP-1組細胞大小較為均一，形態趨向正常，細胞皺縮變形和胞質空泡化減少。

Fig 1 Cellular morphology observation(×100)

A:Control group; B: AGEs group; C:AGEs+GLP-1 (10 nmol·L-1) group;D:AGEs+NAC (5 mmol·L-1) group

2.2 GLP-1處理提高H9C2細胞生成率 用CCK-8法測定細胞生成率，如Tab 2示：根據不同濃度預實驗結果并參考文獻[11-12],以100 mg·L-1AGEs 處理24h建立H9C2損傷模型，正常對照組,100 mg·L-1AGEs，AGEs+GLP-1 (10 nmol·L-1), AGEs+NAC(5mmol·L-1)處理24 h。結果顯示100 mg·L-1處理細胞生成率明顯降低，而AGEs+GLP-1組的細胞生成率升高。

GroupCellviability(%ofcontrol)NormalControl93．37±3．73100mg·L-1AGEs70．16±1．98##100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP?180．66±1．78?100mg·L-1AGEs+5mmol·L-1NAC79．11±2．28?

##P<0.01vscontrol group ;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group

2.3 GLP-1處理抑制AGEs誘導的ROS Fig 2顯示, 正常心肌細胞內存在少量的ROS，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細胞24 h使胞內ROS水平明顯增多,與對照組比較,差異具有統計學意義(P<0.01)。10 nmol·L-1GLP-1與100 mg·L-1AGEs共培養24 h能明顯地抑制 AGEs 誘導的ROS，使胞內ROS 明顯減少(P<0.05)。

2.4 GLP-1抑制 AGEs 誘導的心肌細胞凋亡 Fig 3顯示,與正常組比較，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細胞24h能使凋亡H9C2細胞數量明顯增多;與100 mg·L-1AGEs組損傷相比，100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1、100 mg·L-1+5 mmol·L-1NAC mg·L-1組對細胞凋亡有抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.05) 。

2.5 GLP-1抑制促凋亡Bax mRNA的表達,增加抑凋亡Bcl-2 mRNA的表達 Fig 4顯示，與正常組相比較，100 mg·L-1AGEs處理24 h，促凋亡蛋Bax含量增加;抑凋亡蛋白Bcl-2含量則減少;GLP-1處理可以抑制上述改變。與AGEs損傷組比較,GLP-1+AGEs處理組使Bax mRNA減少，Bcl-2 mRNA 增加。2.6 運用流式細胞儀檢測:GLP-1減少AGEs誘導的H9C2心肌細胞凋亡 Fig 5顯示，正常組凋亡率為3.73%，100 mg·L-1AGEs處理細胞凋亡率明顯增加,而100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1組、100 mg·L-1AGEs+5 mmol·L-1NAC組處理24 h可明顯地減少凋亡細胞的數量；與AGEs組比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。

Fig 2 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A、B：Fluorescence intensity of ROS production in H9C2 cells in different groups under inverted fluorescence microscope.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

2.7 Western blot檢測各組凋亡相關蛋白Bax,Bcl-2表達 細胞發生凋亡時，促凋亡蛋白Bax增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2減少。Western blot檢測結果如Fig 6,與對照組相比，AGEs組的Bax上調及Bcl-2下調。與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組，AGEs+NAC組的Bax表達量均下調，而抑制凋亡Bcl-2均上調。與AGEs+GLP-1組相比，AGEs+NAC組差異無統計學意義(P>0.05)。

A、B：Show that the apoptotic rate of each group H9C2 was determined by fluorescence microscope.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

3 討論

越來越多的實驗證實AGEs在糖尿病心肌病的發生發展過程中發揮關鍵的作用[2-3]，AGEs在心肌細胞代謝過程中，產生大量內源性抗氧化物質，造成心肌細胞過氧化，引發一系列的病理生理變化；AGEs 激活細胞凋亡通路，從而導致細胞凋亡。研究發現：凋亡造成心肌細胞丟失，與AGEs引起的的心肌能量代謝和心功能衰竭關系密切[13-14]。通過CCK-8活力比較,選用100 mg·L-1AGEs建立體外H9C2心肌損傷模型。AGEs對心肌細胞的損傷具有濃度依賴性，Hoechst 33258及流式細胞儀檢測其細胞凋亡率明顯增加；以上結果證明，本研究成功復制了心肌細胞體外損傷模型。

GLP-1是由腸道L細胞分泌的一種重要的腸促胰島素；具有一定的抗炎、抑制ROS產生、抗氧化、減少細胞凋亡、發揮對血管內皮細胞的保護作用[9-10,15-16]。在心肌細胞凋亡機制研究中, 目前有3條凋亡途徑:死亡受體途徑、內質網途徑和線粒體凋亡途徑[17]。其中線粒體凋亡通路是主要的途徑[18]，Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，細胞受到損傷時，大量的細胞內信號引起前凋亡蛋白Bax的活化，Bax轉位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導致細胞色素C外漏，從而激活線粒體細胞凋亡途徑[19]，形成凋亡小體。然而，此凋亡途徑可被Bcl-2等蛋白凋亡抑制因子所調控[20-21]，Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，阻止Bax 向線粒體移位，減少線粒體通透性，抑制Bax 的促凋亡作用。因此，兩者在線粒體凋亡途徑中起到重要的調節作用[22]。

Fig 4 Effect of GLP-1 on anti-apoptotic Bcl-2 and

B、C：##P<0.01vscontrol;#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsAGEsl

本研究首先檢測了Bax和Bcl-2的表達變化,研究表明GLP-1 對細胞凋亡的抑制是否與Bcl-2 的上調和 Bax 的下調有關。Western blot 實驗表明，與正常組相比，AGEs組的促凋亡蛋白Bax表達量明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達量減少;而與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組下調促凋亡蛋白Bax表達，上調抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達。本研究結果說明, GLP-1可能通過調控 Bax 和 Bcl-2 蛋白的表達而緩解氧化損傷。

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

流式細胞術檢測結果顯示, GLP-1作用后, AGEs所導致的 H9C2 細胞凋亡率減少；AGEs損傷組細胞 DCFH-DA 熒光強度水平升高，DCFH-DA 是活性氧的指示劑，細胞氧化應激時，ROS產生增加；GLP-1處理使 DCF-DA 熒光強度水平降低，說明GLP-1 可以清除活性氧，減輕心肌脂質過氧化，對抗 AGEs引起的氧化應激，減輕細胞損傷。結果說明 GLP-1可能通過調控細胞氧化還原系統, 減少 AGEs 引起的ROS 過量堆積, 進而保護心肌細胞。

綜上所述, GLP-1拮抗AGEs誘導心肌細胞氧化損傷所導致的凋亡作用, 且能通過調控凋亡相關蛋白發揮對心肌細胞保護作用。上述實驗結果對 GLP-1 抗氧化研究、防治糖尿病心血管并發癥等疾病具有重要意義。

Fig 6 Effect of GLP-1 on anti-apoptotic

B、C：Show that the protein expression of each group H9C2 was determined by Western blot.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05 ,**P<0.01vsAGEs group

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Protective effect of GLP-1 against AGEs-induced H9C2 myocardial cell apoptosis

ZHANG Jun1，2,GU Xiang1,HUANG Wen-yin1, ZHANG Pu-hua1,YING Chang-chang3, YU Huan3ZHANG Yi-ping3, WANG Li-li3, LI Wei-dong3

(1.DeptofCardiology,JiujiangUniversityHospital,JiujangJiangxi332000,China,2.DeptofMedicine,GraduateSchool,NanchangUniversity,Nanchang330006China, 3.BasicMedicalCollege,JiujiangUniversity,JiujiangJiangxi332000,China)

Aim To investigate the protective effect of Glucogon like pep tide-1(GLP-1 ) on H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced apoptosis and the potential molecular mechanisms. Methods H9C2 cardiomyocytes cells culturedinvitrowere divided into the following groups: normal control group,100 mg·L-1AGEs group,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1 group,100 mg·L-1AGEs+5 mmol·L-1N-acetylcysteine (NAC) group. Cell viabillity rate was measured by CCK-8 assay,ROS production was measured by DCFH-DA fluorescent probe;Cells in different groups were stained with Annexin V-FITC/PI and then apoptotic rate was detected by flow cytometry;Nucleus morphology was observed under fluorescence microscope after being incubated with Honchest 33258;Bax, Bcl-2 mRNA gene expression was measured using RT-PCR;Western blot was applied to assess the apoptotic components expression including Bax and Bcl-2. Result Compared with control group,cell viability rate in AGEs group was decreased in a dose-dependent manner;cell apoptosis and ROS production in H9C2 cells were remarkably increased in AGEs group. However,compared with AGEs group,GLP-1 reduced ROS production and ameliorated cell apoptosis caused by AGEs;the expression of pro-apototic proteins Bax was decreased,the expression of anti-apoptotic proteins like Bcl-2 was increased. Conclusion GLP-1 protects H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced apoptosis,which may be related to the reduction of the active oxygen (ROS).

GLP-1; AGEs; ROS; H9C2 cardiomyocytes; apoptosis; myocardial preservation; mechanism

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.042.html

2016-07-05，

2016-10-14

國家自然科學青年基金資助項目(No 81000075);江西省教育廳科技課題資助項目(No GJJ09350)

張 軍(1989-)，男，碩士生，醫師，研究方向：糖尿病心肌病發病機制，E-mail：15079265586@163.com； 谷 翔(1967-)，男，博士，主任醫師，教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病心肌病、心肌缺血/再灌注的發病機制，通訊作者，E-mail：eagle0094@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.021

A

1001-1978(2017)01-0120-07

R-332；R322.11；R329.25；R587.2；R977.6