載藥膠束改善吉西他濱對胰腺癌的治療效果

康可歆，李昱驥

（中國醫科大學附屬第一醫院1.老年病科；2.胃腸外科，沈陽 110001）

載藥膠束改善吉西他濱對胰腺癌的治療效果

Drug?loaded Micelles Improve the Effect of Gemcitabine in Pancreatic Cancer Treatment

康可歆1，李昱驥2

（中國醫科大學附屬第一醫院1.老年病科；2.胃腸外科，沈陽 110001）

通過合成載吉西他濱普朗尼克?α?生育酚琥珀酸酯聚合物膠束，證明其可改善吉西他濱對胰腺癌的治療效果。

載吉西他濱膠束；胰腺癌；治療效果

胰腺癌的發病率在世界范圍內有逐漸增高的趨勢［1］，能早期診斷并接受手術的患者不足20%，故藥物治療的作用越來越被臨床醫生重視。目前胰腺癌的一線化療方案是以吉西他濱（gemcitabine，GEM）為主體的多藥聯合治療，但總體生存期（over rall survival，OS）僅為6.8個月［2］。為了提高藥物的治療作用，改善患者的生存時間，尋找新的治療方法迫在眉睫。有研究［3］表明，載藥膠束可以增加藥物在腫瘤細胞中的濃度和存留時間，更好的發揮其細胞毒作用。本研究設計了新的載GEM膠束，探討其對胰腺癌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

普朗尼克P123，生育酚琥珀酸酯（tocopherol succinate，TOS）和1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺［1?（3?Dimethylaminopropyl）?3?ethylcarbodi?imide hydrochloride，EDC］購自西格瑪公司（中國）。GEM購自江蘇豪森藥業股份有限公司。人胰腺癌細胞株PANC?1購自中國科學院培養收集細胞庫（上海，中國）。PANC?1細胞用10%胎牛血清1640培養液培養（HyClone公司，美國），細胞的培養環境為37℃，5%CO2/95%空氣。實驗小鼠購自中國醫科大學實驗動物部。

1.2 方法

1.2.1 載GEM膠束的制備：將500 mg P123、76 mg TOS、和108 mg EDC溶解在5 mL的DMSO中。將混合物在氮氣環境中連續攪拌40 h。產生的化學聚合物用截留分子量3 000的透析袋透析1周，中途頻繁更換蒸餾水，產品進行冷凍干燥。將5 mg堿化的GEM和50 mg P123?TOS交聯物（P/TOS）溶解于乙腈中且攪拌1 h。然后將以上有機混合物裝于透析袋中，用蒸餾水透析12～24 h。將最終收集到的載?GEM P/TOS（P/TOS?GEM）冷凍干燥。

1.2.2 P/TOS?GEM膠束的檢測：P/TOS?GEM的大小和電荷用馬爾文分析儀（英國）用來測量。載藥能力（drug loading capacity，DLC）通過光譜學進行評估。簡單來說，先將P/TOS?GEM（凍干后）溶于蒸餾水中，添加1∶50的甲醇。然后離心、留上清，在紫外可見光譜268 nm波長下測量GEM的數量。DLC使用以下公式進行計算：DLC（%）=（截留的GEM量/納米顆粒總量）×100。

1.2.3 膠束體外藥物釋放實驗：透析法研究藥物釋放。首先將冷凍干燥的P/TOS?GEM溶解于蒸餾水，濃度為1 mg/mL。取1 mL的膠束分散物加到透析膜（分子量3 500）上，透析膜兩端是密封的。將裝有分散物的透析膜浸入到裝有25 mL釋放液的離心管中。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）和醋酸鹽緩沖溶液（ABS，pH5.0）分別作為釋放液。在特殊的時間點，需要對釋放液進行等體積的更換。釋放到釋放液中的藥物量使用紫外可見光譜儀在268 nm進行測量。

1.2.4 細胞毒性分析：對游離GEM和P/TOS?GEM在HepG2癌細胞中的抗癌效力通過MTT實驗進行測定。細胞培養后接種到96孔板上，接種密度為1× 104/孔。細胞貼壁培養20 h后使用不同濃度的藥物處理24 h。然后將培養基去除，將細胞用PBS洗滌2次。隨后加入溶解于PBS的MTT溶液（20 μL，50 mg/mL），并孵育4 h。去除上清液，使用DMSO（100 μL）提取甲瓚。使用酶標儀測定490 nm波長下的吸光度值。細胞存活率與未經過處理的對照組進行比較。

1.2.5 載瘤小鼠模型的建立：取5周齡小鼠，行右側齒狀面注射PANC?1細胞懸液（1×106），當腫瘤體積增大到100 mm3時開始實驗。腫瘤體積使用游標卡尺進行測量，腫瘤大小用公式V=a×b2/2計算（a和b分別代表腫瘤的最大和最小直徑）。

1.2.6 體內抗腫瘤研究：將小鼠腫瘤模型分成3組，每組8只。其中2組每隔3 d經尾靜脈分別注射同等劑量（150 mg/kg）的GEM和P/TOS?GEM，共注射3次。第3組為對照組。按時監測小鼠的腫瘤體積和體質量變化。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。數據用x±s表示，2組數據的檢驗使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠束的大小及載藥能力

制備P/TOS?GEM膠束的臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）為27 μg/mL，膠束的平均直徑約100 nm。DLC為27.43%±3.22%。

2.2 膠束在酸性的環境下更易釋放藥物

3組實驗分別在不同的pH環境中進行。結果顯示，在不同的環境中，GEM的釋放速度有著顯著區別。見圖1。24 h后在pH7.4，pH6.5，pH5.0的環境中，膠束的藥物釋放率分別為33.7%，48.6%和69.4%。在48 h后，pH7.4的環境下，藥物釋放率接近不足40%，而在pH5.0的環境下，藥物釋放率幾乎達到100%。結果提示膠束的藥物釋放率受pH環境的影響比較大，在pH5.0的環境下，膠束有較高的藥物釋放率。

圖1 P/TOS?GEM體外釋放實驗

2.3 P/TOS?GEM的細胞毒性較游離GEM更強

采用MTT實驗分別檢測游離GEM和P/TOS?GEM對PANC?1細胞的毒性作用。結果顯示，無論是游離的GEM還是P/TOS?GEM對PANC?1細胞的細胞毒作用都呈現出濃度依賴性，見圖2。游離GEM的IC50為2.12 μg/mL，而P/TOS?GEM的IC50為0.5 μg/mL，提示P/TOS?GEM對PANC?1細胞有著更強的細胞毒性作用。

圖2 游離GEM和P/TOS?GEM對PANC?1細胞的細胞毒性效應

2.4 P/TOS?GEM對腫瘤生長的抑制作用強于游離GEM

對照組腫瘤體積逐漸上升，18 d時達到1 600 mm3，游離GEM和P/TOS?GEM均可抑制腫瘤體積增長，其中P/TOS?GEM的抑制作用更加明顯，18 d時體積僅為700 mm3左右，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 游離GEM和P/TOS?GEM的體內抗腫瘤作用

3 討論

胰腺癌嚴重威脅人類健康。因多數患者起病隱匿，診斷時多為中晚期，難以接受根治性手術［4?5］，目前5年生存率不足5%［6］。為了改善這一現狀，更多科研者的目光逐漸投向藥物治療。目前，治療胰腺癌的臨床一線用藥是以GEM為主體構建的，但治療效果不盡理想。隨著納米技術的進展，有學者［7］主張開發新的納米系統以提高藥物的治療效果。

本研究采用普郎尼克嵌段共聚物作為GEM的載體。共聚物由作為親水段的普郎尼克和疏水段的TOS構成，合成的膠束直徑在100 nm左右，呈近球形結構。據文獻［8］報道，只有直徑在200 nm以內的膠束才能憑借其高穿透性和滯留效應到達靶細胞。通過多次實驗證實，只有將普郎尼克和TOS聚合后構成的膠束才有較高的藥物攜帶能力，達到了27.43%。而單純用普郎尼克生成的膠束，其攜藥能力不足10%，分析原因，可能與交聯后TOS作為疏水段，可以增加膠束的穩定性，獲得更高的藥物攜帶能力有關［9］。

本研究探討了P/TOS?GEM在不同的pH環境下的藥物釋放情況，發現其具有pH依賴性藥物釋放的特點。在模擬血液的環境下（pH7.4），藥物的釋放速度減緩，提示其可以延長藥物在血液系統內存留的時間，這一特點可能與普郎尼克的親水段具有防污特性有關。而在腫瘤內環境（pH5.0）下，藥物會得到充分的釋放，可以更充分地發揮作用。尤其是在實驗的開始階段，在任何條件下，藥物的釋放率都很低，說明膠束系統具有很好的穩定性，藥物被安全的包埋在膠束中。

就GEM而言，因為具有低分子量和高通透性的特點，可以更容易地進入腫瘤細胞。但是，隨著周圍環境中藥物濃度的下降，GEM也很容易被泵出腫瘤細胞外，難以持久地發揮作用。而采用膠束作為藥物載體之后，膠束在腫瘤細胞內的酸性環境下可以逐漸釋放GEM，能夠將細胞內藥物的濃度維持在一定的水平，減少藥物的流失，更能充分發揮藥物的抗腫瘤作用。

總之，本研究中合成的載GEM膠束可以增強對胰腺癌細胞的殺傷作用，顯著抑制胰腺癌的增長，具有實際的臨床意義，為胰腺癌的治療提供了新的思路。

［1］REBECCA L，SIEGEL M，KIMBERLY D，et al.Cancer statistics 2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.DOI：10.3322/ caac.21254.

［2］CONROY T，DESSEIGNE F，YCHOU M，et al.FOLFIRINOX ver?sus gemcitabine for metastasic pancreatic cancer［J］.N Engl J Med，2011，364（19）：1817-1825.DOI：10.1056/NEJMoa1011923.

［3］LI YJ，DONG M，KONG FM，et al.Folate?decorated anticancer drug and magnetic nanoparticles encapsulated poly，eric carrier for liver cancer therapeutics［J］.Int J Pharm，2015，15（489）：83-90.DOI：10.1016/j.ijpharm.2015.04.028.

［4］WITKOWSKI ER，SMITH JK，TSENG JF.Outcomes following re?section of pancreatic cancer［J］.J Surg Oncol，2013，107（1）：97-103.DOI：10.1002/jso.23267.

［5］楊尹默，田孝東.胰腺癌基礎研究的幾個熱點問題［J］.中華普外科手術學雜志（電子版），2011，5（1）：13-21.

［6］WADDELL N，PAJIC M，PATCH AM，et al.Whole genomes rede?fine the mutational landscape of pancreatic cancer［J］.Nature，2015，518（7540）：495-501.DOI：10.1038/nature14169.

［7］NISARAPORN S，TAO L，KAI L，et al.M13 bacteriophage?polymer nanoassembiles as drug delively vehicle［J］.Nano Res，2011，4（5）：483-493.DOI：10.1007/s12274?011?0104?2.

［8］VLADIMIR T.Multifunctional and stumuli?sensitive pharmaceuti?cal nanocarriers［J］.Eur J Pharm Biopharm，2009，71（3）：431-444.DOI：10.1016/j.ejpb.2008.09.026.

［9］WON YW，YOON SM，SONN CH，et al.Nano self?assembly of re?combinant human gelatin conjugated with α?tocopheryl succinate for Hsp90 inhibitor，17?AAG，delivery［J］.ACS Nano，2011，5（5）：3839-3848.DOI：10.1021/nn200173u.

（編輯 于 溪）

R453.9

B

0258-4646（2017）03-0281-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.023

康可歆（1978-），女，講師，本科.

李昱驥，E-mail：liyuji74@163.com

2016-07-11

網絡出版時間：