產氣莢膜梭菌β1毒素基因克隆與表達

張蓉蓉++艾地云++張騰飛++羅青平++溫國元++王紅琳++汪宏才++邵華斌

摘要：以C型產氣莢膜梭菌中PCR擴增出β1毒素基因，構建了表達質粒pGEXKG-β1，將構建的KG-β1轉化受體菌BL21（DE3），得到重組菌株BL21/KG-β1。對重組菌株誘導的表達產物進行了SDS-PAGE分析，結果表明重組菌株可以高效表達毒素蛋白。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；β1毒素；克隆表達

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0007-02

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中廣泛分布，是人和動物腸道內的一種正常菌，能產生a、β、ε、ι四種主要毒素，根據產生這四種毒素種類的不同，可將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E五種類型[1]。該菌在家禽中主要是能引起壞死性腸炎，雞源產氣莢膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型產氣莢膜梭菌主要產生a和β兩種毒素。其中β毒素具有細胞毒性和致死性的特點，是重要的致病因子[2]。課題組在前期進行了雞源產氣莢膜梭菌a毒素的克隆表達及免疫原性研究[3]，本研究旨在進一步對β毒素進行克隆表達，為其診斷試劑和亞單位疫苗的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 C型產氣莢膜梭菌、受體菌大腸桿菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG載體由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶BamH I和Xho I、PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照NCBI中產氣莢膜梭菌β1毒素全基因組序列，設計1對β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小為1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分別含有BamH I和Xho I酶切位點。

1.2.2 全基因組的提取 將產氣莢膜梭菌在厭氣肉肝湯中于37 ℃厭氧培養過夜離心后，將沉淀菌細胞重懸于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混勻后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit說明書進行全基因組的提取。

1.2.3 PCR擴增 50 μL PCR反應體系為：10×Buffer緩沖液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加滅菌雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.4 PCR產物的回收、連接轉化及鑒定 PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，按說明書操作。將回收純化的目的產物與pGEX-KG載體雙酶切后，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，以含有氨芐西林（Amp）抗性平板進行篩選培養，挑取白色菌落于含Ampr的LB液體培養基上培養過夜，以SDS堿裂解法提取重組質粒，經PCR鑒定及BamH I和Xho I雙酶切分析篩選陽性克隆。

1.2.5 陽性質粒的誘導表達及表達產物的SDS-PAGE分析 將構建的陽性質粒轉入受體菌BL21（DE3）經37 ℃加IPTG誘導后，按文獻[4]報道的方法收集菌體變性處理后，進行SDS-PAGE電泳分析。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定結果

采用設計的特異性引物進行β1毒素基因的PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明，以產氣莢膜梭菌為模板擴增出約1 000 bp的特異性條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 重組質粒的雙酶切鑒定

將質粒經PCR鑒定后用限制性內切酶BamH I和Xho I進行酶切鑒定，結果見圖2。由圖2可見，經雙酶切后可獲得大小約為5 000和1 000 bp的2條DNA條帶，即pGEX-KG載體和目的基因條帶，初步表明成功構建產氣莢膜梭菌β1毒素克隆表達質粒。

2.3 β1毒素基因表達產物SDS-PAGE分析

將BL21（DE3）菌株作為表達的宿主菌，經轉化挑取單個菌落培養誘導后，菌體經超聲波處理，提取包涵體，上清經80%飽和硫酸銨沉淀后得到濃縮，沉淀經透析后，用SDS-PAGE分析（圖3），在相對分子質量約為56 ku處出現特異性蛋白條帶，結果表明β1毒素可在宿主菌種得以表達，并且β1毒素蛋白多以包涵體的形式存在表達。

3 討論

產氣莢膜梭菌能產生多種具有致病性的外毒素，其中β毒素不僅能引起家禽壞死性腸炎及仔豬腸毒血癥，也能引起嬰幼兒的壞死性腸炎[5]，危害極其嚴重。本研究利用PCR技術，設計特異性引物成功地從C型產氣莢膜梭菌中擴增出目的片段β1，并構建了成功表達β1毒素的重組菌株，表達的蛋白以包涵體形式存在，純度高。β1毒素的表達為產氣莢膜梭菌的臨床診斷和基因工程疫苗提供了前提。

參考文獻：

[1] SPARK S G， CARMAN R J， SARKER M R，et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）：883-888；

[2] TIMBERMONT L， LANEKRIET A， PASMANS F，et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology， 2009（12）：l-4.

[3] 張蓉蓉，艾地云，張騰飛，等. 雞源產氣莢膜梭菌a毒素基因克隆表達及免疫原性的初步研究[J].湖北農業科學，2015，54（20）：5152-5154.

[4] 梁宋平.生物化學與分子生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2003.

[5] GRANUM P E. Clostridium perfringens toxin involved in food poisoning[J]. Int J Food Microbiol，1990，10：101-111.