HPLC法測定華佗豆中綠原酸的含量

李 兵 曾艷婷 莫惠雯 陳圣斌 趙惠玲 盧汝梅

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

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HPLC法測定華佗豆中綠原酸的含量

李 兵 曾艷婷 莫惠雯 陳圣斌 趙惠玲 盧汝梅*

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

目的：建立華佗豆中綠原酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法測定華佗豆中綠原酸的含量，液相色譜柱為Inertsil ODS-3 (250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈和0.1%磷酸水溶液，流速1mL/min，檢測波長327nm。結果：綠原酸進樣量在0.548～3.288μg之間線性關系良好(r=0.9999)；華佗豆中綠原酸平均回收率為96.31%。結論：該方法簡便、靈敏、準確性高，重復性好，為華佗豆的質量標準制定及進一步研究提供參考依據。

華佗豆；綠原酸；HPLC

華佗豆為旋花科植物丁香茄Calonyctionmuricatum(Linn.) G.Don.的種子，又名天茄子、天茄。其始載于《救荒本草》，味苦，性寒，具有瀉下、解毒等功效，分布于廣西、云南、河南、湖北、湖南等地[1]。在廣西民間，華佗豆又稱跌打豆，常用于治療跌打損傷、小兒疳積、小兒肺炎，療效顯著[2]。Gevara B Q等[3]研究結果表明，華佗豆具有明顯的鎮痛、鎮靜、抗菌活性。華佗豆中富含綠原酸成分，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的縮酚酸，具有抗菌、增高白血球、清除自由基、抑制黃嘌呤氧化酶等活性[4]。綠原酸為抗菌抗炎作用的酚酸類活性成分。目前，以綠原酸類成分用于華佗豆質量控制的報道較少，研究采用HPLC法測定華佗豆中綠原酸的含量，為其質量控制和臨床開發應用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BS224分析天平(德國賽多利斯)；KQ-500DA數控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；CD-UPH-II-20L實驗室超純水器(成都超純科技有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭)。

1.2 材料 綠原酸(批號：F9MQ-ADLM，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇(批號：67-56-1)、乙腈(批號：75-05-8)均為色譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；水為超純水。

華佗豆藥材采自玉林市，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為旋花科植物丁香茄Calonyctionmuricatum(Linn.) G.Don.的種子 。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈(B)-0.1%磷酸水溶液(A)(9 ∶91)為流動相；流速1mL/min；柱溫25℃；檢測波長327nm；進樣量5μL。

2.2 對照品溶液制備 取綠原酸對照品約14mg，精密稱定，加甲醇定容到25mL量瓶中，制成每1mL含0.548mg綠原酸的溶液，即為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取華佗豆(玉林)粉末(過號篩)約0.3g，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定質量，常溫下超聲處理90min，冷卻至室溫，用甲醇補足質量，搖勻，濾過，取適量續濾液經，高速離心15min，作為供試品溶液。

2.4 線性范圍考察 精密吸取綠原酸對照品溶液1、2、3、4、5、6μL，依次進樣，測定綠原酸的峰面積。以峰面積對進樣量(μg)進行直線回歸，得回歸方程為:Y=14060.8965X-0.3327，r=0.9999。結果表明: 綠原酸在0.548～3.288μg 范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 取上述對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定綠原酸的峰面積。結果綠原酸峰面積RSD為0 .99 %，表明儀器精密度良好。2.6 穩定性試驗 取同一份供試品(玉林)，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項色譜條件分別在0、3、6、12、18、24h進樣，測定綠原酸峰面積，RSD為1.12%，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.7 重復性試驗 取同一份供試品(玉林)，按“2.3”項下方法平行制備6份，按2.1項色譜條件進樣，結果綠原酸平均含量為14.56mg/g，RSD為2.74%，表明本法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知綠原酸含量的華佗豆樣品0.15g，共6份，分別精密加入1.866mg/mL綠原酸對照品1mL，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項色譜條件分別測定，計算加樣回收率，平均加樣回收率為96.31%，RSD為2.12%，結果表明本法準確度良好。結果見表1。

表1 樣品中綠原酸加樣回收率測定結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 取4個不同產地華佗豆藥材粉末0.3g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項色譜條件分別測定。結果見表2，圖1、2。

表2 各產地華佗豆中綠原酸含量測定結果 (n=4)

3 討論

綠原酸為苯丙素類化合物，分子結構中含有酯基、不飽和雙鍵及多元酚，鄰二酚羥基在加熱過程中易氧化分解，故本研究采用甲醇常溫下超聲處理。不同產地華佗豆含量測定結果表明，華佗豆中含有大量的綠原酸類成分，基于此類成分與其抗菌抗炎活性息息相關，可考慮將此類成分的含量作為華佗豆的質量控制指標。本研究中建立的含量測定方法簡單可行，重現性好，可為華佗豆藥材的質量控制提供參考。

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(第6卷)[M].上海：上海科學技術出版社，1999: 495.

[2] 朱小勇，趙紅艷，黃貴慶，等.超臨界CO2提取天茄子揮發油化學成分的分析[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(7)：139-141.

[3] Guevara B Q，Rosalinda C，Solevilla Y B，et al．Preliminary phytochemical microbiological and pharmacological studies of Calonyction muricatum Linn[J]. Acta Manilana Ser A Nat Appl Sci，1978，(17)：20.

[4] 徐小昆, 陳志勇, 廖立平, 等. 丁公藤屬植物中東莨菪苷、綠原酸、東莨菪素、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 的含量測定[J].中國中藥雜志,2015,40(6):1119-1122.

(編輯：穆麗華)

Determination of Chlorogenic Acid in Plants ofCalonyctionmuricatumby HPLC

LI Bing ZENG Yanting MO Huiwen CHEN Shengbin LU Rumei*

Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200,China

Objective To develop a HPLC method for the determination of chlorogenic acid(CHA) fromCalonyctionmuricatum. Methods CHA was determined by HPLC on a Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm,5μm) column, acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as mobile phase, the flow rate was 1.0mL/min and detected at 327nm. Results Good linearities of CHA in the range of 0.548～3.288ug(r=0.9999). And the average recovery was 96.31%(RSD=2.12%). Conclusion These results as above was simple，sensitive，accurate and had good reproducibility, can be used to provide the scientific evidence for the establishment of standard for quality controland further study.

Calonyctionmuricatum; Chlorogenic Acid; HPLC

2016-10-17

國家科技支撐計劃項目課題(2013BAI11B06)；廣西科技廳重大專項計劃課題(桂科重1355001-4-1)。

李兵，副教授，主要從事中藥化學成分及質量控制研究。E-mail:gxlb0910@163.com

盧汝梅，教授，主要從事中藥、民族藥化學成分和質量標準研究。E-mail:837330191@qq.com

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1007-8517(2017)01-0016-03