異體CIK聯合血漿置換干預晚期原發性肝癌的臨床研究

侯俊杰，楊 影，李孝男，倪志強，周 穎，江顯卓，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫院 醫學診治實驗中心，吉林 長春130021)

異體CIK聯合血漿置換干預晚期原發性肝癌的臨床研究

侯俊杰，楊 影，李孝男，倪志強，周 穎，江顯卓，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫院 醫學診治實驗中心，吉林 長春130021)

目的 研究異體CIK聯合血漿置換臨床治療肝癌的效應和機制。方法 分離健康人外周血單個核細胞(PBMC)，加入細胞因子誘導成CIK細胞，體外培養擴增。病例均給予內科綜合支持治療情況下，隨機分為異體CIK細胞治療組和異體CIK+血漿置換治療組。應用ELISA法比較二組治療前后血漿中IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、VEGF的濃度變化；流式細胞術檢測二組治療前后患者外周血中CD3+和CD4+細胞比例、CD4+/CD8+比值、CD8+細胞比例；比較二組患者的生存質量、無進展生存期(PFS)、總生存期(OS)。結果 二組異體CIK的抗腫瘤免疫效應均上調，異體CIK+血漿置換治療組免疫上調顯著，與同時下調IL-4、IL-10和TGF-β、VEGF的血漿濃度有關(P<0.05)；流式細胞術檢測發現，治療后的患者外周血中CD3+、CD4+細胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細胞比例下降，以異體CIK+血漿置換治療組更為顯著(P<0.05)；PFS長于單純異體CIK細胞治療組(P<0.05)，OS無延長(P>0.05)；生活質量顯著優于異體CIK細胞治療組(P<0.01)。結論 通過應用異體CIK細胞過繼免疫治療+血漿置換方案，可抑制和清除免疫抑制性細胞和免疫抑制因子，上調CIK細胞免疫效應及數量，可抑制原發性肝癌進展，改善患者生活質量。

CIK；肝癌；血漿置換；細胞因子

(ChinJLabDiagn,2017,21:0050)

肝癌是世界上第五大常見實質性惡性腫瘤和第三大癌癥致死原因，每年超過60萬人因疾病進展而死于該病[1]。目前傳統的化學治療和放射治療效果不佳，手術是有效治療的手段，然而只有小部分患者獲益，靶向治療單純應用獲益有限[2]，由于治療手段有限，因此總體預后極差。

肝癌的生長、侵襲和轉移與血液及腫瘤微環境中的細胞因子上調具有直接相關性，如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF等，實驗證明，在肝癌患者的腫瘤細胞、血漿和尿液中可檢測到上述因子的水平明顯升高，由于體內血漿量最大，其內細胞因子水平最高[3]。腫瘤細胞可通過多種途徑逃避機體免疫監視系統，包括腫瘤對T淋巴細胞的功能抑制，誘導分化出免疫抑制細胞如髓源性抑制細胞調節性T細胞等，同時腫瘤可導致免疫抑制因子如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF的上調等，諸多前臨床實驗已證明抑制或清除髓源性抑制細胞、調節性T細胞和免疫抑制因子等，同時提高CIK細胞免疫效應及數量，可提高CIK細胞抗腫瘤效應[4]。血漿置換(PE)技術已廣泛應用于臨床，它通過暫時替代肝臟的功能，分離血細胞和血漿，從而將血液中的免疫抑制因子、內毒素、膽紅素等有害物質清除，改善機體內環境，在重癥肝病的治療中得到應用[5]。因此，通過輸注異體CIK細胞聯合血漿置換(PE)技術，清除血漿中的免疫抑制因子，同時提高CIK細胞免疫效應及數量，改變了腫瘤的微環境，有可能成為晚期肝癌免疫治療的有效輔助手段，為臨床治療晚期原發性肝癌提供新策略。收集2014年5月-2015年5月間在本院就診的60例原發性肝癌患者，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年5月-2015年5月間在本院就診的60例原發性肝癌患者，符合2009 年發布的《原發性肝癌規范化診治專家共識》的標準。年齡>18歲，肝功能為Child-Pugh B級或C級，預計生存期超過2個月；無生物制品過敏史，無嚴重細菌、病毒感染，非妊娠及哺乳期患者；自愿入組，患者或授權家屬簽署治療知情同意書。

排除標準：出現肝性腦病、消化道出血等嚴重并發癥，其他病毒感染，酒精性、藥物性肝損傷，嚴重凝血機制障礙，合并心、肝、腎、造血及代謝系統嚴重原發性疾病或嚴重全身感染者。

在60例原發性肝癌患者中，男性56例，女性4例；年齡28-79歲，平均年齡(53.3±10.2)歲。按隨機自愿原則，分為異體CIK治療組(CIK group)30 例、異體CIK+血漿置換治療組(CIK+ Plasma exchange group，CIK-PE)30例。二組臨床特征均無統計學差異。

1.2 方法

1.2.1 CIK細胞的培養和治療方法 采集健康人外周血單個核細胞，Ficoll淋巴細胞分離液梯度離心，收集白膜層的單個核細胞，以生理鹽水洗滌3次后懸浮于RPMI 1640(Gibco公司，美國)中，5% CO2、37℃孵箱中放置2小時，調整非貼壁細胞密度為2×106/毫升，用含10%胎牛血清(EXCELL?公司，上海)的初始培養基在37℃、5% CO2條件下培養，并在培養基中添加 IFN-γ 1 000 U/ml 和rhIL-2 1 000 U/ml(均購自北京雙鷺藥業有限公司，北京)以及50 ng/ml抗人CD3單克隆抗體(T&L生物公司，北京)。每2 d按照細胞濃度添加新鮮培養基及rhIL-2(1 000 U/ml)，培養至7 d后收集細胞。收集的CIK細胞約1×109-1×1010/ml，細胞存活率在95%以上。在符合GLP標準的無菌實驗室培養配制成CIK細胞懸液，采血后培養每天抽取培養上清，檢測細菌、真菌、支原體、解脲及內毒素等，所有樣本檢測結果為陰性后回輸，直至疾病進展。

1.2.2 血漿置換治療方法 應用日產KURARAY-KM8800型血漿置換儀，股靜脈常規消毒穿刺后，置入雙腔導管并固定，建立血液通路，每次置換2 500-3 000 mL的同型血漿，每周1 次。

1.2.3 細胞因子檢測 ELISA法檢測兩組治療前后細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-1O、TGF-β及VEGF的濃度。

1.2.4 免疫功能檢測 收集患者治療前后外周血細胞，配成1×106個/ml的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 ml，每組3復孔，按照說明書，加入相應的流式抗體，經流式細胞儀(FACS)檢測CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+/CD8+細胞和CD8+細胞比例，Cell Quest軟件分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 治療前后細胞因子水平的比較

在治療前，兩組患者的IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平差異無統計學意義(P>0.05)；在治療2療程后，兩組患者的IFN-γ無明顯下降，差異無統計學意義(P>0.05)；而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中聯合治療組患者的下降程度明顯高于單純異體CIK組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 治療前后細胞因子水平的比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

2.2 治療前后免疫功能比較

治療后兩組患者CD3+和CD4+細胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細胞比例下降，CIK治療前后差異有統計學意義(P<0.05)；與單純異體CIK治療組比較，異體CIK聯合血漿置換治療更能改善患者的免疫功能，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表2。

2.3 生存期比較

聯合治療組腫瘤無進展生存期(PFS)長于單線異體CIK細胞治療組，差異顯著(P<0.05)；聯合治療組總生存期優于單純異體CIK細胞治療組，但兩者差異不顯著。見表3。組內比較，兩組患者治療后的KPS評分均顯著高于治療前(P<0.05)；組間比較，治療前兩組患者的KPS評分之間的差異均不顯著(P>0.05)，治療后，聯合治療組KPS評分顯著高于異體CIK細胞治療組(P<0.01)，見表4。

表2 兩組患者治療前后的免疫功能變化情況比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表3 兩組患者的

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表4 兩組患者治療前后的KPS評分變化情況比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

3 討論

隨著腫瘤治療學的不斷發展及進步，腫瘤免疫治療備受關注，于2013年被Science評選為10項重大突破之首。其中細胞免疫治療異軍突起，通過改善患者的免疫系統功能，達到間接治療腫瘤的目的，成為腫瘤免疫治療的主要方案。細胞免疫治療主要包括細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷(NK)細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、腫瘤浸潤細胞(TIL)等[6]。目前臨床容易制備且應用廣泛的就是CIK細胞，其具有腫瘤細胞殺傷活性的NK樣T細胞作用，臨床應用安全，能夠更廣泛的適合臨床治療需求[7，8]，但在CIK細胞治療腫瘤的療效仍受多種因素限制，如腫瘤患者體內存在大量細胞免疫抑制因子IL-4、IL-10及促腫瘤生長因子TGF-β及VEGF等，影響CIK細胞治療療效[9]。

IL-10主要是一種免疫抑制因子，通過多種途徑抑制機體的抗腫瘤免疫效應[10]。VEGF具有促腫瘤血管新生作用，同時干擾樹突細胞、B細胞和T細胞的抗原呈遞作用，引起腫瘤細胞發生免疫逃逸。腫瘤細胞同時又具有分泌的IL-10、VEGF和TGF-B等功能，能刺激巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化，反過來分化形成的M2型巨噬細胞于腫瘤細胞相互作用，共同分泌大量的IL-10、VEGF和TGF-β因子，抑制機體的抗腫瘤免疫效應[11]。IL-4為另一種免疫抑制因子，其主要通過3種負向調節方式抑制γδT細胞的免疫應答作用:①抑制γδT細胞的活化作用；②促使γδ T細胞向Vδ1 T細胞偏倚，產生的Vδ1 T細胞能夠大量分泌IL-10，間接抑制具有強細胞毒活性的Vδ2 T細胞的增殖，從而抑制γδT細胞的抗腫瘤活性[12]；③IL-4還抑制Vδ1T細胞表達殺傷性受體NKG2D[8]。本實驗通過回輸CIK細胞治療、血漿置換等治療，觀察發現，患者CIK治療前后，CD3+和CD4+細胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細胞比例下降，差異有統計學意義，與單純異體CIK治療組比較，異體CIK聯合血漿置換治療免疫功能改善更為明顯，差異有統計學意義，以上結果說明CIK細胞治療可以改善患者免疫功能，在清除免疫抑制因子和促瘤因子的條件下，CIK細胞治療更能發揮其抗腫瘤的免疫效應。在治療2療程后，兩組患者的IFN-γ無明顯下降，差異無統計學意義，提示血漿置換后雖然下調了IFN-γ量，但CIK細胞輸注后能彌補細胞因子IFN-γ量的不足，一定程度上上調了免疫功能，而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中聯合治療組患者的下降程度明顯高于單純異體CIK組，差異有統計學意義，證明了在清除免疫抑制因子和促瘤因子的條件下，血漿置換有利于放大CIK細胞生物治療療效。

針對晚期腫瘤患者，由于目前還不能從根本上治愈，所以為使患者帶瘤長期生存，應選擇不良反應少、耐受性良好且能改善生活質量的方案，在選擇治療方案時應重視多學科綜合治療的策略，制定合理的、個體化綜合治療方案，延長生存期的同時，改善患者生活質量更為重要[13]。本研究結果提示：兩組患者OS無差別，但聯合治療組PFS長于單純CIK治療組，且聯合治療組KPS評分顯著高于異體CIK細胞治療組，即聯合治療組患者獲得了更長時間的PFS，達到了晚期腫瘤患者以改善生活質量為主的目的。

綜上，將兩種成熟的醫療技術即CIK細胞治療與血漿置換(PE)技術有機的結合，有可能為臨床治療肝癌提供新策略。

[1]李 穎，李香玉，張曉磊.原發性肝癌患者的生活質量研究現狀[J].中國衛生產業,2016,13(11):193.

[2]蔣 昊，文 頌.原發性肝癌分子靶向藥物臨床研究進展[J].腫瘤防治研究,2016,43(05):427.

[3]Pfirrmann V,Oelsner S,Rettinger E,et al.Cytomegalovirus-specific cytokine-induced killer cells:concurrent targeting of leukemia and cytomegalovirus[J].Cytotherapy,2015,17(8):1139.

[4]徐利強，李建華，倪修文.細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)培養方案的優化[J].中國輸血雜志,2015,28(08):1030.

[5]蔡妙國，何澤寶，徐穎鶴，等.不同置換液量對連續性腎臟替代治療重癥肝炎清除能力及療效的影響[J].中華醫院感染學雜志，2013，23(2)：315.

[6]Lulla P,Heslop HE.Checkpoint inhibition and cellular immunotherapy in lymphoma[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2016(1):390.

[7]Linn YC,Hui KM.Cytokine-induced NK-like T cells:from bench to bedside[J].J Biomed Biotechnol,2010,20(10):435.

[8]侯俊杰，劉 多，倪志強.細胞因子誘導的殺傷細胞治療惡性腫瘤安全性分析[J].中國免疫學雜志,2015,31(12):1654.

[9]Oeser K,Maxeiner J,Symowski C,et al.T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma[J].Allergy,2015,70(11):1440.

[10]Siqueira MB.Kroner A,Girolami EI,et al.Role of IL-10 in Resolution of Inflammation and Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury[J].J Neurosci,2015,35(50):1643.

[11]Liu S,Yuan S,Wu H,et al.The Clinical Research of Serum VEGF,TGF-β1,and Endostatin in Non-small Cell Lung Cancer[J].Cell Biochem Biophys,2015,72(1):165.

[12]Christian P,H?slerb R,Daniela W,et al.Human Vδ2 T cells are a major source of interleukin-9[J].PNAS,2016,113(44):12520.

[13]楊蕓峰,易春濤,浦斌紅.“和”理念在舒緩醫療中的作用探討[J].國際中醫中藥雜志,2016,2:103.

Clinical study of allogeneic CIK combined with plasma exchange in the treatment of advanced primary liver cancer

HOUJun-jie,YANGYing,LIXiao-nan,etal.

(JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

Objective To study the effect and mechanism of allogeneic CIK combined with plasmapheresis in the treatment of liver cancer.Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy volunteers and cultured in vitro by culturing the cells into cytokine-induced (CIK) cells.All cases were randomly assigned to allogeneic CIK cell treatment group and allogeneic CIK + plasma replacement therapy group.The levels of IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β and VEGF in plasma were measured by ELISA.The percentage of CD3+and CD4+cells in the peripheral blood of the two groups before and after treatment were detected by flow cytometry.CD4+/CD8+ratio and CD8+cell ratio,and the quality of life and overall survival of the two groups were compared.Results The anti-tumor immunity effect of allogeneic CIK was up-regulated,and the up-regulation of IL -4,IL-10,TGF-β and VEGF was related to the up- regulation of CIK + plasma replacement therapy group (P<0.05);The percentage of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+in peripheral blood in CIK+plasma replacement group were significantly higher than those in allogeneic CIK group(P<0.05),and the percentage of CD8+cells decreased significantly after treatment(P<0.05),PFS has been prolonged(P<0.05) and no OS prolongation(P>0.05),and quality of life was significantly better than that of allogeneic CIK cells treated group(P<0.01).Conclusion Adoptive CIK cell adoptive immunotherapy + plasma exchange program can inhibit and remove immunosuppressive cells and immunosuppressive factors,increase the immune effect and quantity of CIK cells,inhibit the progression of primary liver cancer and improve the quality of life of patients.

Hepatitis；Atorvastatin；Plasma exchange；Liver function

1007-4287(2017)01-0050-04

吉林省科技廳項目(20140520037JH，20140519018JH，20140414043GH)、吉林省人社廳省人才開發資金(2016年度)及吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助

R735.7

A

2016-04-14)

*通訊作者