Cav1.2鈣離子通道三維結構的同源建模及其應用

雷 明, 蘇敬陽, 李 卓, 晏 珊, 孫雪菲, 朱 彤, 郝麗英

(1.中國醫科大學藥學院藥物毒理教研室，遼寧 沈陽 110122；2. 東北大學環境生物學教研室，遼寧 沈陽 110004)

Cav1.2鈣離子通道三維結構的同源建模及其應用

雷 明1, 蘇敬陽1, 李 卓1, 晏 珊1, 孫雪菲1, 朱 彤2, 郝麗英1

(1.中國醫科大學藥學院藥物毒理教研室，遼寧 沈陽 110122；2. 東北大學環境生物學教研室，遼寧 沈陽 110004)

目的 構建心肌Cav1.2鈣離子通道三維結構模型，檢驗模型的準確性與可靠性。方法 利用SWISS-MODEL同源建模服務器，對豚鼠心肌細胞Cav1.2通道α1亞基進行同源建模，建模結果提交至加州大學蛋白質結構在線檢測服務器進行檢測評估，并對結構模型進行打分。利用MOE軟件分子對接程序模擬阻斷劑或藥物與Cav1.2通道模型的結合，進一步驗證通道模型的準確性與可靠性。結果 在SWISS-MODEL服務器上搜尋到的模板序列Cav1.1 α1S與目標序列Cav1.2 α1C均為L型鈣通道，序列比對結果顯示其同源性高達71.5%，選擇自動模式(automated mode)進行同源建模。L型鈣通道阻斷劑維拉帕米、硝苯地平、地爾硫卓能結合到Cav1.2通道三維結構模型的特定區域，而鈉通道特異性阻斷劑河豚毒素并未與該模型相結合，中藥有效成份白花前胡甲素和小檗堿與該模型也有一定的結合。結論 成功構建了心肌Cav1.2鈣離子通道三維結構模型，為后續研究提供了可靠樣本，也為同源建模在研究離子通道三維結構預測中的應用奠定了基礎。

離子通道；三維結構；同源建模；MOE軟件；L型鈣通道阻斷劑；分子對接

蛋白質是生命活動的主要承擔者，一切生命活動都與蛋白質密切相關，蛋白質的生物學功能很大程度上取決于蛋白質的分子結構?；蚪M數據測序的巨大進步，使我們目前已經知道的蛋白質序列以數百萬計，但實驗所解析的蛋白質結構數目相對很小。盡管解析蛋白質結構的技術已經取得了非常重大的進展，但解析蛋白質結構依然是一個勞動密集型和花費昂貴的過程，蛋白質空間結構的測定速度還遠遠趕不上蛋白質序列增長的速度，并且隨著基因組測序的進行，兩者差距有越來越大的趨勢。因此，用計算機進行蛋白質結構和動力學的理論預測成了目前了解蛋白質結構信息的一種有效手段，可了解藥物的作用、代謝和信號轉導通路在活細胞中的分子基礎，進而可在生命科學和材料科學領域設計新的技術[1-3]。目前，蛋白質空間結構預測的方法有3種，即從頭預測法(ab initio prediction)、同源建模法(homology modeling)和折疊識別法(fold recognition)。其中同源建模法也稱為比較建模法(comparative modeling)，是基于知識的蛋白質結構預測方法，是目前蛋白質結構預測方法中最簡單、最為成熟的方法[4-5]。根據對PDB數據庫中的蛋白質結構比較研究得知，任何一對蛋白質，只要序列長度達到一定程度，序列相似性超過30%，則具有相似的三維結構。因此，對于一個未知結構的蛋白質，如果能找到一個已知結構的同源蛋白質，就能以該蛋白質的結構為模板，為未知結構的蛋白質建立三維結構模型。同源建模通常包括下列主要步驟：模板搜尋、序列對比、結構保守區尋找、目標模型構建、結果優化評估等。

L-型鈣通道(L-type Ca2+channel，LTCC) 是電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent Ca2+channel，VDCC)中的一種[6]，也稱為二氫吡啶受體，是研究最為廣泛的高電壓依賴型鈣通道，存在于大多數可興奮細胞膜上，如骨骼肌、心臟、腦、內分泌細胞、神經元及其他組織，其中Cav1.1主要表達于骨骼肌中，Cav1.2主要表達于心肌和平滑肌中。在心肌細胞中，Cav1.2鈣通道介導的鈣離子內流觸發肌漿網鈣釋放通道ryanodine受體(RYR)開放，肌漿網存儲的鈣離子大量釋放，這種級聯效應稱為“鈣致鈣釋放”(Ca-induced Ca2+release，CICR)，在心臟的興奮收縮偶聯(excitation-contraction couple，EC)中起著關鍵性作用[7]。L型鈣通道是由α1、β、α2/δ、γ等多個亞基組成的高分子跨膜蛋白復合物，分子量約400kD。其中α1是主要亞基，負責運輸鈣離子，分子量約170～140 ku，由4個同源結構域組成(Ⅰ～Ⅳ)，每個結構域包含6個跨膜片斷(S1～S6)，位于S4上的帶正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基具有電壓感受器的作用，膜電位的變化可以引起氨基酸殘基位置的改變，控制通道的開放或關閉。S5和S6之間的P環構成通道的核心，決定通道對鈣離子的選擇性[8]。其他亞基不參與鈣離子運輸，但對通道的電壓感受、電生理特征以及細胞定位等有重要的調控作用，因此也被稱為輔助性亞基。

蛋白質的三維結構是其發揮功能的基礎，目前對L型鈣通道一級結構即氨基酸序列的研究已較為完善，但對其三維結構的研究結果還不多。對蛋白質三維結構研究的實驗方法主要有兩種，X射線晶體學(X-ray crystallography，XRC)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,，NMR)，由于高純度L型鈣通道蛋白的制備和結晶較為困難，所以很難得到完整的通道蛋白三維結構。最近，清華大學醫學院顏寧教授研究組利用高分辨率冷凍的電子顯微鏡，獲得了完整的Cav1.1通道的三維結構[9]。我們以此結構為模板，采用同源建模的方法構建了Cav1.2通道的三維模型，并用于相關離子通道藥物作用的研究。

1 材料與方法

1.1 Cav1.2通道的同源建模 利用SWISS-MODEL同源建模服務器(http://swissmodel.expasy.org)對豚鼠心肌細胞Cav1.2通道α1亞基(NP_001166394.1)進行同源建模，具體方法步驟如下：輸入目標序列，搜尋合適模板；L型鈣通道三維結構研究的實驗結果較少，只找到一個合適的模板(PDB:3jbr)，與目標序列同源性較高，可以使用自動模式(Automated Mode)進行建模。

1.2 建模結果評估 利用加州大學蛋白質結構在線檢測服務器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS，http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)進行建模結果評估，該服務器提供多種蛋白質結構檢測工具，并對結構模型進行打分。

1.3 模擬阻斷劑或藥物與通道模型的結合 利用MOE軟件(Molecular Operating Environment)分子對接程序模擬阻斷劑或藥物與Cav1.2通道模型的結合，進一步驗證通道模型的準確性與合理性，實驗選用的藥物包括L型鈣通道阻斷劑維拉帕米、硝苯地平、地爾硫卓，鈉通道特異性劑河豚毒素，以及作用于鈣通道的中藥有效成分白花前胡甲素和小檗堿。

2 結果

2.1 Cav1.2通道三維結構模型 L型鈣通道三維結構研究的實驗結果較少，在SWISS-MODEL同源建模服務器只找到一個合適的模板(PDB:3jbr)，該結構為L型鈣通道α1S亞基(Cav1.1 α1S)，與目標序列(Cav1.2 α1C)同源性高達71.5%，序列對比如Fig 1所示。

采用SWISS-MODEL同源建模服務器自動模式進行目標序列(Cav1.2 α1C)建模，Fig 2所示為鈣通道三維結構示意圖，其中A為Cav1.1 α1S(PDB:3jbr)，B為利用SWISS-MODEL同源模擬得到的Cav1.2 α1C。由于實驗條件的原因，該結構中只含跨膜蛋白片斷，不含膜兩側的N末端、C不端以及部分LOOP區域。

2.2 Cav1.2通道三維結構模型的檢測評估 將同源建模得到的三維結構模型提交到加州大學蛋白質結構在線檢測服務器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS，http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)進行建模結果檢測，根據打分結果(overall quality factor)進行評估。Overall quality factor值越高越好，一般高解析度的晶體結構該值可以達到95，而對于解析度一般的來說該值只能到91左右。本實驗中同源建模得到的三維結構模型Cav1.2 α1C Overall quality factor值為61.749，相對較低，這與模板蛋白的晶體結構解析度有關，將模板蛋白結構((Cav1.1 α1S，PDB:3jbr)提交到服務器進行檢測，該值為66.801。Overall quality factor值還可能與蛋白質的大小有關，本實驗中鈣通道蛋白的三維結構模型相對較大，有1 000多個氨基酸，在另一實驗中我們用相同的方法對只有100多個氨基酸的鈣調蛋白(calmodulin，CaM)進行同源建模，將得到的三維結構模型提交至該服務器檢測，Overall quality factor值高達97.778。

Fig 1 Alignment of target sequence and template sequence

Fig 2 3D structure L-type Ca2+ channel

A:Structure of Cav1.1 α1S(from PDB:3jbr)；B:Structure of Cav1.2 α1C(homology modeling with SWISS-MODEL server)

2.3 阻斷劑或藥物與通道模型的結合 Fig 3所示為L型鈣通道阻斷劑與Cav1.2通道三維結構模型的結合，其中A、B、C分別為維拉帕米、硝苯地平、地爾硫卓與Cav1.2通道結合的三維結構模擬圖，D、E、F分別為維拉帕米、硝苯地平、地爾硫卓與Cav1.2通道結合的二維平面示意圖。從Fig 3A、3D中可以看出，維拉帕米與Cav1.2通道結合起主要作用的氨基酸主要包括Gln1215、Arg1376、Thr1377、Trp1380、Ala1637、Glu1641，大多位于Cav1.2通道第四結構域。從Fig 3B、3E中可以看出，硝苯地平與Cav1.2通道結合起主要作用的氨基酸主要包括Lys369、His370、Glu710、Met711、Met746，大多位于Cav1.2通道第二結構域。從Fig 3C、3F中可以看出，地爾硫卓與Cav1.2通道結合起主要作用的氨基酸主要包括Val1245、Glu1251、Lys1298、Asn1313、Lys1367、Arg1371，全部位于Cav1.2通道第四結構域。由此可見，這幾種L型鈣通道阻斷劑都能結合到Cav1.2通道三維結構模型的特定區域，以鈉通道特異性阻斷劑河豚毒素作為陰性對照，并未發現其與該模型有結合，與Cav1.2通道特性一致，證明該模型準確可靠。

Fig 3 Binding of L-type Ca2+ channel blocker to 3D structure model of Cav1.2 channel

A～C,3D structure of L-type Ca2+channel blocker binding to Cav1.2 channel, pink compound represent Verapamil, Nifedipine and Diltiazem, respectively；D～F, Schematic diagram of L-type Ca2+channel blocker interact with specific amino acids

早期研究發現中藥有效成份白花前胡甲素和小檗堿對對豚鼠心肌細胞鈣電流有影響[10-11]，于是我們將這兩種化合物與Cav1.2通道三維結構模型模擬結合，如Fig 4A、C所示，白花前胡甲素與Cav1.2通道結合起主要作用的氨基酸主要包括Lys1234、Asn1246、Glu1251、Trp1312、Ser1370、Arg1371、Trp1530、Glu1536、Val1644，大多位于Cav1.2通道第四結構域。如Fig 4B、D所示，小檗堿與Cav1.2通道結合起主要作用的氨基酸主要包括Glu1251、Lys1367、Ser1370、Arg1371、Trp1530、Asp1534、Val1644，大多位于Cav1.2通道第四結構域。由此說明，白花前胡甲素和小檗堿都與Cav1.2通道有一定的結合，然后發揮其藥理作用。

Fig 4 Binding of active ingredient of traditional Chinese drug to 3D structure model of Cav1.2 channel

A～B:3D structure of active ingredient of traditional Chinese drug binding to Cav1.2 channel, green compound represent Praeruptorin A and Berberine, respectively；C～D:Schematic diagram of active ingredient of traditional Chinese drug interact with specific amino acids

3 討論

蛋白質同源建模技術逐漸成為一個較為常規的蛋白質結構分析方法，目前互聯網上提供了很多利用同源建模技術預測蛋白質結構的服務器，比如SDSC1(San Diego)、3D-JIGSAW(London)、FAMS(Tokyo)和SWISS-MODEL(Geneva)。其中SWISS-MODEL是瑞士日內瓦生物醫學研究所(The Geneva Biomedical Research Institute )于1993年建立發展起來的分子建模服務系統(Molecular Modeling Server)，采用一系列工作軟件，從經典的布魯克海文蛋白質結構數據庫(Brookhaven PDB)中提取蛋白質查詢序列的模擬結構信息，用具有蛋白質相似性的已知結構蛋白建立的未知結構蛋白的分子模型，是迄今為止應用最廣泛的免費服務之一[12-13]。本實驗在SWISS-MODEL服務器上搜尋到的模板序列Cav1.1 α1S與目標序列Cav1.2 α1C均為L型鈣通道，序列比對結果顯示其同源性高達71.5%，完全適用于Cav1.2鈣離子通道三維結構的同源建模。將同源建模得到的三維結構模型提交到加州大學蛋白質結構在線檢測服務器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS)進行建模結果檢測，雖然打分結果(Overall quality factor)分值較低，但這主要是由于模板蛋白的結構以及氨基酸數目較大，并不影響Cav1.2離子通道三維結構模型的準確性和可靠性。

維拉帕米、硝苯地平、地爾硫卓都是經典的L型鈣通道阻斷劑，而鈉通道特異性劑河豚毒素并不作用于L型鈣通道，分子對接結果顯示這幾種L型鈣通道阻斷劑都能結合到Cav1.2通道三維結構模型的特定區域，而鈉通道特異性阻斷劑河豚毒素并未與該模型有結合，與Cav1.2通道特性一致，證明該模型準確可靠。同時，中藥有效成份白花前胡甲素和小檗堿與Cav1.2通道三維結構模型也有一定的結合，進一步證明該模型準確性和可靠性。除鈣通道外，其他離子通道如鈉離子通道、鉀離子通道、瞬時感受器電位離子通道也在各種生理病理過程發揮著重要作用[14-16]，運用同源建模的方法同樣有助于進一步研究其作用機制。

總之，本實驗從Cav1.2鈣離子通道蛋白質氨基酸序列出發，以Cav1.1鈣離子通道三維結構為模板，通過同源建模的方法得到了該離子通道的空間結構，同時對所構建的結構模型合理性進行了評估與分析，所得到的結構為后續研究提供了可靠樣本，也為同源建模在研究離子通道三維結構預測的應用奠定了基礎。

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Homology modeling and application of 3D structure of Cav1.2 channel

LEI Ming1, SU Jing-yang1, LI Zhuo1, YAN Shan1, SUN Xue-fei1, ZHU Tong2, HAO Li-ying1

(1.DeptofPharmaceuticalToxicology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China; 2.LabofEnvironmentBiologyandEngineering,NortheasternUniversity,Shenyang110004,China)

Aim To construct 3D structure model of cardiac Cav1.2 channel and check its accuracy and reliability.Methods Homology model of Cav1.2 channel α1 subunit was constructed using SWISS-MODEL server. The model was submitted to an online testing server built by University of California and scored by it. The binding of Cav1.2 channel with blocker or drug was simulated by MOE software molecular docking program to check the model′s accuracy and reliability.Results Both the target sequence Cav1.2 α1C and the template sequence Cav1.1 α1S searched by SWISS-MODEL server belonged to L-type Ca2+channel. Since the homology was 71.5% revealed by sequence alignment, homology modeling was performed using automated mode. L-type Ca2+channel blockers Verapamil, Nifedipine and Diltiazem could bind to the 3D structure model of Cav1.2 channel, while sodium channel blocker TTX could not. Furthermore, active ingredient of traditional Chinese drug Praeruptorin A and Berberine could also bind to the 3D structure model of Cav1.2 channel.Conclusion The 3D structure model of Cav1.2 channel was constructed successfully, which provides reliable materials for further studies and establishes the foundation for the application of homology modeling in the study of 3D structure prediction of ion channels.

ion channels；3D structure；homology modeling；MOE software；L-type calcium channel blocker；molecular docking

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.032.html

2016-08-22，

2016-11-29

國家自然科學基金資助項目(No 31471091)

雷 明(1984-)，男，博士生，研究方向：離子通道藥理學，E-mail:leimingcqu@163.com; 郝麗英(1965-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學與離子通道藥理學，通訊作者，E-mail:lyhao@mail.cmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.016

A

1001-1978(2016)01-0090-05

R322.11；R329.25；R341；R348.1；R977.6