肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化檢測*

劉 瑩，王圓圓,賈文青，倪 然，張 輝，王 靜#，周 舫

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001

肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化檢測*

劉 瑩1)，王圓圓1),賈文青1)，倪 然1)，張 輝1)，王 靜1)#，周 舫2)

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1958年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：肺癌發病機制和早期預警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺腫瘤；p16；FHIT；APC；甲基化

目的：檢測肺癌患者血清中抑癌基因p16、FHIT、APC的甲基化，探討它們在肺癌發生和診斷中的臨床價值。方法：收集120例原發性肺癌患者(肺癌組)、46例肺良性疾病患者(對照組)的血液標本，采用甲基化PCR方法檢測2組患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化。采用logistic回歸分析肺癌發生的危險因素,計算上述基因甲基化診斷肺癌的準確率。結果：肺癌組血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分別為37.5%、34.2%、31.7%，對照組中分別為6.5%、13.0%、10.9%，差異有統計學意義(P均<0.05)。Logistic回歸分析提示p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發生的獨立危險因素,OR(95%CI)分別為7.509(2.160～26.099)、2.927(1.096～7.814)(P均<0.05)。p16、FHIT、APC基因甲基化單項診斷肺癌的準確率分別為53%、49%、47%，3種基因甲基化聯合診斷肺癌的準確率為87%，優于單項指標。結論：p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發生的獨立危險因素;聯合檢測p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌診斷的準確性。

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康。近年來肺癌的發生率有逐漸升高的趨勢，在我國肺癌已居城市人口惡性腫瘤死因第一位[1]。DNA甲基化是真核生物體內的一種基因內源性修飾，在DNA甲基轉移酶的催化下，使胞嘧啶變成5-甲基胞嘧啶，進而影響其基因的表達[2]。如果這種現象發生在抑癌基因，則造成抑癌基因功能缺失或下降[3]。作者對鄭州大學第一附屬醫院2013年至2014年收治的120例肺癌及46例肺良性疾病患者血清中抑癌基因p16、脆性組氨酸三聯體基因(fragile histidine triad gene，FHIT)、APC的甲基化進行了檢測，探討上述3種基因甲基化和肺癌發生的關系以及在肺癌診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 肺癌組納入標準：原發性肺癌，均有組織病理學診斷依據，按國際抗癌聯盟公布的TNM分期標準進行分期；排除標準：合并其他惡性腫瘤，有手術或放、化療史。根據以上標準收集原發性肺癌患者120例，其中男67例，女53例；年齡36～71歲，中位年齡56歲；120例中肺鱗癌52例，肺腺癌36例，小細胞肺癌32例；根據TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期67例。對照組為肺良性疾病46例，男30例，女16例；年齡14～67歲，中位年齡47歲；肺膿腫14例，支氣管擴張18例，肺結核14例。病例資料的收集均征得受試者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 血清基因組DNA提取試劑盒及引物(廣州生物工程公司)， GoTaq qPCR Mastermix(美國Promega公司)，PTC200型PCR擴增儀(MJ Research公司)，MX3000P PCR儀(STARTAGENE公司)。

1.3 甲基化PCR檢測 2組均采集5 mL清晨空腹靜脈血，-80 ℃保存。使用時嚴格按血清基因組DNA提取試劑盒的操作說明進行。參照文獻[1-2]設計p16、FHIT、APC基因甲基化特異性序列(M)和非甲基化特異性序列(U)。引物合成由廣州生物工程公司完成。見表1。甲基化PCR：①DNA的亞硫酸氫鹽的處理。DNA加入NaOH，水浴30 min充分變性后，加入氫醌和pH為5的亞硫酸氫鈉溶液。通過以上處理，已被甲基化的胞嘧啶不會發生改變，而未甲基化的胞嘧啶則會變為尿嘧啶。修飾后的DNA可用于進行PCR擴增。②PCR擴增。對甲基化及非甲基化的p16、FHIT、APC基因啟動子序列進行PCR擴增的反應體系如下：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，分別將4 μL亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板加入反應體系中，并加水至20 μL；甲基化的陽性對照為經過甲基轉移酶和亞硫酸氫鹽處理的胎盤DNA，陰性對照為正常外周血淋巴細胞DNA，空白對照為H2O。

表1 p16、FHIT、APC基因的甲基化引物

1.4 統計學處理 用SPSS 17.0分析數據。將單因素分析中有意義的變量納入多因素非條件logistic回歸模型，篩選影響肺癌發生的危險因素；應用標準公式計算3種基因甲基化單獨或聯合(串聯)檢測肺癌的敏感度、特異度、準確率。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 DNA甲基化的分析 結果見圖1。

2.2 單因素分析設定變量與肺癌發生的關系 結果見表2。由表2可知,肺癌組血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分別為37.5%、34.2%、31.7%，對照組中分別為6.5%、13.0%、10.9%，差異有統計學意義。

2.3 Logistic回歸分析 設定是否患肺癌為因變量，將單因素分析中有意義的因素納入logistic回歸分析，采用逐步回歸法(納入標準為0.05，排除標準為0.10)建立模型，變量賦值如下：肺良性疾病=0，肺癌=1；p16、FHIT和APC基因未甲基化=0，甲基化=1。結果(表3)顯示，p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發生的獨立危險因素。

2.4 3種基因甲基化診斷肺癌的臨床評價結果 見表4。

1：DNA Marker；U：無甲基化的基因；M：甲基化的基因；NL：正常外周血淋巴細胞DNA；IVD：陽性對照；H2O：空白對照。圖1 FHIT(A)、p16(B)及APC(C)甲基化檢測結果

表3 Logistic回歸分析

表4 3種基因甲基化診斷肺癌的臨床評價 %

3 討論

FHIT含編碼組氨酸三聯體蛋白的功能區，位于染色體3p14．2區，且易斷裂。FHIT是許多類型腫瘤的抑癌基因[4]。Wu等[5]進行了一項薈萃分析顯示：在高加索人群和亞洲人群中，非小細胞肺癌組織中FHIT基因甲基化水平明顯高于非腫瘤組織；FHIT基因甲基化也與吸煙史、病理類型、生存率相關。該研究中肺癌患者血清中FHIT基因甲基化率高于肺良性疾病患者，且FHIT基因甲基化是肺癌發生的危險因素，提示FHIT基因甲基化可能參與了肺癌的發病機制。

抑癌基因APC位于人類染色體5q21，含21個外顯子,長度為8 535 bp，是Wnt信號傳導通路中的重要基因。該抑癌基因啟動子區過度甲基化使基因表達缺失或活性下降，導致Wnt信號傳導通路異常。Schneikert等[6]研究表明APC基因啟動子高甲基化可見于結直腸癌、肺癌、子宮內膜癌等多種腫瘤。Feng等[7]的研究表明，APC基因啟動子甲基化與TNM分期、淋巴結轉移、吸煙有關，與年齡無關；APC基因在肺癌組織中的甲基化率為22.0%，在非腫瘤組織中為14.6%。Ding等[8]研究認為空氣中的有害物質PM10、PM2.5和NO2濃度增高，APC基因甲基化率增加。Huang等[9]對151項研究進行的薈萃分析提示，在鑒別肺鱗癌和腺癌中，APC的特異性和敏感性均高于CDKN2A、MGMT和RUNX3基因。該研究發現肺癌患者血清中APC基因甲基化率高于肺良性疾病患者，但并非肺癌發生的危險因素。

p16在細胞周期調節中發揮著重要作用，是細胞周期蛋白依賴性激酶4的抑制劑。p16基因的甲基化是腫瘤發生發展中常見的改變。研究[10]表明，p16基因甲基化率在肺癌患者中明顯增高，與TNM分期無關，p16啟動子甲基化率在腺癌患者高于鱗癌患者，在吸煙患者高于不吸煙者。該研究結果顯示p16基因甲基化是肺癌發生的危險因素，提示p16基因甲基化亦參與了肺癌的發病機制。

另外，該研究結果還顯示，p16、FHIT、APC基因甲基化單項檢測肺癌的準確率分別為53%、49%、47%，3種基因甲基化聯合診斷肺癌的準確率為87%，優于單項檢測。

綜上所述，p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發生的獨立危險因素;聯合檢測p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌診斷的準確性，從而為肺癌的診斷及評估提供參考。

[1]徐小艷,王曉衛,闕菡雅,等.沉默NOX1表達對A549細胞增殖的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2016,51(3):330

[2]王威,馮曉蕾,段曉冉,等.基于3種基因啟動子甲基化聯合端粒長度構建肺癌診斷支持向量機模型[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,50(4):462

[3]王威,段曉冉,譚善娟,等.基于3種基因啟動子甲基化聯合端粒長度構建肺癌篩查神經網絡模型[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(2):176

[4]LIN HY,HUNG SK,LEE S,et al.DNA methylome analysis identifies epigenetic silencing of FHIT as a determining factor for radiosensitivity in oral cancer: an outcome-predicting and treatment-implicating study[J].Oncotarget,2015,6(2):915

[5]WU X,WU G,YAO X,et al.The clinicopathological significance and ethnic difference of FHIT hypermethylation in non-small-cell lung carcinoma: a meta-analysis and literature review[J].Drug Des Devel Ther,2016,10:699

[6]SCHNEIKERT J,BEHRENS J.The canonical Wnt signalling pathway and its APC partner in colon cancer development[J].Gut,2007,56(3):417

[7]FENG H,ZHANG Z,QING X,et al.Promoter methylation of APC and RAR-β genes as prognostic markers in non-small cell lung cancer(NSCLC)[J].Exp Mol Pathol,2016,100(1):109

[8]DING R,JIN Y,LIU X,et al.Characteristics of DNA methylation changes induced by traffic-related air pollution[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2016,796:46

[9]HUANG T,LI J,ZHANG C,et al.Distinguishing lung adenocarcinoma from lung squamous cell carcinoma by two hypomethylated and three hypermethylated genes:a meta-analysis[J].PLoS One,2016,11(2):e0149088

[10]PASTUSZAK-LEWANDOSKA D,KORDIAK J,MIGDALSKA-SEK M,et al.Quantitative analysis of mRNA expression levels and DNA methylation profiles of three neighboring genes: FUS1, NPRL2/G21 and RASSF1A in non-small cell lung cancer patients[J].Respir Res,2015,16:76

(2016-05-30收稿 責任編輯徐春燕)

Determination of p16, FHIT and APC gene methylation in serum from patients with lung cancer

LIUYing1),WANGYuanyuan1),JIAWenqing1),NIRan1),ZHANGHui1),WANGJing1),ZHOUFang2)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

lung neoplasm;p16;FHIT;APC;gene methylation

Aim: To study the roles of p16, FHIT and APC methylation in carcinogenesis and diagnosis of lung cancer.Methods: Methylation PCR was used to detect the methylation of p16,FHIT,and APC genes in 120 cases of lung cancer(lung cancer group) and 46 cases of benign lung disease(control group). The risk factors for lung cancer were researched by logistic multivariate analysis, and the accuracy of gene methylation in the diagnosis of lung cancer was assessed.Results: The rates of p16, FHIT, and APC gene methylation in lung cancer group were 37.5%,34.2% and 31.7%, those in control group were 6.5%,13.0%, and 10.9%, and the differences were significant(P<0.05). Logistic multivariate analysis suggested that p16 and FHIT gene methylation was risk factor for lung cancer(P<0.05)[OR(95%CI)=7.509(2.160-26.099),2.927(1.096-7.814)].The accuracy of p16,FHIT,APC gene methylation single use for diagnosis of lung cancer was 53%,49%,47%, while the accuracy of the 3 gene combined detection was 87%, better than single detection.Conclusion: The methylation of p16 and FHIT gene may be related to the carcinogenesis of lung cancer,and the com bined detection may improve the accuracy of diagnosis of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.014

*河南省教育廳科技攻關項目 12A320020；河南省科技廳創新人才項目 154200510015

R735.2