反式蝦青素對(duì)慢性酒精中毒小鼠記憶功能和NF-κB、iNOS、TNF-α表達(dá)的影響

蔣 曦，趙應(yīng)征，潘建春，俞雪鋒

(1. 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江 寧波 315000；2. 浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江 溫州 315000；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325000)

反式蝦青素對(duì)慢性酒精中毒小鼠記憶功能和NF-κB、iNOS、TNF-α表達(dá)的影響

蔣 曦2，趙應(yīng)征3，潘建春3，俞雪鋒1

(1. 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江 寧波 315000；2. 浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江 溫州 315000；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325000)

目的 研究反式蝦青素對(duì)酒精誘導(dǎo)的記憶功能障礙的改善作用及對(duì)小鼠海馬、前額葉皮質(zhì)NF-κB p65、iNOS和TNF-α 表達(dá)的影響。方法 取40 只♂ ICR小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、酒精模型組7 d、14 d、21 d、28 d，通過觀察小鼠對(duì)酒精的偏好程度，并采用水迷宮測試，確定小鼠認(rèn)知記憶障礙出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)。另取40 只♂ ICR 小鼠，將其分為對(duì)照組、酒精模型組及反式蝦青素(20、40、80 mg·kg-1)給藥組，21 d慢性給藥后，分別觀察小鼠訓(xùn)練后1 h和24 h的探索平臺(tái)潛伏期時(shí)間、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間和游動(dòng)速度；Western blot 檢測小鼠海馬和前額葉皮層NF-κB p65、iNOS和TNF-α 的表達(dá)。結(jié)果 小鼠在給予酒精21 d后，攝入酒精量明顯增加 (P<0.01)，并出現(xiàn)記憶功能障礙，表現(xiàn)為探索平臺(tái)潛伏期增加 (P<0.01)、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)減少 (P<0.01)、目標(biāo)象限停留時(shí)間減少 (P<0.01)。21 d慢性給予80 mg·kg-1反式蝦青素后，能明顯改善酒精引起的記憶功能障礙。此外，21 d酒精組海馬腦區(qū)NF-κB p65、iNOS和TNF-α 表達(dá)均明顯增加 (P<0.01)，給予40、80 mg·kg-1反式蝦青素能明顯抑制海馬腦區(qū)NF-κB p65、iNOS和TNF-α的表達(dá) (P<0.01)；相比于海馬腦區(qū)，前額葉皮層腦區(qū)3種炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)也明顯增加，但僅有80 mg·kg-1反式蝦青素能抑制其表達(dá) (P<0.05)。結(jié)論 反式蝦青素通過抑制海馬與前額葉皮層腦區(qū)炎癥相關(guān)蛋白NF-κB p65、iNOS和TNF-α的表達(dá)，發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用，從而改善慢性酒精引起的記憶功能障礙。

反式蝦青素；NF-κB；TNF-α；iNOS；海馬；前額葉皮層；記憶；酒精

酒精成癮，又稱為酒精依賴癥，是一類被人們忽視的中樞神經(jīng)性疾病。據(jù)調(diào)查，我國約有4.7%的成年居民存在過量飲酒的狀況[1]。長期過量飲酒可造成酒精成癮，將對(duì)軀體造成嚴(yán)重?fù)p傷，尤其是酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害極為嚴(yán)重，臨床上稱其為酒精中毒性精神障礙，其中以記憶功能障礙最為明顯。大量研究發(fā)現(xiàn)過量酒精會(huì)損傷記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，如海馬、前額葉皮層等，導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥的發(fā)生，神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)減少及神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡[2-5]。

蝦青素(astaxanthin, ASX)是一種類胡蘿卜素，是世界上最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，其主要成分反式蝦青素的抗氧化活性超過現(xiàn)有的所有抗氧化劑[6]。反式蝦青素清除自由基的能力顯著，其功效是維生素C的6 000倍；是維生素E的1 000倍。此外，反式蝦青素還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即其是唯一能通過血腦屏障的一種類胡蘿卜素。大量的研究也證實(shí)蝦青素的抗炎抗氧化作用與重要神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制—NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)[7-8]，并且其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變疾病，如阿爾茲海默病[9]、帕金森病[10]等均有一定的治療效果。

本項(xiàng)目基于反式蝦青素的強(qiáng)抗炎抗氧化作用，以及酒精成癮與慢性神經(jīng)炎癥、過氧化神經(jīng)毒性物質(zhì)存在相關(guān)性，以NF-κB為突破口，進(jìn)一步檢測腦內(nèi)不同腦區(qū)NF-κB調(diào)控的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，深入探討反式蝦青素是否通過抑制NF-κB，進(jìn)而影響TNF-α與iNOS的表達(dá)，從而改善酒精誘導(dǎo)的記憶功能障礙。本研究采用慢性酒精成癮小鼠模型，并在經(jīng)典模型基礎(chǔ)上稍作修改，模擬臨床酒精戒斷后復(fù)飲的現(xiàn)象，觀察小鼠在反復(fù)戒斷及復(fù)飲后，反式蝦青素對(duì)記憶相關(guān)行為的影響及相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年♂ ICR小鼠80只， 6～8周齡，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2015-0009)。動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水。本實(shí)驗(yàn)涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合1986 年11 月歐洲共同體理事會(huì)指導(dǎo)，并通過復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物行為學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均在上午8點(diǎn)～10點(diǎn)進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 無水乙醇購于無錫佳妮化工有限公司(分析純，批號(hào)：20150420)，反式蝦青素(批號(hào)：41659)購于Sigma公司； NF-κB p65 抗體(批號(hào)：MAB7264)購于R&D公司；iNOS抗體(批號(hào)：ab3523，稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)、TNF-α抗體(批號(hào)：ab6671，稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)、β-actin抗體(貨號(hào)：ab1801，稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)、ECL曝光液(批號(hào)：120711-92) 購于英國Abcam 公司；兔Ⅱ抗(批號(hào)sc-2004，400 mg·L-1，稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)及鼠Ⅱ抗(批號(hào)：sc-2005, 400 mg·L-1, 稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)均為多克隆抗體，均購于Santa Cruz公司；脫脂奶粉(批號(hào)：3106120)購于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；Tris-Hcl(批號(hào)：B0012K02130001)購于中國Biosharp公司；APS(貨號(hào)：ST005)、SDS(貨號(hào)：ST627)、TEMED(貨號(hào)：ST728)及BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào)：P0012)均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚丙烯酰胺(批號(hào)：20130423)和PVDF膜(貨號(hào)：IPVH00011)購于Solarbio公司。

BS 110S 型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；JY92 2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WH 966 漩渦混合器(太倉市科教器材廠)；64 R 超速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司)；BIO-RAD電泳與轉(zhuǎn)膜設(shè)備(美國BIO-RAD公司)；自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分：首先通過酒精偏好測試觀察動(dòng)物模型情況，進(jìn)一步評(píng)價(jià)新型酒精成癮模型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的記憶行為，確定小鼠記憶功能障礙形成的時(shí)間。小鼠隨機(jī)分5組，即正常對(duì)照組、慢性酒精成癮(7 d組、14 d組、21 d組和28 d組)，每組8只小鼠，共40只。第二部分：以第一部分結(jié)果為基礎(chǔ)，確定記憶損傷模型的成模時(shí)間，進(jìn)而評(píng)價(jià)反式蝦青素在慢性給藥后對(duì)小鼠記憶行為的影響，并進(jìn)一步檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。小鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、酒精成癮模型組、酒精+反式蝦青素(20、40、80 mg·kg-1; p.o.)組，每組8只小鼠，共40只。反式蝦青素均采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解，且每日新鮮配制，其他各組則給予CMC-Na，反式蝦青素的給藥劑量依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]。各組動(dòng)物均在行為學(xué)檢測后處死，斷頭取腦，迅速分離海馬和前額葉皮層以進(jìn)行后續(xù)的生化指標(biāo)的測定。

1.2.2 慢性酒精成癮小鼠模型[12]小鼠分為慢性酒精成癮7 d組、14 d組、21 d組、28 d和正常對(duì)照組。3～5只小鼠飼養(yǎng)為一籠。以1 mol·L-1酒精為初始濃度，按10 mL·kg-1量取酒精溶液。第2、3、4周酒精濃度分別為2、4和7 mol·L-1。除正常對(duì)照組以外，所有小鼠均給予酒精，小鼠在d 6、d 13、d 20與d 27進(jìn)行酒精偏好測試。測試后，停止給予酒精，戒斷1 d后繼續(xù)給予酒精，模擬戒斷和復(fù)飲過程，正常對(duì)照組則在全過程中給予正常飲水。

1.2.3 酒精偏好測試 仿照糖水消耗實(shí)驗(yàn)方法[13]，對(duì)小鼠進(jìn)行酒精消耗測試。在小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試前，禁水24 h，單獨(dú)給予每只小鼠酒精與水，記錄1 h內(nèi)酒精與水的攝入量，用酒精攝入比率表示對(duì)酒精的偏好程度。酒精攝入率/%=酒精攝入量/(酒精攝入量+水?dāng)z入量)×100%。

1.2.4 Morris水迷宮測試方法 參照文獻(xiàn)[14]，圓形水池直徑95 cm，平臺(tái)位于水下2 cm，水溫恒定在24 ℃。圓形水池被分為4個(gè)象限，在第三象限中央放置平臺(tái)。水迷宮實(shí)驗(yàn)分為2部分：訓(xùn)練與測試部分。訓(xùn)練部分，共有6次尋找平臺(tái)的獨(dú)立訓(xùn)練，同一只小鼠每次在不同象限內(nèi)的不同位置下水，尋找平臺(tái)的時(shí)間為60 s，若在60 s內(nèi)沒有找到平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上，停留10 s。測試部分，訓(xùn)練結(jié)束后1 h進(jìn)行短時(shí)記憶測試，訓(xùn)練后24 h進(jìn)行長時(shí)記憶測試。測試時(shí)移除第三象限的平臺(tái)，小鼠在第二象限入水，游泳時(shí)間60 s，觀察小鼠到達(dá)原第三象限平臺(tái)放置位置的潛伏期，原平臺(tái)放置位置出現(xiàn)的頻次和第三象限停留的累計(jì)時(shí)間。

1.2.5 蛋白免疫印跡法 所有行為學(xué)測試結(jié)束后，迅速脫頸處死小鼠，并剝離大腦，在4℃下分離海馬和前額葉皮層腦區(qū)，組織稱重后凍存。用RIPA 裂解液裂解組織，并用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量，確定上樣量。電泳及轉(zhuǎn)膜后，在室溫下用封閉液封閉1 h，隨后TBST洗膜，再加入一抗(NF-κB p65、iNOS或TNF-α)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，孵育1 h。用TBST 洗膜后，曝光顯影。所有蛋白的表達(dá)均以β-actin作為參照，以兩者吸光度的比值百分率表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)測試結(jié)果

2.1.1 慢性酒精成癮過程中對(duì)酒精的依賴程度 Fig 1所示，7 d組小鼠在酒精偏好測試中，與正常對(duì)照組相比，對(duì)酒精的偏好程度有增加的趨勢，但數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而14 d組、21 d組和28 d組，對(duì)酒精的偏好程度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 Effects of chronic alcohol consumption on alcohol

**P<0.01vscontrol group

2.1.2 酒精成癮對(duì)水迷宮行為學(xué)的影響 水迷宮訓(xùn)練后1 h測試，觀察小鼠短時(shí)記憶的變化(Fig 2)，結(jié)果顯示與正常組相比，飲酒14 d小鼠找到目標(biāo)平臺(tái)的潛伏期明顯增加(P<0.05)，并且這一現(xiàn)象隨著戒斷次數(shù)和飲酒天數(shù)的增加變得更為明顯，21 d組與28 d組均明顯增加(P<0.01,P<0.01)；相對(duì)的，訓(xùn)練后24 h的長時(shí)記憶也有相似的變化(Fig 3)，表明小鼠飲酒14 d后，開始出現(xiàn)記憶功能障礙，隨著時(shí)間的推移，這一現(xiàn)象更為明顯。同時(shí)我們也觀察了小鼠進(jìn)入目標(biāo)平臺(tái)象限的次數(shù)及在平臺(tái)象限停留的時(shí)間，與正常對(duì)照組相比，無論是短時(shí)記憶還是長時(shí)記憶測試中，21 d和28 d組小鼠進(jìn)入次數(shù)及停留時(shí)間均明顯減少。此外，我們也測定了小鼠在測試過程中的游泳速度，結(jié)果顯示各組小鼠游速并無差異，表明酒精并不影響小鼠正常機(jī)體活動(dòng)。

2.1.3 反式蝦青素對(duì)酒精成癮后水迷宮行為學(xué)的影響 以2.1.2的結(jié)果為基礎(chǔ)，確定小鼠在飲酒戒斷21 d后出現(xiàn)明顯的記憶功能障礙。如Fig 4和5所示，與正常組相比，慢性21 d飲酒的小鼠出現(xiàn)明顯短期和長期的記憶功能障礙，表現(xiàn)為找到平臺(tái)潛伏期增加(P<0.01)、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)和停留時(shí)間減少(P<0.01)，而與模型組相比，21 d慢性給予反式蝦青素(80 mg·kg-1)能明顯改善酒精對(duì)長期記憶的損傷，減少找到平臺(tái)的潛伏期(P<0.01)，同時(shí)增加進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)和停留時(shí)間(P<0.01)，并且各組小鼠的游泳速度并無差異，表明反式蝦青素不會(huì)影響小鼠的正常活動(dòng)。

Fig 2 Latency to reach platform (A), entries (B) and duration (C) in the target quadrant, and swimming speed (D) during

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 Latency to reach platform (A), entries (B) and duration (C) in target quadrant, and swimming speed (D)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.2 反式蝦青素對(duì)NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 如Fig 6所示，慢性酒精成癮組小鼠海馬與前額葉皮層的NF-κB p65蛋白表達(dá)，與正常組相比，明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，反式蝦青素(80 mg·kg-1)能明顯減少海馬、前額葉皮層腦區(qū)的NF-κB p65蛋白表達(dá)(P<0.01,P<0.05)。

2.3 反式蝦青素對(duì)iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)的影響 為研究NF-κB p65核轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白是否與反式蝦青素的促智作用有關(guān)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)。如Fig 7和8所示，21 d酒精損傷后，海馬腦區(qū)的iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，前額葉皮層腦區(qū)iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)也明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，反式蝦青素(40、80 mg·kg-1)能明顯減少海馬腦區(qū)的iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)；相比于海馬腦區(qū)，僅有高劑量反式蝦青素能減少前額葉皮層iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)(P<0.05)。

3 討論

酒精是人類歷史上使用時(shí)間最長的一種成癮物。過量飲酒會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明慢性酒精中毒后，動(dòng)物將出現(xiàn)抑郁、焦慮、記憶功能障礙等一系列中樞病變。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，酒精依賴及出現(xiàn)戒斷的患者首先多表現(xiàn)為：興奮、躁動(dòng)并出現(xiàn)幻覺等現(xiàn)象，隨著依賴程度的加深及戒斷次數(shù)的增多，患者出現(xiàn)判斷力下降，洞察力變?nèi)酰J(rèn)知能力下降等癥狀。本次實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過改良的動(dòng)物模型，相比于經(jīng)典酒精成癮模型，能較好的模擬臨床患者對(duì)酒精依賴程度加深及戒斷次數(shù)增多的過程，并采用水迷宮行為測試評(píng)價(jià)過程中的小鼠記憶認(rèn)知功能的改變。結(jié)果表明，小鼠在飲酒14 d后，開始出現(xiàn)記憶功能障礙，并且隨著戒斷次數(shù)增加和飲酒時(shí)間的增長，記憶功能障礙表現(xiàn)得越明顯。結(jié)果顯示，在飲酒后21 d與28 d，記憶功能損傷較為嚴(yán)重，這表明此動(dòng)物模型造成記憶損傷至少需要14 d，因此在后續(xù)研究中，采用21 d飲酒小鼠模型。

Fig 4 Latency to reach platform (A), entries (B) and duration (C) in target quadrant, and swimming speed (D)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.01,##P<0.01vsAlcohol-treated group.

本研究以21 d飲酒小鼠模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了不同劑量反式蝦青素對(duì)酒精誘導(dǎo)的記憶功能障礙的作用。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過21 d反式蝦青素慢性給藥后，能明顯翻轉(zhuǎn)酒精引起的記憶功能障礙。在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的記憶功能障礙研究中也佐證了本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果[15-16]，表明蝦青素確實(shí)具有改善記憶功能的作用。

基于反式蝦青素對(duì)認(rèn)知行為的影響，并結(jié)合反式蝦青素的強(qiáng)抗氧化、抗炎作用，易透過血腦屏障的特點(diǎn)及其對(duì)重要神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制—NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，推測反式蝦青素對(duì)記憶功能損傷的改善作用可能與NF-κB有關(guān)。同時(shí)相關(guān)研究指出酒精成癮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，以海馬與前額葉皮層腦區(qū)受損最為明顯，尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬存在明顯的神經(jīng)元丟失[17]。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)海馬胚胎細(xì)胞暴露于酒精中會(huì)引起酒精導(dǎo)致的細(xì)胞活力明顯降低[18]。前額葉皮層與海馬正是調(diào)節(jié)復(fù)雜認(rèn)知功能的兩大重要腦區(qū)，如短時(shí)記憶、長時(shí)記憶等的調(diào)節(jié)均與此兩腦區(qū)息息相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)檢測了海馬與前額皮層的NF-κB p65蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒精損傷后兩腦區(qū)的蛋白表達(dá)明顯增加，而慢性反式蝦青素給藥能明顯翻轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，表明反式蝦青素對(duì)記憶損傷的改善作用可能與其抑制NF-κB通路有關(guān)。而且作為核轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB調(diào)控著免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子，如TNF-α、IL-1β、iNOS、黏附分子、集落刺激因子等[19-20]。為進(jìn)一步確認(rèn)反式蝦青素是否作用于NF-κB下游靶點(diǎn)，本研究還檢測了TNF-α和iNOS的表達(dá)。

TNF-α作為一類重要的炎癥因子，與記憶功能密切相關(guān)[21]，尤其是一些慢性疾病引起的記憶功能障礙，如阿爾茲海默病、抑郁癥、原發(fā)性失眠等。最新研究發(fā)現(xiàn)[22]，酒精成癮后腦內(nèi)炎癥明顯增強(qiáng)，這一結(jié)果也在本實(shí)驗(yàn)的新型酒精成癮模型中得到論證，相比于正常組，模型組海馬與前額葉皮層腦區(qū)TNF-α表達(dá)明顯增加。21 d慢性反式蝦青素給藥后，TNF-α表達(dá)明顯降低，表明反式蝦青素可以抑制TNF-α的表達(dá)，從而改善記憶損傷。已有研究也證實(shí)反式蝦青素可以通過抑制TNF-α的表達(dá)，繼而改善中樞炎癥引起的記憶功能障礙[23-24]。但是反式蝦青素對(duì)TNF-α的抑制作用是否源于其對(duì)NF-κB的調(diào)控仍有待進(jìn)一步論證。

**P<0.01vscontrol group;#P<0.01,##P<0.01vsalcohol-treated group.

Fig 6 Effect of ASX on expression of NF-κB p65 in hippocampus (A1, A2) and frontal cortex (B1, B2) of micee.

**P<0.001vscontrol group;#P<0.01,##P<0.01vsalcohol-treated group.

Fig 7 Effect of ASX on expression of iNOS in hippocampus (A1, A2) and frontal cortex (B1, B2) of micee.

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsalcohol-treated group.

Fig 8 Effect of ASX on expression of TNF-α in hippocampus (A1, A2) and frontal cortex (B1, B2) of micee.

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsalcohol-treated group.

iNOS是機(jī)體NOS活性氮自由基產(chǎn)生的催化酶，其含量與機(jī)體內(nèi)炎癥程度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在酒精成癮過程中，iNOS表達(dá)明顯增加，使得神經(jīng)毒性增強(qiáng)，導(dǎo)致大量神經(jīng)毒性物質(zhì)分泌，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，表現(xiàn)出記憶功能減弱，甚至出現(xiàn)記憶障礙[25]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在新型動(dòng)物模型中，21 d飲酒后iNOS表達(dá)明顯增加，但這種iNOS表達(dá)增加現(xiàn)象可被反式蝦青素所翻轉(zhuǎn)，其中以海馬腦區(qū)最為明顯，這表明iNOS也是反式蝦青素的潛在作用靶點(diǎn)之一，并且反式蝦青素對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞較為敏感。在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，也發(fā)現(xiàn)反式蝦青素能夠抑制iNOS表達(dá)[26-27]。本研究在酒精損傷模型中論證了這一觀點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)反式蝦青素對(duì)海馬組織可能存在更強(qiáng)的親和力，亦或是通過其他通路雙重或多重抑制iNOS的表達(dá)。盡管反式蝦青素對(duì)NF-κB確有抑制作用，但iNOS不僅僅是NF-κB通路下游細(xì)胞因子，因此反式蝦青素對(duì)iNOS的抑制作用是否源于其對(duì)NF-κB的調(diào)控也仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，反式蝦青素能明顯改善酒精成癮誘導(dǎo)的記憶功能障礙，這種改善作用可能與其對(duì)NF-κB表達(dá)的抑制作用，及其對(duì)TNF-α和iNOS表達(dá)的抑制作用密切相關(guān)。但這一分子機(jī)制仍需在更多的臨床前及臨床研究中論證。下一步研究將圍繞反式蝦青素對(duì)NF-κB通路的調(diào)控作用，探討反式蝦青素治療記憶損傷的具體治療靶點(diǎn)，同時(shí)也將研究反式蝦青素是否通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，為反式蝦青素應(yīng)用于酒精成癮的治療奠定理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物行為學(xué)測試由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，腦組織生化檢測由浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室與明州醫(yī)院檢驗(yàn)科共同完成，感謝實(shí)驗(yàn)室與科室的老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。)

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Effect of ASX on chronic alcoholism induced memory impairmentand expressions of NF-κB p65, iNOS, TNF-α in mice

JIANG Xi2, ZHAO Ying-zheng3, Pan Jian-chun3, YU Xue-feng1

(1.ZhejiangPharmaceuticalCollege,NingboZhejiang315000,China; 2.ZhejiangUniversityMingzhouHospital,NingboZhejiang315000,China; 3.WenzhouMedicalUniversity,WenzhouZhejiang325000,China)

Aim To investigate the effect of ASX (trans-astaxanthin) on the expressions of NF-κB p65, iNOS and TNF-α in the hippocampus and the prefrontal cortex of chronic alcohol mice. Methods 40 mice were randomly divided into control group, 7 d, 14 d, 21 d, 28 d alcohol-treated group, the mice were given alcohol preference testing on day of 6, 13, 20, 27. Mice were subjected to alcohol withdrawal for one day after testing. In order to determine the exact time point of cognitive memory impairment in mice after alcohol consumption, they were given morris water maze test after alcohol preference testing. The other 40 mice were randomly divided into control group, alcohol group and ASX group (20, 40, 80 mg·kg-1). After chronic ASX administration, mice were given one probe trial of 60 s in which the platform was removed from the pool to evaluate escape latency, the number of times the animal crossed the previous location of the platform, time spent in the target quadrant, and swimming speed. The expressions of NF-κB p65, iNOS and TNF-α were detected by western blotting after behavioral testing. Results The mice showed an obvious alcohol-related phenomenon on 21 and 28 days after alcohol treatment, and escape latency significantly increased, entries in target quadrant and duration in target quadrant significantly decreased with increasing drinking days and withdrawal times. The results also suggested that 21 days chronic ASX treatment reversed this learning deficit. Moreover, the expression of NF- κB p65, iNOS and TNF-α in the hippocampus were significantly increased after 21 d alcohol treatment (P<0.001), and pretreatment with ASX (40, 80 mg·kg-1) could obviously inhibit these changes (P<0.001); Parallel to these changes in the hippocampus, the level of NF-κB p65, iNOS and TNF-α were also increased in the prefrontal cortex (P<0.001), however, only ASX (80 mg·kg-1) administration could inhibit the increase (P<0.05). Conclusion These results indicate that ASX pretreatment can protect against alcohol-induced memory impairment via the inhibition of NF- κB p65, iNOS and TNF-α expressions in hippocampus and prefrontal cortex.

ASX; NF-κB; TNF-α; iNOS; hippocampus; prefrontal cortex; memory; alcohol

時(shí)間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.038.html

2016-08-15，

2016-11-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81360195)；寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2016A610239)；浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校科研項(xiàng)目(No ZPCSR2016003)

蔣 曦(1990- ),女,碩士生,研究方向：藥理及藥物新劑型應(yīng)用,E-mail：jiangxi901022@163.com； 趙應(yīng)征(1972-),男,博士,教授,研究方向：藥理及藥物新劑型應(yīng)用,通訊作者，E-mail：944610816@qq.com； 俞雪鋒(1989-),男,碩士生,研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué),通訊作者,E-mail：yuxuefeng0627@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.019

A

1001-1978(2017)01-0105-09

R-332；R322.81；R338.64；R595.6；R749.62；R979.9