人參皂苷Rh2調控PI3K/AKT/GSK-3β信號通路誘導人結腸癌細胞凋亡

石雪萍，李 靜，冉建華，熊 偉，李海星，郭 珮，陳地龍

(重慶醫科大學基礎醫學院干細胞與組織工程研究室，重慶 400016)

人參皂苷Rh2調控PI3K/AKT/GSK-3β信號通路誘導人結腸癌細胞凋亡

石雪萍，李 靜，冉建華，熊 偉，李海星，郭 珮，陳地龍

(重慶醫科大學基礎醫學院干細胞與組織工程研究室，重慶 400016)

目的 探究人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2, Rh2)誘導人結腸癌細胞SW480凋亡作用機制。 方法 CCK-8法檢測Rh2對SW480細胞增殖的影響；流式細胞術(Flow cytoMetry, FCM)檢測Rh2對SW480細胞凋亡的影響；Hoechst33258染色觀察Rh2對SW480細胞凋亡形態學的影響；Western blot檢測經Rh2誘導SW480細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、p53、cleaved caspase-3，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GSK-3β、P-GSK-3β表達量變化；LY294002、Rh2單獨及聯合誘導SW480細胞后，蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GSK-3β、P-GSK-3β表達量變化。結果 CCK-8結果顯示Rh2呈時間濃度依賴抑制SW480細胞增殖。FCM結果顯示細胞早期凋亡率由正常對照組的(0.70±0.09)%增至(11.06±1.04)% (P<0.05)。Hoechst33258結果顯示，Rh2誘導SW480細胞48h后呈現典型的凋亡形態學改變。Western blot結果顯示，經Rh2誘導的SW480細胞，凋亡相關蛋白 Bcl-2表達降低，Bax、p53、激活型胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)蛋白表達增加；PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白PI3K、P-AKT、P-GSK-3β表達量與對照組比較明顯減少，AKT、GSK-3β表達量無明顯變化；LY294002、Rh2和LY294002與Rh2聯合誘導SW480細胞后，總AKT蛋白和總GSK-3β蛋白表達量基本一致，LY294002與Rh2聯合用藥對SW480細胞中PI3K、P-AKT和P-GSK-3β的表達抑制作用較單獨用藥更加明顯。結論 Rh2可能是通過抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路，激活p53信號通路，激活caspase-3，破壞Bcl-2/Bax比例，誘導結腸癌細胞SW480凋亡。

人參皂苷Rh2；人結腸癌SW480細胞；PI3K/AKT/GSK-3β；p53；Bcl-2；Bax；cleaved caspase-3；凋亡

人參作為歷史悠久的傳統名貴中藥材，近年來，應用于許多腫瘤的輔助性治療。人參皂苷Rh2 (ginsenoside Rh2, Rh2) 作為人參的主要有效成分之一，具有較高的抗腫瘤活性，研究表明其對多種腫瘤細胞具有抑制增殖，誘導凋亡的作用[1-5]。目前關于Rh2對結腸癌作用的研究包括Rh2能夠通過阻滯細胞處于S期抑制結腸癌細胞增殖[6]，誘導結腸癌細胞凋亡[7]，以上研究肯定了Rh2抑制結腸癌細胞增殖，誘導凋亡的作用，但對其具體機制研究甚少。PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在多種細胞凋亡的過程中扮演了重要的角色，那么Rh2誘導結腸癌SW480細胞凋亡能否通過經典的PI3K/AKT/GSK-3β通路發揮作用，目前尚未見報道。

本研究擬觀察Rh2作用結腸癌細胞后，對其增殖和凋亡的影響，凋亡相關蛋白及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達量變化；PI3K抑制劑LY294002、Rh2單獨及聯合誘導SW480細胞后，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達量變化。旨在探討Rh2對結腸癌細胞凋亡的影響及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人結腸癌細胞系SW480細胞由重慶醫科大學附屬醫院腫瘤分子研究中心惠贈[來源于美國模式培養物集存庫(american type culture collection, ATCC)]；Rh2購自成都曼斯特生物科技有限公司(20 mg/支)，相對分子質量為622.87， HPLC檢測純度≥98%；DMEM培養基、胎牛血清均購自 HyClone 公司；0.25% 胰酶購自Gibco公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；LY294002、Hoechst 33258染液、 BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、 RIPA裂解液(強)、 PMSF(100 nmol·L-1)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；6孔板和96孔板購自 NEST 公司；抗體 β-actin、兔抗人 IgG 購自巴傲得生物科技有限公司；抗體 p53 、 Bcl-2 、 Bax 、 cleaved caspase-3、 PI3K 和 AKT 購自沈陽萬類科技有限公司；抗體 p-AKT 、 GSK-3β 、p-GSK-3β 購自美國 Cell Signaling Technology； PVDF 膜和 ECL 顯色劑購自 Miliproe 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥品儲存液配制 人結腸癌 SW480 細胞用含 10% 胎牛血清DMEM 完全培養基，于 37℃ ， 5% CO2飽和濕度下常規培養，每 2～3 d傳代1次。

人參皂苷 Rh2(20 mg/支)溶于 200 μL DMSO 配制成 160 mmol·L-1儲存液， -20℃ 保存，實驗時用10%胎牛血清的高糖 DMEM 培養基稀釋成相應濃度( DMSO 終體積分數不能超過 0.1% )。

1.2.2 CCK-8 法檢測 SW480 細胞增殖抑制率 取處于對數生長期的 SW480 細胞，調整細胞密度為 1×108·L-1， 以每孔 100 μL 的細胞懸液接種于96孔板，培養5～6 h 貼壁后棄去培養上清液。配制終濃度為10、30、50、70 μmol·L-1的 Rh2 ，每孔 200 μL ，每個濃度設置3個復孔，各藥物誘導組作為實驗組。空白組為含10%胎牛血清的200 μL完全培養基，對照組為含與實驗組等量細胞的200 μL細胞懸液。細胞培養24、48、72 h后，每孔加入20 μL 的 CCK-8試劑并放孵箱孵育2.5 h ，酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度(A值)，并計算藥物誘導組細胞生存抑制率和各個時間點的半數抑制濃度(IC50)，以IC50為標準確定藥物最適作用濃度和時間。細胞生存抑制率由下面公式計算：抑制率/%=(AControl 組-ARh2)/AControl組-A空白對照組)×100%1.2.3 FCM檢測結腸癌 SW480 細胞凋亡 取對數生長期的SW480細胞，以5 × 108·L-1的密度接種于直徑為6 cm 的培養皿，設置對照組和藥物組，培養24 h后 藥物組分別加入終濃度為10、30和50 μmol·L-1的 Rh2處理48 h，收集上清液并用PBS洗滌2次，收集全細胞，每組樣本測定3×104個細胞，流式細胞儀檢測采用Cell Quest 軟件分析得出細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4 Hoechst 33258染色檢測SW480細胞核形態變化 將無菌的防脫蓋玻片置于6孔板內，以2×108·L-1的密度接種在6孔板內。培養24 h，分別設置對照組(0 μmol·L-1)和藥物組(10、30、50 μmol·L-1)處理48 h，吸盡培養基，PBS洗滌2遍，每孔加入1 mL固定液，固定30 min 。棄去固定液，用 PBS洗滌3次，每次2 min。避光加入1 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min。去除染色液，用 PBS 洗3遍，每次5 min 。用抗熒光淬滅封片液將蓋玻片封片于載玻片上，使用熒光顯微鏡觀察，采圖。實驗重復3次。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法( Western blot )檢測相關蛋白 取對數生長期的 SW480 細胞，調整細胞數為 6×108·L-1，接種于直徑10 cm 培養皿，每皿6 mL。①分別設置對照組和藥物組，培養24 h后藥物組加入終濃度為10、30、50 μmol·L-1的 Rh2誘導 48 h；②分別設置對照組、 Rh2(50 μmol·L-1) 、 LY294002(20 μmol·L-1)、 LY294002(20 μmol·L-1)+Rh2(50 μmol·L-1)組，培養24 h后，分別加入對應的藥物組誘導48 h。用細胞裂解液在冰上同時裂解細胞組20 min ，12 000×g，離心15 min，提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白含量。酶標儀測定各組蛋白質含量并配平，使各組蛋白終濃度為 5 g·L-1。每個加樣孔加樣 50 μg，采用 SDS-PAGE 膠分離蛋白，70～110 V電泳；4℃、250 mA恒流條件下轉膜。封閉液 37℃ 封閉2 h，采用兔抗人p53(1 ∶1 000) 、 Bcl-2(1 ∶1 000)、 Bax(1 ∶500)、 cleaved caspase-3(1 ∶500) 、 PI3K(1 ∶1 000) 、 AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶10 000) ， 4℃ 孵育過夜， TBST 漂洗， 37℃ 孵育山羊抗兔IgG(1 ∶10 000) 二抗20 min， TBST 漂洗， ECL 試劑發光， Bio-Rad 發光系統呈像。采用 Bio-Rad-Image-Lab-Software 分析測定條帶，檢測分析條帶灰度值，用各組目的條帶的灰度值和內參的灰度值比值表示蛋白質相對表達水平。

1.3 統計學方法分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 人參皂苷 Rh2 能有效抑制人結腸癌 SW480 細胞增殖 運用 CCK-8 法檢測 Rh2對SW480細胞增殖抑制率。結果顯示， Rh2 10、30、50和70 μmol·L-1作用于SW480細胞 24、48、72 h，SW480 細胞的增殖受到明顯抑制(Fig 1)，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。 Rh2作用于 SW480 細胞 24、 48、72 h的半數致死濃度(IC50)分別為 61.74 μmol·L-1、52.26 μmol·L-1、39.57 μmol·L-1。由Fig 1可見， Rh2 對 SW480 細胞的抑制作用呈時間濃度依賴性。

2.2 Rh2 對人結腸癌 SW480 細胞凋亡的影響

2.2.1 FCM 檢測 Rh2 誘導人結腸癌 SW480 細胞凋亡 Rh2 10、 30、 50 μmol·L-1作用于 SW480 細胞48 h后， SW480 細胞的早期凋亡率分別為(5.37±0.54)% 、(8.71±1.29)% 和 (11.06±1.04)%，隨著藥物濃度升高， SW480 細胞的凋亡率逐漸增加，與正常對照組的 (0.70±0.09)% 相較，差異有統計學意義(P<0.01)(Fig 2，Tab 1)。

**P<0.01vscontrol group(24h);▽▽P<0.01vscontrol group(48h);##P<0.01 compared with control group(72 h)

Fig 2 Effect of Ginsenoside Rh2 on apoptosis of SW480 cells detected by FCM

Rh2/μmol·L-1Apoptoticrate/%Control0．710±0．09105．37±0．54??308．71±1．29??5011．06±1．04??

**P<0.01vscontrol group

2.2.2 Hoechst 33258 染色觀察人結腸癌細胞 SW480 凋亡形態學改變 Hoechst 3328 檢測結果(Fig 3)顯示， Rh2 處理對照組 SW480 細胞48 h后，對照組發出均勻的淡藍色熒光，細胞核無明顯凋亡形態學特征； Rh2 10、30、50 μmol·L-1分別誘導48 h后，隨著藥物濃度增加，各組出現核染色質濃縮聚集、核碎裂、核邊集及發出藍白色熒光等典型的凋亡改變，且呈明顯濃度依賴性。

Fig 3 Effect of Ginsenoside Rh2 on morphology of SW480 cells detected by Hoechst33258

A:control; B:10 μmol·L-1; C: 30 μmol·L-1; D:50 μmol·L-1. Arrows show pathologic changes in apoptosis

2.3 Rh2誘導人結腸癌SW480細胞調控相關蛋白表達

2.3.1 Rh2 對 SW480 細胞凋亡相關蛋白調控 SW480 細胞經10、30、50 μmol·L-1Rh2誘導48 h后收集細胞提取總蛋白， Western blot 進行凋亡相關蛋白表達量變化分析。結果顯示(Fig 4)，與對照組相較，抑凋亡蛋白 Bcl-2 表達水平逐漸下降；促凋亡蛋白 Bax、抑癌蛋白p53和激活型caspase-3表達水平升高逐漸升高，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。此結果提示， Rh2誘導SW480細胞凋亡過程，可能通過p53信號通路破壞Bcl-2/Bax比例和caspase-3激活共同參與。

2.3.2 Rh2 對 SW480 細胞 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路相關蛋白調控 SW480 細胞經10、30、50 μmol·L-1Rh2誘導48 h后收集細胞提取總蛋白，Western blot 進行PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關蛋白表達量變化分析。結果顯示(Fig 5)，與對照組相比較，各實驗組總 AKT 蛋白和總 GSK-3β 蛋白表達量基本無變化，與對照組相比較差異無統計學意義(P>0.05 )； PI3K、P-AKT和P-GSK-3β蛋白表達量呈逐漸減少趨勢，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示，在 Rh2誘導SW480細胞凋亡過程中，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路可能發揮了重要作用。

Fig 4 Effect of Ginsenoside Rh2 on apoptosis protein expression of SW480 cells detected by Western blot

A:control; B:10 μmol·L-1; C: 30 μmol·L-1; D:50 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 5 Effect of Ginsenoside Rh2 on proteins of PI3K/AKT/GSK-3β expression of SW480 cells detected by Western blot

A:control; B:10 μmol·L-1; C:30 μmol·L-1; D:50 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.3.3 Rh2和LY294002誘導SW480細胞，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關蛋白表達量變化 SW480 細胞經 Rh2(50 μmol·L-1) 、 LY294002(20 μmol·L-1) 、 LY294002+Rh2 組誘導48 h后收集，提取總蛋白， Western blot 進行 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關蛋白表達量變化分析。結果顯示(Fig 6)，與對照組比較，各實驗組總 AKT 蛋白和總 GSK-3β 蛋白表達量基本一致，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組比較， LY294002 誘導組較 Rh2誘導組對 PI3K、P-AKT和P-GSK-3β蛋白的下調作用更明顯；且兩藥聯合誘導后，表現出協同作用，對 SW480 細胞中PI3K、P-AKT和P-GSK-3β的表達抑制作用較單獨用藥更加明顯(P<0.05)。結果提示 Rh2 誘導細胞凋亡可能是通過抑制 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路，下調 P-AKT 和 P-GSK-3β 來實現的。

Fig 6 Effect of Ginsenoside Rh2 and LY294002 on proteins of PI3K/AKT/GSK-3β expression of SW480 cells detected by Western blot

A:control; B:Rh2(50 μmol·L-1); C:LY294002(20 μmol·L-1); D:Rh2+LY294002.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;▽▽P<0.01,Rh2vsRh2+LY294002;#P<0.05,##P<0.01,LY294002vsRh2+LY294002

3 討論

結腸癌作為胃腸道常見的惡性腫瘤，近年來，其發病率和致死率呈逐年上升趨勢。人參皂苷 Rh2 作為一種中國傳統中藥人參的主要成分之一，大量研究表明，其不僅對正常細胞脂溶性毒性很低，還具有很高的抗腫瘤活性，能夠有效阻滯腫瘤細胞的細胞周期、誘導凋亡和分化[8-10]，提高荷瘤機體免疫功能，抑制腫瘤轉移[11]等多種作用。有關人參皂苷 Rh2 對結腸癌的增殖抑制和誘導凋亡已有相關文獻報道[12]，但對其調節機制在分子水平層面的報道甚少，且其調節機制在分子水平也沒有徹底闡明。

PI3K/AKT 通路是機體內重要信號通路，通過調節細胞增殖、凋亡作用而參與多種腫瘤發生發展的過程。磷酸化 AKT 通過促進絲氨酸/蘇氨酸殘基底物磷酸化二而發揮抗凋亡的作用，糖原合成酶激酶-3β( glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β )作為細胞內主要的絲氨酸/蘇氨酸家族激酶，是 AKT的重要底物。在多種腫瘤中，腫瘤抑制因子 p53 可直接與 GSK-3β 結合，激活的 GSK-3β 能夠增加激活型 caspase-3 的表達水平[13]，這可能會促進凋亡。在結直腸癌細胞系和結直腸腫瘤中， GSK-3β 的表達水平和活化形式均高于正常， PI3K/AKT 信號通路也處于異常活化水平，磷酸化 GSK-3β 可以抑制促凋亡蛋白Bax蛋白線粒體轉位和抗凋亡分子Bcl-2的降解，維持線粒體穩定而抑制凋亡。

本實驗用人參皂苷Rh2誘導人結腸癌SW480細胞，通過CCK-8、FCM和Hoechst33258檢測其增殖、凋亡指標，確定人參皂苷Rh2對結腸癌SW480細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用；研究結果表明，人參皂苷Rh2能明顯抑制人結腸癌SW480細胞增殖，并且呈一定的時間濃度依賴性。Hoechst33258染色結果顯示，SW480細胞經過人參皂苷Rh2誘導48 h后，SW480細胞出現了典型的細胞核染色質濃縮聚集，核碎裂，并發出較強藍白色熒光等細胞凋亡特征。FCM檢測結果也證實了Rh2能誘導結腸癌SW480細胞的早期凋亡，隨著人參皂苷Rh2濃度增加，SW40細胞凋亡率逐漸升高。綜上，人參皂苷Rh2可以誘導SW480細胞凋亡，阻止結腸癌的進一步惡化。本實驗運用了多個實驗方法從多方面驗證文獻報道Rh2對結腸癌細胞抑制增殖，誘導凋亡的作用，并且根據實驗結果選擇出對人結腸癌細胞SW480細胞最適Rh2藥物濃度為52.26 μmol·L-1。

運用 Western blot 檢測凋亡和 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路相關蛋白的表達，探究人參皂苷 Rh2誘導結腸癌SW480細胞凋亡可能機制。LY294002 作為 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路特異性抑制劑，可以阻斷該信號通路的激活。Western blot 結果顯示，經Rh2誘導后的SW480細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降，促凋亡蛋白 Bax、抑癌蛋白p53和激活型caspase-3表達水平升高；PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關蛋白總AKT和總GSK-3β與對照組比較基本保持一致，PI3K、P-AKT、P-GSK-3β蛋白表達量降低，并且呈濃度依賴性。經LY294002處理的SW480細胞中，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的激活被阻斷。另LY294002、Rh2聯合用藥組與LY294002單獨誘導組、Rh2單獨誘導組比較，可進一步抑制PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中P13K、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表達。提示P13K/AKT/GSK-3β可能不是Rh2誘導SW480細胞凋亡的唯一通路。

綜上所述， Rh2 對人結腸癌 SW480 細胞有明顯抗腫瘤活性，其作用機制可能是 Rh2 能夠抑制 SW480 細胞中的 P13K/AKT/GSK-3β 的激活，激活 p53 信號通路，激活 caspase-3，破壞 Bcl-2/Bax 比例，誘導結腸癌細胞 SW480 凋亡。

(致謝：本實驗在重慶醫科大學干細胞與組織工程研究室完成。衷心感謝組胚平臺的所有老師及同學對我的支持與幫助！)

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Ginsenoside Rh2 induced human colorectal cancer cell apoptosis through PI3K/AKT/GSK-3β pathway

SHI Xue-ping, LI Jing, RAN Jian-hua, XIONG Wei, LI Hai-xing, GUO Pei,CHEN Di-long

(ChongqingMedicalUniversity,LaboratoryofStemCellsandTissueEngineering,CollegeofBasicMedicine,Chongqing400016,China)

Aim To investigate the effect of Ginsenoside Rh2 on apoptosis in human colorectal cancer cell SW480, and to explore the possible mechanism of it. Methods The proliferation activity of SW480 treated with Ginsenoside Rh2 was measured CCK-8 assay. Apoptosis rates were evaluated by FCM. Hoechst 33258 staining was used to observe cell nucleus morphological; change SW480 cells were treated with Ginsenoside Rh2, and the protein expressions of Bcl-2, Bax, p53, cleaved caspase-3, PI3K, AKT, P-AKT, GSK-3β, P-GSK-3β were detected by Western blot; SW480 cells were treated with LY294002, Rh2, LY294002+Rh2, the expressions of PI3K, AKT, P-AKT, GSK-3β, P-GSK-3β were detected by Western blot. Results The proliferation of SW480 cells was significantly inhibited by Ginsenoside Rh2 in dose-dependent and time-dependent manner. FCM showed the inducing apoptosis effect of Ginsenoside Rh2 was significantly different from that of control group. Hoechst 33258 staining indicated clearly cell apoptosis in Ginsenoside Rh2 treatment groups. Western blot showed Ginsenoside Rh2 decreased expression of Bcl-2, increased expression of Bax, p53 and cleaved caspase-3, PI3K/AKT/GSK-3β pathway proteins PI3K, P-AKT, P-GSK-3β decreased obviously, AKT and GSK-3β were not changed significantly in SW480. SW480 cells were separately treated with LY294002, Rh2, LY294002+Rh2, there were no significant difference in AKT and GSK-3β protein among all groups, and the expression of PI3K, P-AKT, P-GSK-3β decreased more obviously in LY294002+Rh2 group compared with LY294002 and Rh2 alone. Conclusion Rh2 induces colorectal cancer cell apoptosis through PI3K/AKT/GSK-3β pathway, which activates p53 and cleaved caspase-3, and destroys the balance of Bcl-2/Bax.

Ginsenoside Rh2; human colorectal cancer cell SW480; PI3K/AKT/GSK-3β; p53;Bcl-2;Bax; cleaved caspase-3; apoptosis

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.040.html

2016-08-15,

2016-11-12

國家自然科學基金資助項目(No 31271368)

石雪萍(1989-)，女，碩士生，研究方向：藥物抗腫瘤作用及機制,E-mail:18983006530@163.com; 陳地龍(1971-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學,通訊作者,E-mail:xinmengyuandlc@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.020

A

1001-1978(2017)01-0114-06

R284.1；R329.25；R329.24；R735.35；R977.6