波動性高血糖對糖尿病大鼠腎臟HO-1 γ-GCS及Nrf2表達影響

馮曉紅 黃 琦* 金若晨 陳 頡

糖尿病慢性并發癥的發生發展不僅與整體血糖水平有關，而且與血糖的波動性也密切相關。波動性高血糖導致糖尿病慢性并發癥機制尚不明確，有研究顯示可能與血糖波動產生氧化應激有關。波動性高血糖比持續性高血糖產生更明顯的氧化應激［1］。Nrf2/ARE信號通路是重要的內源性抗氧化應激通路［2］。Nrf2是調節細胞抗氧化應激的重要轉錄因子，HO-1、γ-GCS，是受其調控的下游抗氧化蛋白。本實驗擬觀察波動性高血糖糖尿病大鼠腎臟HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達的影響，探討波動性高血糖危害的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養條件 健康雄性SPF級SD大鼠24只，體重160～180g，鼠齡6～8周，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心。

1.2 實驗材料 超短效胰島素諾和銳（丹麥諾和諾德）；鏈脲佐菌素（購自美國Sigma公司）；血糖試紙及血糖儀（德國羅氏）；自制高脂飼料：蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎飼料69.5%；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）試劑盒；HO-1、γ-GCS及Nrf2蛋白一抗（購自美國Abcam公司）。

1.3 模型建立 將24只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組（N組，n=8）和糖尿病模型組（n=16）。普通飼料喂養組，高脂飼料喂養糖尿病模型組大鼠組。2周后模型組予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）35mg/kg腹腔注射誘導建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，測隨機血糖≥16.7mmol/L為模型制作成功。將糖尿病模型組隨機分為穩定高糖組（S組，n=8）和波動性高糖組（F組，n=8），F組注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動大鼠模型，N組及S組給予腹腔注射生理鹽水0.375 g/（kg·d）體重作為對照。F組每日8：00及15：00給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/（kg·d），并分別于30 min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳1U，造成1d中血糖值大幅度波動。喂養8周。

1.4 標本采集及指標測定 實驗結束后所有大鼠予10%水合氯醛1ml/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心取上清液，測定SOD、MDA、ROS值（方法參照說明書）；處死大鼠后取腎臟組織，以10%中性甲醛液固定。HE染色，常規脫水、石蠟包埋、切片。免疫組化測定HO-1、γ-GCS及 Nrf2的表達。PV法免疫組化染色，嚴格按照PV試劑盒說明書操作，DAB顯色，陽性顆粒呈棕黃色。應用數碼醫學圖像分析系統進行免疫組化染色分析，測定HO-1、γ-GCS及 Nrf2陽性表達的平均光密度（OD值）。每個切片隨機測定5個視野的陽性OD值，取平均值作為該片的代表值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 造模后S組大鼠精神萎靡，行動遲緩，對外界反應遲鈍，毛色無光澤，易臟，進食減少，飲水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，多數大鼠體質量明顯降低，F組較S組癥狀更明顯。

2.2 造模第4周大鼠血糖比較 見表1。

表1 造模第4周大鼠血糖比較［mmol/L，］

表1 造模第4周大鼠血糖比較［mmol/L，］

注：與N組比較，*P＜0.05

?

2.3 各組大鼠血清指標結果的比較 見表2。

表2 各組大鼠血清指標結果的比較

表2 各組大鼠血清指標結果的比較

注：與N組比較，*P＜0.05；與S組比較，#P＜0.05

?

2.4 腎臟HE染色 N組腎小球及腎小管結構未見明顯病變，S組腎小球細胞輕度增多，體積增大；F組腎小球毛細血管球萎縮，球囊增大，分葉明顯，腎小管結構紊亂。

2.5 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達的比較 HO-1陽性表達腎小球胞漿，γ-GCS陽性表達主要分布于腎小球固有細胞、腎小管上皮細胞的胞漿中，Nrf2蛋白陽性表達定位于腎小球固有細胞的胞漿和胞核，陽性表達呈棕黃色顆粒。見表3、圖1～3。

表3 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達的比較（

表3 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達的比較（

注：與N組比較，*P＜0.05；與S組比較，#P＜0.05

?

圖1 各組HO-1免疫組化染色情況

圖2 各組γ-GCS免疫組化染色情況

圖3 各組Nrf2免疫組化染色情況

3 討論

糖尿病的高血糖狀態可以分為慢性持續性高血糖和慢性波動性高血糖兩種。慢性持續高血糖和波動性高血糖對糖尿病的預后及慢性并發癥的發生和發展密切相關［3］，而且糖尿病患者血糖波動越大，慢性并發癥的發生率越高，預后越差。最近發現糖尿病發生的急性血糖波動是觸發氧化應激反應的一個額外因素［4］，即血糖波動更容易引發氧化應激［5］。氧化應激在糖尿病及其并發癥的發生發展過程中有著重要的作用。

氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，導致活性氧（ROS）家族在機體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷。高血糖狀態下，長期的代謝失衡生成大量的ROS，可以通過激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）、糖基化終末產物（AGEs）及氨基己糖等多種途徑和直接作用引起血管內皮損傷，導致血管病變產生并發癥。其中過氧化的脂質降解后的產物MDA（丙二醛）可間接反映氧自由基對血管細胞的損傷程度。

氧化應激狀態下，機體內抗氧化防御體系被激活，有一種重要的抗氧化酶SOD，其具有催化超氧陰離子自由基發生歧化反應的性質，可清除超氧陰離子自由基，防止細胞損傷，故可反映機體的抗氧化能力。另外氧化應激狀態下，Nrf2 通過與抗氧化酶/蛋白基因上游中的抗氧化反應元件（ARE）相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是迄今發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路。在氧化應激的狀態下，Nrf2和其細胞質接頭蛋白Keap1發生分離，前者會向細胞核中轉運和活化，啟動其下游多種抗氧化蛋白表達和Ⅱ相解毒酶的合成，如HO-1、γ-GCS，SOD等，減輕氧化應激引起的損傷。波動性高糖對內皮細胞產生嚴重的氧化應激損傷情況下，HO-1作為一種重要的細胞保護蛋白其表達相應地增高，但生理性的代償并不足以拮抗氧化應激所帶來的細胞損傷。研究表明，誘導HO-1增加在抗氧化、抗高血壓、糖尿病和缺血再灌注腎保護中有積極作用［6］。γ-GCS 是抗氧化劑的重要屏障-谷胱甘肽合成過程中的限速酶，分為重鏈（γ-GCSHS）和輕鏈（γ-GCS-LS）兩個亞基，其數量、活性等直接影響抗氧化的水平。

本實驗發現，無論是穩定性高血糖還是波動性高糖，均可導致SOD活力下降、MDA、ROS含量增加，大鼠腎臟HO-1，γ-GCS及Nrf2的表達均較正常組有所增加，相對于穩定性高糖，波動性高糖使上述變化更為顯著，說明波動性高糖可使氧化-抗氧化失衡進一步加劇，氧化應激損傷加重。Nrf2可能是糖尿病腎病發病中抗氧化基因表達的關鍵轉錄調控因子，其轉錄調控的下游抗氧化蛋白H0-1和γ-GCS參與了糖尿病腎病的抗氧化防御機制。

［1］ Ceriello A,Esposito K,Piconi L,et al．Oscillating glucose is more deleterious to endothelial function and oxidative stress than mean glucose in normal and type 2 diabetic patiens．Diabetes, 2008,57(5):1349-1354．

［2］ Kensler TW,Wakabayashi N,Biswal S．Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1－Nrf2－ARE pathway．Annu Rev Pharmacol Toxicol,2007,47(1): 89-116．

［3］ 王先令,陸菊明．血糖波動對糖尿病預后及其慢性并發癥發生發展的影響．國外醫學:內分泌學分冊,2005,25(3):169-171．

［4］ Yaqoob M,McCMland P,Patrick AW,et al．Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy．QJM,1994, 87(10):601-607．

［5］ 李金榮,王瑞英,張松筠．NADPH氧化酶在糖尿病腎病中的作用．國際內科學雜志,2009,36(2):93-97．

［6］ Cao J,Sodhi K,Inoue K,et al．Lentiviral-human heme oxygenase targeting endothelium improved vascular function in angiotensin II animal model of hypertension．Hum Gene Ther,2011,22(3):271-282．