淫羊藿總黃酮通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕自然衰老大鼠腦組織炎癥反應(yīng)

宋來新，張長城，王 婷，劉珍財，韓貴芳，袁 丁,2，趙海霞

[三峽大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥(腫瘤)管理局三級實驗室、2.仁和醫(yī)院，湖北 宜昌 443002]

淫羊藿總黃酮通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕自然衰老大鼠腦組織炎癥反應(yīng)

宋來新1，張長城1，王 婷1，劉珍財1，韓貴芳1，袁 丁1,2，趙海霞1

[三峽大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥(腫瘤)管理局三級實驗室、2.仁和醫(yī)院，湖北 宜昌 443002]

目的 探討淫羊藿總黃酮(total flavonoids ofEpimedium, TFE)對自然衰老大鼠腦組織中MAPK/NF-κB信號通路影響及其抗炎作用。方法 HE染色觀察各組大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化。Western blot法檢測各組大鼠海馬組織中衰老相關(guān)蛋白p21、凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65及其下游炎癥因子TNF-α、IL-1β和COX-2的表達，以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果 TFE可明顯改善自然衰老組大鼠海馬神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，神經(jīng)細胞排列整齊緊密。同時，TFE可明顯下調(diào)自然衰老組大鼠海馬組織中p21、Bax蛋白表達水平，上調(diào)Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax的比值，且可明顯降低NF-κB p65核蛋白及其下游炎癥因子TNF-α、IL-1β和COX-2的表達，以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白(p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK)的表達。結(jié)論 TFE對自然衰老大鼠炎癥反應(yīng)具有保護作用，其作用機制可能是通過抑制MAPK信號通路的激活，從而抑制NF-κB的核易位及其下游炎癥細胞因子表達，進而延緩腦衰老。

淫羊藿總黃酮；衰老；海馬；炎癥；p21；MAPK；NF-κB

隨著人類壽命不斷延長，我國社會老齡化程度加劇，腦衰老及相關(guān)認知功能障礙性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等患者的數(shù)量不斷增加[1]。研究顯示，隨著年齡的增長，中樞的炎癥穩(wěn)態(tài)會逐步失調(diào)而產(chǎn)生中樞炎癥反應(yīng)[2]，且中樞促炎因子會增加腦衰老相關(guān)退行性疾病的易感性[3]。因此，抑制中樞炎癥反應(yīng)，延緩腦衰老，是防治中樞神經(jīng)退行性疾病的重要措施之一。

淫羊藿為我國傳統(tǒng)的補益中藥，現(xiàn)代研究表明其對神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，并具有明顯的抗炎、抗衰老的作用，而淫羊藿總黃酮(total flavonoids ofEpimedium, TFE)為其主要有效成分[4-5]，但其延緩自然衰老大鼠腦衰老的作用機制卻少見研究。MAPK/NF-κB通路是炎癥反應(yīng)中重要的信號通路[6]。有研究顯示，激活的MAPK可通過活化NF-κB，使其轉(zhuǎn)移入核，從而調(diào)控其下游多種炎癥因子，如IL-1β、TNF-α、COX-2等的表達，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[7-8]。故本實驗通過研究TFE對自然衰老大鼠腦組織MAPK/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用，從而探討其延緩腦衰老的可能作用機制，并為進一步開發(fā)和應(yīng)用該藥提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD ♂大鼠18月齡30只，體質(zhì)量(705±20)g；3月齡10只，體質(zhì)量(220±10)g；購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001，批號：11400700003309。

1.2 藥物與試劑 TFE，購自成都仁誠生物科技有限公司，HPLC測定其含量為80%，臨用前將其用質(zhì)量分數(shù)為1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液進行超聲溶解，后配成相應(yīng)濃度的溶液。Tris-base、SDS、甘氨酸、PMSF、磷酸蛋白酶抑制劑，武漢谷歌生物有限公司；Western blot marker、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、ECL顯影液，上海碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin抗體(貨號：66009-1-lg)，美國Proteintech公司；p21抗體(貨號：ab109199)，美國Abcam公司；LaminA(貨號：sc-20680)、ERK1/2(貨號：sc-94)、p-ERK1/2(貨號：sc-7383)、TNF-α(貨號：sc-1351)、IL-1β(貨號：sc-7884)、Bax(貨號：sc-7480)抗體，美國Santa Cruz公司；NF-κB p65(貨號：#6956)、JNK(貨號：#9252)、p-JNK(貨號：#9251)、p38 MAPK(貨號：#9212)、p-p38 MAPK(貨號：#4631)、COX-2(貨號：#12282)、Bcl-2(貨號：#2876)抗體，美國Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠及兔抗山羊二抗，武漢科瑞有限公司。

1.3 儀器 PowerPacTM Basic電泳儀，美國Bio-Rad；BioshineChemiQ 4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像自動顯影儀，中國上海歐翔科學(xué)儀器有限公司；IX53顯微鏡，日本Olympus；LEICA EG 1150H石蠟包埋機、LEICA TP 1020自動脫水機、LEICA EG 1150C超薄切片機，德國Leica。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥 30只18月齡大鼠隨機分為3組，每組10只，即自然衰老組、TFE低劑量組(10 mg·kg-1)、TFE高劑量組(20 mg·kg-1)。10只3月齡大鼠為青年對照組。TFE各劑量組分別同時灌胃給予相應(yīng)濃度的TFE，青年對照組和自然衰老組大鼠均灌胃給予質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC-Na溶液。各組每天灌胃1次，每周灌胃6 d后停藥1 d，共給藥6個月。

2.2 HE染色觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化 大鼠腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為7%水合氯醛5 mL·kg-1麻醉后，進行心臟灌注，快速取出整個腦組織，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度為4 μm，HE染色，光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化。2.3 Western blot檢測大鼠海馬組織蛋白的表達 稱取約50 mg的海馬組織，盡可能將組織剪成細小碎片，加入600 μL裂解液(按RIPA裂解液 ∶PMSF ∶磷酸蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1的比例配制)提取總蛋白；按照細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒操作步驟提取核蛋白。BCA法對蛋白進行定量，加入Loading buffer后煮沸變性5～10 min，再進行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜和二抗室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image-proplus 6.0軟件對結(jié)果進行灰度掃描分析，總蛋白以β-actin為內(nèi)參，核蛋白以LaminA為內(nèi)參，計算各蛋白條帶與內(nèi)參照的灰度比值。每組實驗各重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 TFE對自然衰老大鼠行為、體質(zhì)量方面的影響 給藥前，各組大鼠均飲食正常，毛色有光澤，且活動性較好，除青年對照組(3月齡)和自然衰老組大鼠(18月齡)的體質(zhì)量比較有明顯差異外，自然衰老組與TFE用藥組比較均無明顯差異；隨著年齡增加，自然衰老組(24月齡)與青年對照組(9月齡)比較，其飲食量明顯減少，毛色暗淡，逐漸出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象，且大鼠的活動和反應(yīng)逐漸遲緩，隨用藥時間的延長，其大鼠飲食情況、毛色光澤度、精神狀態(tài)、活動情況均有明顯地改善，除自然衰老組與青年對照組的體質(zhì)量比較差異具有顯著性外，自然衰老組(24月齡)與TFE用藥組(24月齡)組比較，其體質(zhì)量無明顯變化，見Tab 1。

GroupBodyweightBeforeexperiment/gAfterexperiment/gAdult220±10490±12Aging705±20##698±25##TFE10mg·kg-1710±16709±22TFE20mg·kg-1708±16704±18

##P<0.01vsadult

3.2 TFE對自然衰老大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)的影響 HE結(jié)果顯示，青年對照組大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊緊密，形狀規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，自然衰老模型組中海馬神經(jīng)細胞排列疏松散亂，且細胞出現(xiàn)大量變性，變性的神經(jīng)細胞的細胞核固縮深染呈不規(guī)則形狀；而TFE可明顯改善和恢復(fù)海馬神經(jīng)細胞的形態(tài)，變性的神經(jīng)細胞數(shù)明顯減少，見Fig 1。

3.3 TFE對自然衰老大鼠海馬組織中p21蛋白表達水平的影響 與青年對照組相比，自然衰老組大鼠海馬組織中p21蛋白表達水平上調(diào)(P<0.01)；與自然衰老組比較，TFE可下調(diào)p21的蛋白表達水平(P<0.01)，見Fig 2。

3.4 TFE對自然衰老大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達水平的影響 與青年對照組相比，自然衰老組大鼠海馬組織中Bax蛋白的表達明顯增加，Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2/Bax比值明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；而給予TFE后，Bax蛋白的表達降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2/Bax的比值均升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見Fig 3。

3.5 TFE對自然衰老大鼠海馬組織中炎癥因子COX-2、TNF-α、IL-1β表達水平的影響 與青年對照組比較，自然衰老組海馬組織中COX-2、TNF-α、IL-1β蛋白的表達均上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；而TFE低、高劑量組均可下調(diào)COX-2、TNF-α、IL-1β的蛋白水平(P<0.05或P<0.01)，見Fig 4。

Fig 1 Morphology of hippocampal neurons in rats (HE×200) Arrows indicate the denatured neurons

Fig 2 The protein expression levels of p21 in hippocampus of rats

3.6 TFE對自然衰老大鼠海馬組織中核蛋白NF-κB p65表達水平的影響 如Fig 5所示，自然衰老組中核蛋白NF-κB p65的表達水平較青年對照組明顯上調(diào)(P<0.01)；而TFE用藥后，核蛋白NF-κB p65的蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)。

3.7 TFE對自然衰老大鼠海馬組織中MAPK信號通路蛋白的影響 與青年對照組比較，自然衰老組中p-ERK1/2、p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達水平均增加(P<0.05或P<0.01)，而總蛋白表達水平無明顯變化。給予TFE干預(yù)后，p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK的蛋白表達水平降低(P<0.05或P<0.01)，見Fig 6。

4 討論

隨著年齡的增加，機體在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能方面會出現(xiàn)一系列的退行性變化。神經(jīng)系統(tǒng)是生命機能的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，也是受衰老影響最大的系統(tǒng)[9]。本實驗以自然衰老大鼠為模型，通過觀察各組大鼠行為和體質(zhì)量等方面的變化，發(fā)現(xiàn)TFE可明顯改善自然衰老大鼠的飲食情況、毛色光澤度、精神狀態(tài)、活動情況，但對其體質(zhì)量無明顯的影響。提示，TFE可改善自然衰老大鼠的衰老狀態(tài)。通過組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFE對自然衰老組大鼠海馬神經(jīng)細胞排列散亂、疏松的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有明顯改善作用，且核固縮深染呈不規(guī)則形狀的變性神經(jīng)元明顯減少，提示TFE對自然衰老大鼠海馬神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)具有明顯保護作用。

Fig 3 The protein expression levels of Bax and Bcl-2 in hippocampus of rats

##P<0.01vsAdult;**P<0.01vsAging

p21基因是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，研究表明，p21是衰老的標志物，其表達水平與細胞衰老聯(lián)系緊密，在衰老過程中，p21表達會明顯增加[9-11]。本實驗結(jié)果顯示，自然衰老組海馬組織中p21蛋白表達水平明顯升高，而TFE用藥組可明顯降低p21蛋白表達。凋亡是機體發(fā)生衰老退化的關(guān)鍵基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，在利用高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老模型中，內(nèi)皮細胞凋亡明顯增加[12]。在調(diào)控細胞凋亡的過程中，抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax具有十分重要的作用，Bcl-2和Bax的比值決定著細胞存亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，自然衰老組海馬組織中Bcl-2/Bax的比例降低，而TFE可明顯升高Bcl-2/Bax的比例。以上結(jié)果表明，TFE具有延緩腦衰老的作用。基于此，本實驗進一步深入研究TFE延緩腦衰老的作用機制。

Fig 4 The protein expression levels of inflammatory factors COX-2, TNF-α and IL-1β in hippocampus of rats

#P<0.05,##P<0.01vsAdult;*P<0.05,**P<0.01vsAging

Fig 5 The protein expression levels of nuclear protein NF-κB p65 in hippocampus of rats

##P<0.01vsAdult;**P<0.01vsAging

中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)在腦衰老相關(guān)認知功能障礙性疾病的發(fā)展中起著很大的促進作用。TNF-α、IL-1β和COX-2均是參與炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，是早期炎癥的標志物。NF-κB是早期核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB p65為NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在炎性反應(yīng)中起中心調(diào)控作用。正常生理狀態(tài)下，NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中，當受到其他外部抗原刺激后，可被活化并轉(zhuǎn)移至細胞核中，調(diào)控下游多種炎癥相關(guān)因子表達，如TNF-α、IL-1β和COX-2等，進而參與各種炎癥反應(yīng)。MAPK信號通路在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)中發(fā)揮著重要作用，其主要包括由JNK、ERK1/2、p38 MAPK介導(dǎo)的3條途徑，該通路的激活可促進炎癥細胞因子的生成而加劇炎癥反應(yīng)[14]。此外，另有研究顯示，激活的p38 MAPK、ERK1/2、JNK均可活化NF-κB，使其發(fā)生核移位，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7-8]。本研究結(jié)果顯示，TFE可下調(diào)自然衰老組MAPK的磷酸化水平，并降低胞核NF-κB p65蛋白及其下游炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β和COX-2的表達。

Fig 6 The protein expression levels of MAPK signal in hippocampus of rats

#P<0.05,##P<0.01vsAdult;*P<0.05,**P<0.01vsAging

綜上所述，TFE對自然衰老大鼠炎癥反應(yīng)具有較好的保護作用，其機制可能是通過抑制MAPK的磷酸化，從而抑制NF-κB的核易位，下調(diào)其下游相關(guān)炎癥因子的表達水平。故推測，TFE延緩腦衰老的作用機制可能與調(diào)控MAPK/NF-κB信號通路有關(guān)。

(致謝:本實驗主要在三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實驗室和三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室完成。在此，感謝實驗室老師、本課題組的全體老師及同學(xué)對我的指導(dǎo)和幫助。)

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Total flavonoids of Epimedium attenuate aging-related inflammation in rat brain by inhibiting MAPK/NF-κB signaling pathway

SONG Lai-xin1,ZHANG Chang-cheng1,WANG Ting1,LIU Zhen-cai1,HAN Gui-fang1,YUAN Ding1,2,ZHAO Hai-xia1

(1.Third-gradePharmacologicalLaboratoryonTraditionalChineseMedicineApprovedbyStateAdiministrationofTraditionalChineseMedicine,MedicalCollegeofChinaThreeGorgesUniversity,YichangHubei443002,China; 2.RenheHospitalofChinaThreeGorgesUniversity,YichangHubei443002,China)

Aim To investigate the effect of the total flavonoids ofEpimedium(TFE) on MAPK/NF-κB signaling pathway and the inflammatory reaction in the hippocampus of natural aging male rats. Methods The morphological changes of the hippocampus composed of three areas (CA1, CA3 and DG) were observed using haematoxylin-eoin (HE) staining. The protein expression levels of senescence-associated protein p21, apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2, nuclear transcription factor-κB p65 (NF-κB p65) and its downstream inflammatory factors TNF-α, IL-1β and COX-2, and MAPK signaling pathway-relatedproteins (ERK1/2, p-ERK1/2, JNK, p-JNK, p38MAPK, p-p38MAPK) in hippocampal were detected by Western blot. Results Compared with natural aging group, TFE obviously improved the morphology and structure of hippocampal neurons, and the nerve cells arranged neatly and closely. Furthermore, TFE significantly downregulated the protein expression levels of p21 and Bax, upregulated the protein expression levels of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax, and reduced the expression of NF-κB p65 and of its downstream inflammatory factors TNF-α, IL-1β, COX-2, and MAPK signaling pathway-related proteins (p-ERK1/2, p-JNK and p-p38 MAPK) in hippocampus of natural aging rats. Conclusions TFE effectively protects against inflammatory reaction in brain aging of SD male rats. The mechanism is related with inhibition of NF-κB nuclear translocation and reduction of its downstream inflammatory cytokines expression by inhibiting MAPK signaling pathway activation.

total flavonoids ofEpimedium; aging; hippocampus; inflammation; p21; MAPK; NF-κB

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.030.html

2016-08-11,

2016-11-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81373881，81374001，81503334)；三峽大學(xué)人才科研啟動基金項目(No KJ2014B067)

宋來新(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：songlaixin0925@163.com； 趙海霞(1986-)，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: zhaohaixia.mm@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.015

A

1001-1978(2017)01-0084-07

R-332；R284.1；R322.81；R339.38；R345.57；R364.5；R392.12