鬼臼毒素衍生物L(fēng)N-13誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞K562/A02凋亡及其機制

高晨光,張 猜,趙安妮,李 楠,陳 虹,曹 波

(武警后勤學(xué)院 1.研究生管理大隊, 2.學(xué)員二旅,天津 300309; 3.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院, 遼寧 錦州 121000)

鬼臼毒素衍生物L(fēng)N-13誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞K562/A02凋亡及其機制

高晨光1,張 猜2,趙安妮3,李 楠1,陳 虹1,曹 波1

(武警后勤學(xué)院 1.研究生管理大隊, 2.學(xué)員二旅,天津 300309; 3.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院, 遼寧 錦州 121000)

目的 研究新型鬼臼毒素衍生物L(fēng)N-13對多藥耐藥腫瘤細(xì)胞株K562/A02產(chǎn)生的凋亡作用及潛在機制。方法 MTT法測定LN-13和陽性對照藥VP-16抑制K562/A02細(xì)胞48 h后的生長情況及其IC50值，Hoechst 33342、PI雙染色觀察LN-13作用K562/A02細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)測定LN-13作用K562/A02細(xì)胞48 h的凋亡情況，RT-PCR檢測LN-13作用K562/A02細(xì)胞后Bcl-2、Bax、Caspase-3、mdr-1基因表達的影響，Western blot檢測LN-13作用K562/A02細(xì)胞后P-gp的表達情況。結(jié)果 LN-13對K562/A02細(xì)胞生長有顯著地抑制，IC50值3.32 μmol·L-1，Hoechst 33342、PI雙染色觀察到LN-13作用后，K562/A02細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測LN-13(2、4、8 μmol·L-1)作用K562/A02 細(xì)胞48 h后，出現(xiàn)劑量遞增趨勢的凋亡比例，分別達到15.0%、48.0%、68.96%。另外，隨著LN-13劑量增加，K562/A02細(xì)胞的Bax、Caspase-3基因表達增加，mdr-1基因表達減少，另外也下調(diào)了P-gp表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 LN-13可誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞K562/A02 產(chǎn)生凋亡作用，其機制可能是通過抑制P-gp蛋白表達及凋亡相關(guān)基因表達。

K562細(xì)胞；K562/A02細(xì)胞；新型鬼臼毒素衍生物L(fēng)N-13；凋亡；P糖蛋白；多藥耐藥；凋亡相關(guān)基因

對于腫瘤的化療，目前臨床已經(jīng)有了很大的突破和進展。但仍存在許多嚴(yán)重技術(shù)難題及缺陷：毒副作用大、腫瘤多藥耐藥等大大阻礙了對腫瘤化療的進展，其中如何克服腫瘤的多藥耐藥是影響化療藥物發(fā)展的難點。被稱為經(jīng)典耐藥機制的由P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥是目前研究的一個熱點。鬼臼毒素是提取自鬼臼屬的盾葉鬼臼等一些近緣植物中的一種木質(zhì)素天然產(chǎn)物[1]。鬼臼毒素本身就具有較好抗腫瘤活性，鬼臼毒素半合成衍生物如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(ZM-26)自進入臨床就是治療相關(guān)癌癥的首選藥物[2]。目前由于鬼臼毒素及其現(xiàn)有衍生物(VP-16，VM-26)出現(xiàn)獲得性耐藥以及胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制等嚴(yán)重阻礙了其治療應(yīng)用[3]。因而，開發(fā)新型鬼臼毒素衍生物以克服其存在的治療缺陷尤為重要，本課題組在鬼臼毒素母核的基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)改造，合成了大量衍生物，經(jīng)前期篩選得到藥效較好的新型鬼臼毒素衍生物L(fēng)N-13，以依托泊苷(VP-16)為陽性對照藥，選取人紅白血病細(xì)胞的多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02為研究對象進行相關(guān)探究。

1 材料與方法

1.1 材料 LN-13為鬼臼毒素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后獲得的化合物，由武警后勤學(xué)院生藥學(xué)教研室提供，分子量為693.05,白色粉末，純度大于95%。依托泊苷(Etoposide，VP-16)分子量為588.56(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，純度97%)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人紅白血病細(xì)胞K562、多藥耐藥株K562/A02培養(yǎng)于10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。置37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測定LN-13對K562及K562/A02細(xì)胞的增殖影響[4-5]待K562及K562/A02細(xì)胞增殖至對數(shù)生長期，吹懸計數(shù)后均勻接種于96孔培養(yǎng)板(4 000個細(xì)胞/孔)，接種培養(yǎng)24 h后實驗組、陽性對照組分別加入不同濃度(10-8mol·L-1～10-5mol·L-1)的LN-13及VP-16，每個濃度設(shè)置5個平行復(fù)孔。陰性對照組加等量培養(yǎng)基，48 h后，加入5 g·L-1MTT溶液繼續(xù)作用4 h，DMSO充分溶解后，測定490 nm處吸光度值及計算得出IC50值。

1.2.3 Hoechst 33342、PI雙染色觀察K562/A02細(xì)胞形態(tài) 收集不同濃度LN-13(2、4、8 μmol·L-1)及VP-16(4 μmol·L-1)作用48 h后K562/A02細(xì)胞，用PBS洗2次后，離心棄上清，加入終濃度10 mg·L-1的Hoechst 33342染液適量，避光染色10 min，然后加入終濃度10 mg·L-1PI染液適量，避光染色5 min，離心后棄去染液，涂片后在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測K562A/02細(xì)胞凋亡率 取處于對數(shù)生長期的K562A/02細(xì)胞，均勻接種于6孔板(每孔不少于3×105個細(xì)胞)中，培養(yǎng)24 h后，給藥處理：LN-13(2、4、8 μmol·L-1)及VP-16(4 μmol·L-1)作用48 h，小心收集全部細(xì)胞，清洗兩次后離心棄上清，依次加入FITC標(biāo)記的Annexin V(終濃度為0.05 mg·L-1)和PI(終濃度為50 ug·mL-1)，避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡情況。

1.2.5 RT-PCR 檢測LN-13對Bcl-2、Bax、caspase-3和mdr-1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[5-6]待K562和K562A/02細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，吹懸后均勻接種于6孔板(3×106個細(xì)胞/孔)中，置37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h；給藥處理：LN-13(2、4、8 μmol·L-1)及VP-16(4 μmol·L-1)作用K562A/02細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞用TRIzol法提取總RNA，測定RNA純度并定量進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加特異性上、下游引物及相關(guān)酶以一定體系進行PCR擴增，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。引物序列如下：β-actin：Forward: 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′ Reverse:5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′

mdr-1：5′-Forward: CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′ Reverse:5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′

Bax：Forward:5′-CGTCCACCAAGAAGCTGAGCG-3′ Reverse:5′-AGCACTCCCGCCACAAAGATG-3′

Bcl-2：Forward:5′-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3′ Reverse:5′-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′

caspase-3：5′-Forward: GTGGAATTGATGCGTGATG-3′

Reverse: 5′-GGAATCTGTTTCTTTGCATG-3′1.2.6 Western blot法檢測LN-13對P-gp表達的影響[6]待K562和K562A/02細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，吹懸后均勻接種于6孔板(3×106個細(xì)胞/孔)中，置37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h；給藥處理：LN-13(2、4、8 μmol·L-1)及VP-16(4 μmol·L-1)作用K562A/02細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞提取蛋白，BCA法定量后進行蛋白上樣，采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Chmidoxr 化學(xué)發(fā)光成像檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定LN-13對K562及K562/A02細(xì)胞的生長活性影響 MTT結(jié)果顯示LN-13在10-8～10-5μmol·L-1的藥物濃度范圍對K562、K562/A02細(xì)胞增殖均有良好的抑制效果，IC50值分別為1.48 μmol·L-1和3.32 μmol·L-1，陽性藥物VP-16對K562、K562/A02的IC50值分別為3.45 μmol·L-1和34.7 μmol·L-1，顯示LN-13對細(xì)胞增殖抑制效果明顯優(yōu)于陽性藥物VP-16，并具有明顯的抗耐藥性，耐藥倍值僅有為2.24，明顯低于VP-16的10.06倍。見Tab 1。

DrugIC50/μmol·L-1K562K562A/02DrugresistancefoldLN?131．48±0．213．32±0．342．24VP?163．45±0．3434．7±1．2110．06

2.2 Hoechst 33342、PI雙染色觀察LN-13作用下細(xì)胞的凋亡形態(tài) 經(jīng)Hoechst 33342染色后正常及早期凋亡細(xì)胞呈強藍色熒光，PI染色后晚期凋亡及壞死細(xì)胞呈紅色。雙染色結(jié)果顯示藥物作用后細(xì)胞明顯出現(xiàn)凋亡形態(tài)，陰性對照組細(xì)胞呈規(guī)則圓形，無明顯凋亡及壞死細(xì)胞，隨著LN-13藥物濃度的增加，細(xì)胞開始出現(xiàn)不規(guī)則橢圓形，細(xì)胞發(fā)生皺縮、破裂，產(chǎn)生凋亡小體，且晚期凋亡及壞死細(xì)胞逐漸增加，見Fig 2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測LN-13誘導(dǎo)K562 /A02細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度的LN-13(2、4、8 μmol·L-1)作用K562/A02細(xì)胞48 h后，出現(xiàn)明顯的劑量依賴性凋亡趨勢，隨LN-13劑量增加，細(xì)胞凋亡比例(早期凋亡Q2+晚期凋亡Q3)分別為15.0%、48.0%、68.96%，陽性對照藥組(4 μmol·L-1)的凋亡比例11.74%。見Fig 2, Tab 2。

Tab 2 Flow cytometry detected K562A/02 cell apoptosis ratio induced by LN-13

GroupProportionofapoptosis/%NormalQ1EarlystageapoptosisQ2LatestageapoptosisQ3NecroticcellQ4A94．11．803．150．91B87．94．527．220．377C78．57．617．396．49D48．937．210．83．15E21．62．3666．69．36

A:Control;B:4 μmol·L-1VP-16;C:2 μmol·L-1LN-13;D:4 μmol·L-1LN-13;E:8 μmol·L-1LN-13

2.4 LN-13對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3、mdr1表達的影響 不同濃度的LN-13(2、4、8 μmol·L-1)作用K562/A02細(xì)胞48 h，與K562/A02對照組(B)相比，隨著LN-13濃度升高，促凋亡相關(guān)基因Bax、caspase-3的mRNA表達量逐漸上調(diào)，并呈現(xiàn)量效趨勢(P<0.05)，見Fig 3。而抑制凋亡基因Bcl-2基因的表達未見明顯改變。與K562組(A)相比，K562/A02細(xì)胞中多藥耐藥基因mdr1明顯上調(diào)，隨著LN-13劑量增加，mdr1明顯被下調(diào)。提示LN-13對耐藥株K562/A02的抗藥性與多藥耐藥基因mdr1相關(guān)。見Tab 3。

2.5 LN-13對P糖蛋白表達的影響 與K562細(xì)胞組(A)比較，多藥耐藥K562/A02 細(xì)胞中P-gp明顯高表達，不同濃度的LN-13(2、4、8 μmol·L-1)作用K562/A02細(xì)胞48 h后，與K562/A02對照組(B)相比，隨著LN-13濃度升高，P-gp表達量逐漸下調(diào)，并呈現(xiàn)量效趨勢(P<0.05)。見Fig 4,Tab 4。

Fig 1 Morphological changes of apoptosis of K562A/02 cell induced by LN-13 observed through Hoechst 33342 and PI staining observation

A:Control;B:4 μmol·L-1VP-16;C:2 μmol·L-1LN-13;D:4 μmol·L-1LN-13;E:8 μmol·L-1LN-13

Fig 2 Flow cytometry detected K562A/02 cell apoptosis ratio induced by LN-13

A:Control;B:4 μmol·L-1VP-16;C:2 μmol·L-1LN-13;D:4 μmol·L-1LN-13;E:8 μmol·L-1LN-13

GroupRatioofIODMdr?1/β?actinBax/β?actinBcl?2/β?actincaspase?3/β?actinA0．45±0．010．86±0．010．81±0．020．41±0．02B0．81±0．05#0．51±0．06#0．78±0．040．52±0．04#C0．61±0．05?0．71±0．02?0．77±0．030．74±0．03?D0．73±0．04?0．81±0．05?0．71±0．050．71±0．05?E0．59±0．02?0．91±0．02?0．77±0．030．76±0．03?F0．44±0．03?0．83±0．02?0．73±0．020．82±0．02?

A:K562 control;B:K562A/02 control;C:4 μmol·L-1VP-16;D:2 μmol·L-1LN-13;E:4 μmol·L-1LN-13;F:8 μmol·L-1LN-13;#P<0.05vsA:K562 control;*P<0.05vsB:K562A/02 Control

GroupRatioofIOD(P?gp/β?actin)A0．06±0．03B0．67±0．01#C0．54±0．01?D0．53±0．01?E0．44±0．06?F0．28±0．01?

A:K562 control;B:K562A/02 control;C:4 μmol·L-1VP-16;D:2 μmol·L-1LN-13;E:4 μmol·L-1LN-13;F:8 μmol·L-1LN-13;#P<0.05vsA:K562 control;*P<0.05vsB:K562A/02 control

Fig 3 Effect of LN-13 on K562A/02 cell Bcl-2,Bax, caspase-3, Mdr1 mRNA expression

A:K562 control; B:K562A/02 control; C:4 μmol·L-1VP-16;D:2 μmol·L-1LN-13;E:4 μmol·L-1LN-13;F:8 μmol·L-1LN-13

Fig 4 Effect of LN-13 on K562A/02 cell P-gp expression

A:K562 control;B:K562A/02 control;C:4 μmol·L-1VP-16;D:2 μmol·L-1LN-13;E:4 μmol·L-1LN-13;F:8 μmol·L-1LN-13

3 討論

LN-13是本課題組合成篩選出的一種新穎結(jié)構(gòu)，溶解性好、對多種癌細(xì)胞有較好抑制效果的新型鬼臼毒素衍生物。本實驗結(jié)果表明LN-13不僅能對人紅白血病細(xì)胞K562有較好抑制作用，而且能對阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞株K562A/02的增殖產(chǎn)生明顯抑制，從藥物劑量看明顯優(yōu)于陽性對照藥VP-16，Hoechst 33342、PI雙染色結(jié)果及流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測凋亡結(jié)果同時證明：LN-13作用K562A/02細(xì)胞后出現(xiàn)明顯的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，明顯課觀察到細(xì)胞皺縮凋亡等特征，隨著LN-13濃度增加，細(xì)胞凋亡比例也呈劑量增加趨勢，進一步說明LN-13對K562A/02細(xì)胞的抑制效果。

在眾多導(dǎo)致多藥耐藥的機制中，已經(jīng)明確的重要機制是轉(zhuǎn)運蛋白通過水解ATP獲得能量對疏水性藥物進行外排，由mdr1基因編碼轉(zhuǎn)錄繼而表達的P-gp是轉(zhuǎn)運蛋白家族的重要代表。當(dāng)藥物穿過胞膜進入細(xì)胞，P-gp發(fā)揮生理功能，將藥物泵出細(xì)胞膜外以致胞內(nèi)藥物濃度降低，產(chǎn)生耐藥表征。本實驗發(fā)現(xiàn)LN-13可以明顯下調(diào)K562A/02中多藥耐藥基因mdr1及其轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物P-gp，這可能是其能夠較好地抑制耐藥細(xì)胞增殖且優(yōu)于陽性對照藥活性的一個重要因素。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族的一對重要組成蛋白，從功能上講Bcl-2的活化可抑制細(xì)胞凋亡，Bax活化后可促進細(xì)胞凋亡，進而導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C至細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生系列級聯(lián)活化反應(yīng)，最終激活凋亡的執(zhí)行分子caspase-3，啟動凋亡程序?qū)е录?xì)胞的凋亡[6-9]。本實驗對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax及caspase-3進行了檢測，結(jié)果表明LN-13作用后K562A/02細(xì)胞中促凋亡基因Bax、caspase-3基因明顯上調(diào)，提示LN-13誘導(dǎo)K562A/02細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是與激活線粒體凋亡通路相關(guān)的。

有文獻表明P-gp還具有抑制凋亡作用，可使凋亡級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生延遲[10]，并能保護耐藥細(xì)胞免于細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)的多種形式的caspase依賴性調(diào)亡[11]。本實驗證明LN-13不僅降低K562A/02細(xì)胞P-gp的表達，而且激活caspase-3的表達，但是本實驗對P-gp是否能夠延遲caspase級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的凋亡尚未做深入研究。

綜上，LN-13能夠明顯降低P-gp的表達, 同時激活凋亡相關(guān)基因,從而有效抑制多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02的體外增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

(致謝:本實驗完成于中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院生藥學(xué)與藥劑學(xué)教研室，在此由衷感謝！)

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Podophyllotoxin derivative LN-13 induced multidrug resistant cell K562/A02 apoptosis and its molecular mechanism

GAO Chen-guang1，ZHANG Cai2，ZHAO An-ni3，LI Nan1，CHEN Hong1，CAO Bo1

(1.GraduateManagementDept，LogisticsUniversityofCAPF,Tianjin300309,China；2.UndergraduateDept，LogisticsUniversityofCAPF,Tianjin300309,China；3.PostgraduateCollege，MedicalUniversityofJinzhou，JinzhouLiaoning121000,China)

Aim To study the mechanism of action of the new derivative of podophyllotoxin(LN-13) in inducing the apoptosis of K562/A02 cells.Methods The MTT method was taken to detect the inhibition of LN-13 and VP-16 on K562/A02 proliferation and inhibition rate and IC50values were obtained 48 hours later. The K562/A02 cell morphological change induced by LN-13 were observed through Hochest33342 and PI staining after 48 hours later. Flow cytometry was taken to detect the apoptosis of K562/A02 cells induced by LN-13. The reverse transcription-polymerase chain reaction was taken to detect the Bcl-2，Bax，caspase-3 and mdr-1 mRNA expression.The expression of P-gp was detected by Western blot.Results The growth of K562 /A02 cells was obviously inhibited by LN-13 when IC50value was 3.32 μmol·L-1. LN-13 could obviously induced cell apoptosis observed by Hochest33342 and PI staining. Flow cytometry detection showed that LN-13(2,4,8 μmol·L-1) could induce cell apoptosis and apoptosis ratio reached 15.0%,48.0%, 68.96%,respectively.The reverse transcription-polymerase chain reaction showed that LN-13 increased the Bax and Caspase-3 mRNA expression, and meanwhile the expression of mdr-1 mRNA decreased. Western blot showed that P-gp expression was decreased as the LN-13 dose increased. The data were significantly different from those of control group.Conclusion Podophyllotoxin derivative LN-13 can induce the apoptosis of K562 /A02 cells, which may be closely-related to regulating P-gp expression and apoptosis related gene mRNA expression.

K562；K562/A02 cells；podophyllotoxin derivatives LN-13；apoptosis；P- glycoprotein；multidrug resistance；apoptosis-related genes

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.036.html

2016-09-08,

2016-11-05

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目(No 15JCQNJC13500);武警后勤學(xué)院中心實驗室開放基金資助項目(No 2015ZXKF07)

高晨光(1991-)，男，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail：394887933@qq.com; 曹 波(1958-)，男，博士，講師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者,E-mail：694991184@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.018

A

1001-1978(2017)01-0100-05

R329.25；R341.32；R394.2；R733.73；R979.1