MicroRNA-300在膽管癌患者血清中的表達及其臨床意義*

郭婧瀾，譚蓓蓓，葉婷

（西南醫科大學附屬醫院1.檢驗科，2.核醫學科，四川瀘州646000）

臨床論著

MicroRNA-300在膽管癌患者血清中的表達及其臨床意義*

郭婧瀾1，譚蓓蓓2，葉婷1

（西南醫科大學附屬醫院1.檢驗科，2.核醫學科，四川瀘州646000）

目的探討microRNA-300（miR-300）在膽管癌患者及健康對照血清中的表達及其在診斷和判斷預后方面的臨床價值。方法選取107例膽管癌患者和107例健康對照的血清標本，提取血清總RNA，通過實時定量PCR檢測血清miR-300的表達水平，并繪制ROC曲線檢測miR-300在膽管癌中的診斷價值；采用χ2檢驗、Kaplan-Meier法分析miR-300的表達水平與膽管癌患者臨床特征及患者5年總體生存率之間的關系。結果膽管癌患者血清中miR-300的表達水平高于健康對照者（P＜0.05），且在術后降低；miR-300為膽管癌有效的診斷指標；血清miR-300的表達與膽管癌患者的臨床分期密切相關（P=0.010），而與年齡、性別及分化程度無相關；血清miR-300高表達的膽管癌患者5年總體生存率低于血清miR-300低表達患者。結論膽管癌患者血清中miR-300表達增高，是膽管癌臨床診斷和判斷預后的有效分子指標，具有重要的臨床應用價值。

miR-300；診斷；預后；膽管癌

膽管細胞癌是起源于肝內或肝外膽管的一組異質性的并以膽管分化為主要病理特征的癌癥[1-2]。膽管細胞癌發病率在肝膽系統腫瘤中高居第2位，且在近幾十年來呈逐年上升趨勢[3]。膽管癌對放、化療等傳統治療手段敏感性極低，且早期易發生淋巴轉移或轉移，5年生存率僅5％～10％[4-5]。目前根治性切除術是膽管癌的首要治療方法，但由于缺少有效的早期診斷方法，大部分患者初次就診時腫瘤已發生轉移而失去手術機會。因此，尋找膽管癌早期診斷和判斷預后的分子對提高膽管癌患者的術后生存期及生存質量有著至關重要的作用。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為18～25個核苷酸大小，進化上相對保守的非編碼小分子RNA，主要通過與靶基因的3’-UTR區域結合抑制靶基因表達，進而調控其下游信號通路而參與多種生理進程[6-8]。研究表明[9-10]，miRNA在膽管癌的發生發展中同樣發揮著重要的作用，多種miRNA可通過影響膽管癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移能力而調控膽管癌的進展。此外，新的研究結果顯示[11-14]多種miRNA在膽管癌患者血清或膽汁中可穩定表達，并可作為膽管癌患者早期診斷指標。本研究將檢測膽管癌患者血清中miR-300的表達并利用統計學方法分析miR-300在膽管癌中的診斷及判斷預后的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象選取2007年7月-2010年12月于西南醫科大學附屬醫院就診的膽管癌患者107例以及同期健康對照者107例。所有入選者的臨床資料完整。病例納入標準如下：膽管癌患者均經術后病理組織學確診為膽管癌，且均為初診初治患者；入組患者術前均未接受任何放、化療和生物治療；入組患者肝腎功能未見顯著異常；未合并其他腫瘤或嚴重心腦血管疾病。入組患者術前、術后空腹各采血5ml，真空干燥管中保存，1 500 r/min離心10 min，置入-80℃冰箱冷凍保存待測。本研究經西南醫科大學附屬醫院醫院倫理委員會批準，所有入選者均同意使用其血清標本用于科學研究并簽署知情同意書。

1.1.2 實驗試劑和儀器MicroRNA-300（miR-300）和內參U6引物購自上海吉瑪科技有限公司，Trizol細胞裂解液購自美國Initrogen公司，miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，miRNA逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，SYBR Premix試劑盒購自日本TaKaRa公司，糖類抗原19-9定量測定試劑盒（電化學發光法）購自瑞士羅氏公司。主要儀器如下：美國羅氏Cobas e 601電化學發光分析儀，美國ABI公司7500實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀，美國Thermo公司-80℃冰箱，美國Eppendorf公司臺式低溫高速離心機。

1.2 方法

1.2.1 miR-300的提取及逆轉錄參照miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取血清miR-300。具體步驟如下：200μl血清中加入等體積裂解液，12 000 r/min離心10 min后加入氯仿。震蕩后12 000 r/min離心30 s，取水相層轉移至新的EP管中。加入轉移液體積1/3的無水乙醇，轉入吸附柱，12 000 r/min離心30 s。重復過柱離心后，加入500μl去蛋白液，12 000 r/min離心30 s。而后加入漂洗液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中加入30μl去離子水，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，所得即為提取的miRNA。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。應用特異性miRNA逆轉錄引物，并將miRNA逆轉錄合成cDNA，每個逆轉錄體系中含有10 ng的RNA模板。逆轉錄的條件：15℃20 min，42℃30min，85℃5min。

1.2.2 qRT-PCR反應條件為95℃10 s，95℃20 s，62℃40 s，共設40個循環。采用的相對定量法計算miR-300的相對表達量（F），F=2-Δct，Δct=ctmiR-300-ctU6，其中ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。

1.2.3 血清CA19-9含量檢測血清稀釋后，使用電化學發光分析儀及配套CA19-9檢測試劑盒對膽管癌患者血清CA19-9進行檢測，參考值為0～34 u/ml。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，膽管癌患者及健康對照者血清miR-300組間比較用t檢驗，血清miR-300與膽管癌患者臨床特征之間的關系采用χ2檢驗，繪制受試者工作曲線（ROC），評估血清miR-300及CA19-9在膽管癌患者中的診斷價值，采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析膽管癌患者各組間生存差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-300在膽管癌患者和健康對照者血清中的表達水平

通過qRT-PCR檢測膽管癌患者和健康對照者血清中miR-300的表達，結果顯示，膽管癌患者血清中miR-300的表達量為（4.071±1.625），健康對照血清中miR-300的表達量為（2.171±1.055）。膽管癌患者血清中miR-300的表達水平高于健康對照組，差異有統計學意義（t=3.237，P=0.014），見圖1。

圖1 膽管癌患者及健康對照血清中miR-300的表達量

2.2 miR-300在膽管癌患者術前及術后血清中的表達

通過qRT-PCR檢測膽管癌患者術前和術后血清中miR-300的表達，結果顯示，膽管癌患者術前血清中miR-300的表達量為（4.071±1.625），術后血清中miR-300的表達量為（1.689±1.074）。膽管癌患者術后血清miR-300的表達低于術前，差異有統計學意義（t=5.198，P=0.021），見圖2。

2.3 miR-300在膽管癌中的診斷價值

根據血清miR-300的表達水平，建立miR-300和膽管癌篩查指標CA19-9的ROC曲線，利用ROC曲線評價兩者在膽管癌中的診斷價值。結果顯示，miR-300 ROC曲線下面積0.933（95％CI：0.903，0.964），敏感性為87.8％，特異性為84.1％；CA19-9 ROC曲線下面積為0.871（95％CI：0.826，0.917），敏感性為81.3％，特異性為85.9％，見圖3。血清miR-300和CA19-9在膽管癌中均具有較高的診斷價值。

2.4 miR-300與膽管癌患者臨床相關特征的關系

分析血清miR-300表達與膽管癌患者臨床特征（年齡、性別、臨床分期、分化程度）的關系。根據血清miR-300的表達水平，將膽管癌患者分為高表達組（n=61）與低表達組（n=46）。結果顯示，血清miR-300的表達水平與膽管癌患者的臨床分期密切相關，隨著膽管癌患者臨床分期的進展，血清miR-300的表達亦逐漸升高，兩組差異有統計學意義（χ2=7.147，P=0.010）。血清miR-300的表達與膽管癌其他臨床特征，包括年齡、性別、分化程度均無相關性，組間比較差異無統計學意義。見附表。

2.5 miR-300與膽管癌患者5年生存率之間的關系

Kplan-Meier生存曲線分析結果顯示，血清miR-300高表達組術后5年總體生存率低于血清miR-300低表達組，兩組間差異有統計學意義（Log-rank test：P=0.022）。見圖4。

圖2 膽管癌患者術前及術后血清中miR-300的表達

圖3 血清miR-300及CA19-9診斷膽管癌的ROC曲線

圖4 血清miR-300與膽管癌患者術后5年總體生存率之間的關系

附表血清miR-300表達與膽管癌患者臨床相關資料的關系例

3 討論

近年來，研究發現miRNA可穩定存在于血液、尿液和膽汁等生理液體中，更為重要的是血清中游離miRNA被證實為包括膽管癌在內的多種腫瘤的有效診斷指標之一，能夠穩定地被檢測到并且在一定程度上提示腫瘤的狀態，是非常有前景的腫瘤標志物[15-16]。本研究通過檢測膽管癌患者和健康對照者血清中miR-300的表達情況，發現與健康對照者比較，miR-300在膽管癌患者血清中表達上調。更為重要的是，在膽管癌患者術后，血清miR-300的表達下調，這說明miR-300為膽管癌特異性的miRNA，血清中miR-300的表達水平可在一定程度上反應膽管癌的進展情況。因此本研究進一步分析血清miR-300在膽管癌中的診斷價值，發現血清miR-300可作為膽管癌有效的診斷指標，具有較高的敏感性和特異性。本研究分析血清miR-300的表達與膽管癌患者臨床特征的關系發現，隨著膽管癌患者臨床分期的進展，血清miR-300的表達亦逐漸升高，但是miR-300的表達與膽管癌其他臨床特征，包括年齡、性別、分化程度均無相關性。本研究分析血清miR-300的表達與膽管癌患者術后5年生存率的關系，結果顯示，血清miR-300高表達組的術后5年生存率較miR-300低表達組下降。

miR-300是長度為22個核苷酸的非編碼RNA分子，與多種腫瘤的發生及進展密切相關。miR-300的功能具有組織和空間特異性，在不同腫瘤中可作為癌基因或抑癌基因而發揮作用。研究發現[17]骨肉瘤組織中miR-300表達上調，可促進骨肉瘤細胞的增殖和轉移，并與骨肉瘤患者的不良預后密切相關。另有研究發現[18]，在骨腫瘤中miR-300促進細胞的增殖及侵襲，并通過潛在分子機制為靶向抑制BRD7分子表達。此外，在乳腺癌中miR-300可通過靶向抑制P53的表達促進乳腺癌的增殖。然而，頭頸部鱗狀細胞癌中，研究發現[19]miR-300可通過調控Twist的表達而抑制EMT和腫瘤的轉移。新近研究發現[20]，miR-300可穩定存在于卵巢癌患者血清中，并可作為卵巢癌診斷的分子指標。本研究探討miR-300在膽管癌患者血清中的表達及其在膽管癌中的診斷和預后方面的臨床價值，結果提示，血清miR-300的表達在膽管癌中顯著上調，且具有一定的特異性。此外，膽管癌患者術后血清miR-300的表達水平較術前降低，這說明隨著膽管癌組織的切除，血清miR-300的表達水平下降，血清miR-300的表達水平可在一定程度上反應膽管癌組織中miR-300的表達水平，但仍需進一步的實驗明確血清miR-300在膽管癌早期診斷中的特異性。更為重要的是，血清miR-300的表達與膽管癌患者臨床分析呈正相關，并具有較高的診斷和判斷預后的臨床價值。本研究結果提示miR-300在膽管癌中可能作為癌基因發揮作用。綜合既往研究和本研究，進一步明確了miR-300的表達及功能具有組織和空間特異性，需進一步的機制研究明確其在膽管癌中發揮癌基因作用的分子機制。

綜上所述，本研究證實膽管癌患者血清中miR-300表達高于健康對照組；膽管癌患者術后miR-300的表達水平下降；血清中miR-300為膽管癌有效的診斷指標；膽管癌患者血清miR-300的表達水平與膽管癌患者的臨床分期密切相關；血清中miR-300高表達的膽管癌患者5年生存率低于血清miR-300低表達組。本研究為膽管癌發生及進展的機制研究奠定了一定的前期基礎，為膽管癌的早期診斷及預后判斷提供了潛在靶點。

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（張蕾 編輯）

Expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and clinical significance*

Jing-lan Guo1,Bei-bei Tan2,Ting Ye1
(1.Clinical Laboratory,2.Department of Nuclear Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo detect the expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and discuss its clinical significance．MethodsSerum samples of 107 cholangiocarcinoma patients and 107 normal control patients were collected.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression of serum miR-300.Diagnostic value of serum miR-300 in cholangiocarcinoma was analyzed by the receiver operating characteristic(ROC)curve.Associations between serum miR-300 expression and clinicopathologic features of cholangiocarcinoma patients were analyzed by χ2test.Association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of cholangiocarcinoma patients were analyzed by Kaplan-Meier methods．ResultsThe expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was statistically higher than that of the normal controls(P＜0.05), moreover,the expression of serum miR-300 was significantly down-regulated after surgery.The expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was significantly associated with clinical stage(P=0.010),but had no significant association with age,gender or differentiation status of cholangiocarcinoma.Cholangiocarcinoma patients with high serum miR-300 expression had a significantly lower 5-year overall survival rate compared to those with low serum miR-300 expression.ConclusionsThe expression of serum miR-300 is significantly up-regulated incholangiocarcinoma,and serum miR-300 is a promising diagnostic and prognostic biomarker in cholangiocarcinoma.

:miR-300;diagnosis;prognosis;cholangiocarcinoma

R735.8

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.007

1005-8982（2017）02-0042-05

2016-07-20

瀘州醫學院科研課題青年基金（No：2012QN-50）