組蛋白乙酰化調(diào)控異常與大鼠抑郁行為的關(guān)系研究

李海燕，伏簫燕，崔 婷，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室， 重慶 400016)

組蛋白乙酰化調(diào)控異常與大鼠抑郁行為的關(guān)系研究

李海燕，伏簫燕，崔 婷，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室， 重慶 400016)

目的 研究組蛋白乙酰化與慢性不可預(yù)見刺激(chronic unpredictable stress，CUS)致大鼠抑郁行為的關(guān)系。方法 30只♂ Sprague Dawley(SD)大鼠隨機分為對照組和模型組，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS方式連續(xù)刺激28 d建立大鼠抑郁癥模型；以開場實驗和強迫游泳實驗評價大鼠抑郁行為；采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠前腦皮層和海馬組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)mRNA表達；采用Western blot法檢測大鼠前腦皮層和海馬組蛋白H3(histone 3，H3)、組蛋白H4(histone 4，H4)、乙酰化組蛋白H3(actylation-histone 3，acH3)及乙酰化組蛋白H4(actylation-histone 4，acH4)蛋白表達水平。結(jié)果 與對照組大鼠相比，模型組大鼠開場實驗得分明顯降低(P<0.01)、強迫游泳實驗不動時間明顯延長(P<0.01)、前腦皮層和海馬HDAC2 mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.01)、組蛋白H3和組蛋白H4蛋白表達均無明顯差異、acH3及acH4蛋白水平均明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 CUS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為改變，其機制可能與腦內(nèi)HDAC表達增高致組蛋白乙酰化修飾水平降低有關(guān)。

抑郁癥；組蛋白乙酰化；慢性不可預(yù)見刺激； 乙酰化組蛋白H3； 乙酰化組蛋白H4； HDAC2

抑郁癥是一種常見的精神障礙類疾病，以高致殘率、致死率及反復(fù)階段性發(fā)作等為特點[1]，已躋身全球疾病負擔(dān)源的第11位[2]。抑郁癥發(fā)病機制紛繁復(fù)雜，可能涉及遺傳、心理、社會環(huán)境等多種因素，迄今仍未得到明確闡明。近年來研究顯示，基因修飾功能的表觀遺傳學(xué)改變也可能參與了抑郁癥的發(fā)生[3]。表觀遺傳學(xué)是指在遺傳物質(zhì)的DNA序列不變的情況下，通過組蛋白翻譯后修飾、非編碼的RNA調(diào)控作用、DNA啟動子甲基化修飾等調(diào)節(jié)下游目的基因表達和功能，最終影響細胞分裂、增殖并可致遺傳的一門新興學(xué)科[4]。組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學(xué)研究的重要組成部分之一，與基因活化密切相關(guān)。組蛋白乙酰化水平增高有利于降低組蛋白與DNA 之間的親和作用，使染色質(zhì)核小體結(jié)構(gòu)松散，利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合繼而促進相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，而乙酰化水平降低則發(fā)揮相反的作用[5]。其中，組蛋白H3(histone 3，H3)和組蛋白H4(histone 4，H4)氨基末端的賴氨酸殘基乙酰化修飾對轉(zhuǎn)錄尤為重要。組蛋白乙酰化修飾由組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同調(diào)控。HDAC是調(diào)控機體組蛋白乙酰化修飾水平的重要酶類，研究發(fā)現(xiàn)血清HDAC水平增高與臨床抑郁癥的發(fā)生呈正相關(guān)[6]，海馬HDAC水平增高與小鼠抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[7]。

目前研究表明，組蛋白乙酰化與去乙酰化功能的失衡，組蛋白乙酰化水平降低可能參與了抑郁癥的發(fā)生[8]，但尚缺乏系統(tǒng)研究。因此，本研究以孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見刺激(chronic unpredictable stress，CUS)構(gòu)建大鼠抑郁癥模型，通過對HDAC2、組蛋白H3、組蛋白H4、乙酰化組蛋白H3(actylation-histone 3，acH3)及乙酰化組蛋白H4(actylation-histone 4，acH4)等指標的測定，研究組蛋白乙酰化水平與大鼠抑郁行為之間的關(guān)系，探討抑郁癥發(fā)病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級♂ Sprague Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量180 g～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，醫(yī)學(xué)動物許可證號：SYXK(渝)2012-0001。本研究符合作者所在單位實驗動物倫理委員會所制定的倫理學(xué)標準。

1.2 主要試劑與儀器 NE-PER核蛋白胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(美國Thermo公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；Anti-acetyl-Histone H3 Antibody、Anti-acetyl-Histone H4 Antibody、Anti-Histone H3 Antibody、Anti-Histone H4 Antibody、Anti-HDAC2 Antibody(德國Merck Millipore公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；PCR引物、總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、染料法實時熒光定量試劑盒(寶生物工程大連有限公司)；實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Thermo低溫高速離心機Fresco 21(美國)；臺式離心機(上海市安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16C)；超低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和模型建立 ♂ SD大鼠30只，在安靜通風(fēng)、室溫(17～23) ℃、給予自由攝食和飲水的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組和模型組，每組各15只。對照組大鼠每籠5只，正常飼養(yǎng)，不予刺激。模型組大鼠每籠1只，參照本實驗室前期建模方法[9]，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS方式連續(xù)給予刺激28 d建立抑郁癥大鼠模型。給予的刺激方式包括傾斜24 h，噪音3 h，夾尾1 min，晝夜顛倒，潮濕墊料24 h，禁食+空籠24 h，電擊5 min，45℃熱水浴5 min，閃頻3 h，禁飲禁食24 h，通宵照明，水平振蕩10 min。建模過程中每天隨機給予一種刺激，同種刺激方式4 d內(nèi)不重復(fù)出現(xiàn)，使動物不可預(yù)知。

1.3.2 開場實驗(open-field test，OFT) 參照文獻[10]，使用黑色內(nèi)壁100 cm× 100 cm× 40 cm的木質(zhì)敞箱進行測定，木箱底部均分為5×5個方格。實驗在安靜昏暗的環(huán)境下進行，測試開始時將大鼠置于木箱底部中央格，觀察并記錄其5 min內(nèi)運動情況，以水平運動得分(大鼠四爪均進入底部小方格的穿越格子數(shù))、垂直運動得分(大鼠后肢直立次數(shù))、理毛次數(shù)及大小便4項得分總和作為開場實驗得分。每只大鼠測試完成后清理糞便并用酒精清潔敞箱，避免其遺留氣味對下次測試造成影響。

1.3.3 強迫游泳實驗(forced swim test， FST) 參考文獻[11]并稍加改進，強迫游泳實驗儀器為高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃缸，測試時間7 min。實驗開始時將大鼠放入玻璃缸內(nèi)，使其適應(yīng)2 min后記錄后5 min內(nèi)累計不動時間，整個實驗過程中維持水溫在25 ℃左右。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測皮層及海馬HDAC2 mRNA的表達 末次刺激24 h后，每組隨機選取大鼠4只，以質(zhì)量分數(shù)為4%的水合氯醛麻醉后，斷頭并于冰浴上分離大鼠皮層和海馬，-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒄誈eneBank 大鼠基因序列設(shè)計并合成HDAC2 和內(nèi)參β-actin 引物(由寶生物工程大連有限公司合成)。HDAC2上游：5′-GAGGTCGTAGGAATGTCGCT-3′，下游：5′-CAAGGGTTGTTGAGTTGTTCTG-3′，擴增片段 178 bp；β-actin 上游：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游：5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，擴增片段 155 bp。采用TRIzol法根據(jù)試劑盒說明書提取大鼠前腦皮層和海馬總RNA，測定RNA濃度，按照1 μg/20 μL反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR Green 熒光技術(shù)，在定量PCR儀器上按如下條件進行擴增：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)果以Ct值表示，通過2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.3.5 Western blot 法檢測皮層及海馬HDAC2、acH3、acH4、H3及H4蛋白表達 末次刺激24 h后，每組隨機取大鼠4只，以質(zhì)量分數(shù)為4%的水合氯醛麻醉后，斷頭、分離大鼠皮層和海馬并于冰上勻漿，采用NE-PER核蛋白胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA試劑盒分別進行胞質(zhì)、胞核蛋白的提取及蛋白濃度的測定。每孔上樣量30 μg，依次進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫5%脫脂牛奶封閉2 h、一抗4℃搖床孵育過夜、洗膜3次、二抗室溫下孵育1h、洗膜3次、 ECL顯色，凝膠成像儀成像后用Image Lab軟件(Bio-Rad)分析結(jié)果。以β-actin 、Lamin B為內(nèi)參分別校正HDAC2、H3、H4、acH3及acH4蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 CUS對大鼠行為的影響 開場實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠開場實驗得分較對照組大鼠明顯降低(P<0.01)，提示模型組大鼠出現(xiàn)明顯焦慮樣抑郁行為；強迫游泳實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠強迫游泳不動時間較對照組大鼠明顯延長(P<0.01)(Fig 1)，提示模型組大鼠出現(xiàn)明顯絕望樣抑郁行為。

2.2 CUS對大鼠前腦皮層和海馬HDAC2 mRNA及蛋白表達的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬HDAC2 mRNA(皮層P<0.01，海馬P<0.01)及蛋白(皮層P<0.01，海馬P<0.01)表達均明顯增加(Fig 2)。提示模型組大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)明顯HDAC2表達增高。

2.3 CUS對大鼠前腦皮層和海馬H3及acH3蛋白表達的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬H3蛋白表達差異無顯著性， acH3蛋白水平均明顯降低(皮層P<0.01，海馬P<0.01)(Fig 3)。提示模型組大鼠腦內(nèi)H3水平無明顯變化而H3乙酰化修飾水平明顯降低。

2.4 CUS對大鼠前腦皮層和海馬acH4及H4蛋白表達的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬H4蛋白表達差異均無顯著性，acH4蛋白水平均明顯降低(皮層P<0.01，海馬P<0.01)(Fig 4)。提示模型組大鼠腦內(nèi)H4表達無明顯變化而H4乙酰化修飾水平明顯降低。

**P<0.01 vs control

**P<0.01 vs control

**P<0.01 vs control

3 討論

抑郁癥是一種以絕望、快感喪失、興趣缺失為主要特征的情緒障礙類疾病[12]。隨著抑郁癥發(fā)病率和死亡率的逐年升高，對抑郁癥發(fā)病機制和治療研究已成為當(dāng)前社會關(guān)注的熱點。目前，抑郁癥的基礎(chǔ)研究通常通過抑郁癥動物模型進行，而CUS是實驗鼠抑郁模型建立的經(jīng)典方法之一[13]。OFT和FST是評價大鼠抑郁行為的有效指標，OFT通過檢測大鼠在新異環(huán)境中的探究行為反映大鼠的焦慮抑郁狀態(tài)[10]，F(xiàn)ST 中的不動時間與大鼠絕望行為密切相關(guān)[11]。為此，本課題組以CUS 誘導(dǎo)建立大鼠抑郁模型，觀察大鼠抑郁行為與腦內(nèi)組蛋白乙酰化水平之間的關(guān)系，探索抑郁癥發(fā)病的表觀遺傳學(xué)機制。研究結(jié)果顯示，CUS大鼠開場實驗運動得分較對照組明顯降低，提示CUS成功誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)焦慮樣抑郁行為；強迫游泳實驗不動時間較對照組明顯延長提示CUS成功誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)絕望樣抑郁行為。

表觀遺傳學(xué)是一門研究不涉及基因序列改變的、具有可遺傳性和可逆性的基因表達調(diào)控的新興的遺傳學(xué)分支學(xué)科，其調(diào)控方式主要有組蛋白翻譯后修飾、基因組印跡、DNA甲基化以及RNA編碼等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)調(diào)控異常參與多種精神障礙性疾病的發(fā)生，如雙相情感障礙、精神分裂癥等[14-15]。組蛋白翻譯后修飾是表觀遺傳學(xué)研究的重要組成部分，包括乙酰化、磷酸化、甲基化、糖基化、泛素化等多種形式。在真核生物細胞中， DNA鏈纏繞由組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成的八聚體構(gòu)成核小體，是染色質(zhì)的基本單位。組蛋白乙酰化修飾是研究最早的組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重塑的關(guān)鍵因素之一。乙酰化修飾的位點主要為H3、H4的N端尾部賴氨酸殘基，組蛋白乙酰化后可減弱組蛋白與DNA鏈之間的相互作用，增大空間位阻，利于DNA解螺旋并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，反之則抑制轉(zhuǎn)錄。

**P<0.01 vs control

HDAC是調(diào)控組蛋白乙酰化修飾的關(guān)鍵酶類，可通過去乙酰化反應(yīng)降低組蛋白乙酰化水平進而干擾下游目的基因表達。根據(jù)氨基酸序列的不同HDAC可分為4類：第1類包含HDAC1-3及HDAC8，第2類包含HDAC4-7、HDAC9-10，第3類是sirtuins即沉默信息調(diào)節(jié)因子及相關(guān)蛋白，第4類為HDAC11，其中 第1類和第2類在多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的表觀遺傳學(xué)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外周血細胞HDAC2表達增高與臨床重度抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[6]；慢性社交障礙可導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)乙酰化H3、H4水平降低[16]；甲基汞誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為與海馬乙酰化H3水平降低密切相關(guān)[17]；多種抗抑郁藥物可通過上調(diào)HDAC表達改善C57BL/6 小鼠抑郁樣行為[18]，均提示HDAC表達異常與臨床及動物抑郁癥發(fā)生具有相關(guān)性，但尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究結(jié)果顯示CUS 致大鼠前腦皮層和海馬HDAC2 mRNA及蛋白表達均明顯升高，總H3和H4水平無明顯改變，而acH3及acH4蛋白水平明顯降低，提示CUS誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為改變可能與腦內(nèi)HDAC2表達增高致組蛋白H3、H4乙酰化修飾水平降低，繼而導(dǎo)致下游抑郁癥相關(guān)基因表達異常密切相關(guān)。

(致謝：本實驗在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室完成，感謝實驗室各位老師和同學(xué)在實驗中提供的幫助)。

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Research on relationship between abnormal regulation of histone acetylation and depression in rats

LI Hai-yan, FU Xiao-yan, CUI Ting, JIANG Qing-song, QIU Hong-mei

(DeptofPharmacology,ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To study the role of histone acetylation and its involvement in the depression-like behaviors of rats induced by chronic unpredictable stress (CUS). Methods Thirty male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into control group and model group. The method of solitary condition with CUS for consecutive 28 days was used to establish the rat depression model. The open-field test (OFT) and the forced swimming test (FST) were used to evaluate the depressive behaviors of rats; the real time PCR was used to detect the change of HDAC2 mRNA, and Western blot was used to determine the protein expressions of H3, H4, acH3 and acH4 in the prefrontal cortex and hippocampus of rats. Results Model group showed obvious depression-like behaviors with decreasing locomotive activity in OFT (P<0.01) and increasing immobility time in FST (P<0.01), up-regulating the mRNA and protein expression of HDAC2 (P<0.01), and down-regulating the protein expression of acH3 and acH4 (P<0.01) in the prefrontal cortex and hippocampus significantly, compared with control group. Conclusion The mechanism of depressive behaviors of rats induced by CUS may be associated with down-regulating the level of histone acetylation modification.

depression; histone acetylation; CUS; acH3； acH4； HDAC2

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.020.html

2016-08-11,

2016-11-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31400881)；重慶市教委科學(xué)技術(shù)項目(No KJ1400208)

李海燕(1990-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：710120446@qq.com； 邱紅梅(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，通訊作者，Tel：023-68485161；E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.010

A

1001-1978(2017)01-0052-07

R-332；R322.81；R341.27；R741.02；R749.42；R977.6