牛腸道病毒的研究進展

何歡，張斌

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

牛腸道病毒的研究進展

何歡，張斌*

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

國內近幾年牛腸道病毒病已經開始逐漸流行，現已發現多株新型病毒株并對此建立了多種分子及血清型方面的檢測方法。通過對牛腸道病毒的基本結構、鑒定方法、檢測方法、流行情況以及致病機制進行詳細的介紹，以期為更好的研究牛腸道病毒在我國的流行現狀及防治措施提供依據。

牛腸道病毒；分離鑒定；檢測方法；發病機制

牛腸道病毒(bovine enterovirus, BEV)廣泛存在于人類和各類動物機體內并且能夠引起其呼吸道系統和消化系統的疾病，一般認為BEV是牛腸道中原有的棲居者，在腸道中增殖，病原性不明顯。BEV的致病性有些許爭議，有認為只引起輕度腹瀉或健康牛的隱性感染，也有認為可引起呼吸系統和消化系統疾病[1]，其致病性機理還不是很清楚。本文對牛腸道病毒的研究進展作一綜述。

1 BEV的概述

1.1 形態、結構及功能 牛腸道病毒為小RNA病毒科腸道病毒屬成員之一，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，具有典型的二十面體立體對稱的球形結構(圖1)。早期報道過BEV的晶體結構并發現牛腸道病毒衣殼蛋白的拓撲和病毒粒子整體結構與小RNA病毒科其他成員一樣[3]。病毒粒子大小為25～30 nm，如圖1C所示為牛腸道病毒的電鏡圖片[4]，全長7300～7500 bp，基因組中僅有一個開放閱讀框(ORF)，可直接作為mRNA 翻譯出一個多聚蛋白，經過一系列降解，產生4 種結構蛋白(VP1、VP2、VP3 和VP4)和7種非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D)，如圖1D所示為腸道病毒基因結構的示意圖[5]。VP1、VP2、VP3與VP4蛋白包繞基因組RNA組成病毒的基本結構，而7種非結構蛋白雖不能構成病毒的主要結構，但在基因復制、轉錄、翻譯等過程中提供重要的酶類等物質，以保障病毒的正常繁殖代謝。在其兩側為5′和3′非編碼區(UTRs)，在3′非編碼區的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)[6]。病毒衣殼是由VP1、VP2、VP3 和VP4構成，VP4是被包埋在病毒衣殼內部的，一般感染機體不會產生相應的抗體，而其他VP1、VP2和VP3 三種結構蛋白暴露在病毒的表面，是刺激機體產生抗體的主要部位。在VP1蛋白上有最主要的抗原抗原結合位點，VP2、VP3和VP4蛋白與病毒衣殼的理化特性及某些穩定性有關又是其重要的組成部分。非結構蛋白中的各種蛋白多數與酶的活性有關，如2A具有半胱氨酸蛋白酶活性，2C具有ATP酶活性；也有在RNA的復制過程中起到重要作用的蛋白，如3B在與RNA 5′末端的pUpU形成磷酸二酯鍵之后啟動RNA的合成，2B和3A參與并促進RNA早期的復制，隨后在3D蛋白的作用下引起病毒RNA的復制并在3C水解酶蛋白的促進作用下可導致宿主細胞的死亡[7]。牛腸道病毒其它腸道病毒相比，在內部核糖體進入位點(IRES)與三葉草結構之間多了100個核苷酸[8]。5’UTR可通過與細胞蛋白因子的相互結合從而調控病毒基因組的合成及蛋白翻譯，VPg蛋白結合在5'末端之后與聚合酶3D相互作用，啟動病毒RNA的復制[6]。3'UTR末端含有的(poly A)與病毒的感染性、基因組復制及mRNA的合成效率相關[6]。

A：牛腸道病毒粒子模擬結構；B：腸道病毒粒子剖面圖；C：牛腸道病毒的電鏡圖片(100000×)；D：腸道病毒基因結構示意圖圖1 腸道病毒粒子及衣殼結構

BEV粒子無囊膜，故對乙醚、脫氧膽酸鹽、去污劑以及氯仿有一定的抵抗力，也能抵抗蛋白水解酶的作用。此外牛腸道病毒還能抵抗弱酸條件如pH3.0、常見的消毒劑如70%乙醇和5%甲酚皂溶液等。這些理化特性決定了該病毒可在自然環境中存活數月之久。但牛腸道病毒在堿(pH10.0 以上)、高溫(50 ℃以上，鈣、鎂離子存在時除外)和紫外線照射等條件下1 h左右便可被滅活[9]。1.2 BEV的分類及鑒定方法 BEV的分子型根據5′UTR和衣殼蛋白的結構分為BEV-E(原BEV-A)和BEV-F(原BEV-B)兩大類。在BEV檢測分型過程中病毒分離物或原始標本首先以5′UTR鑒定為小RNA病毒科病毒。VP1蛋白是最主要的衣殼蛋白，具有最多的型特異性中和位點，因此VP1 蛋白編碼基因序列與病毒血清型具有較高的相關性，通過擴增全長VP1序列，構建系統進化樹對比VP1區核酸同源性與已知血清型腸道病毒同源性<70%(氨基酸同源性<85%)則認為所測病毒與標準株不是同一血清型，為一新血清型[3]。VP1作為BEV分型的主要依據已經被普遍認可，但隨著VP1序列數據的不斷擴大，部分毒株的情況不符合70%/85%的分類標準，比如獲得的VP1序列不完整，則要獲得更多的信息如P1全序列、中和試驗結果及免疫電鏡圖片等來進行綜合判定。

BEV血清型的分型經歷了幾次重要的變動。1985年Knowles等[10]將BEV的分型標準確定為2個血清型(BEV-1和BEV-2)。2006年Zell等[11]通過對已知的牛腸道病毒的 5′UTR、VP1、VP2、VP3、VP4和3D 的序列進行了比對分析后確定了該病毒其實可以分為BEV-A 與 BEV-B兩個大群。目前，世界公認的BEV的分類標準是在第九次病毒委員會分類報告[12]上公布的EV-E(即BEV-A)與 EV-F(即BEV-B)兩種，前者包括E1～E4共四種基因型，后者分括F1～F7共六種基因型。

2 BEV的流行現狀

一般認為BEV是牛腸道中原有的棲居者，在腸道中增殖，病原性并不明顯。大多數人認為牛腸道病毒可引起呼吸道疾病、繁殖障礙和流產等臨床癥狀，BEV在發生多種臨床癥狀(呼吸系統、消化系統、繁殖障礙性疾病)牛群中都得到了分離，甚至是假定健康的牛群動物中也能夠得到分離[13]。

2.1 國外的流行現狀 自1959年Moll和Davis首次分離到BEV以來[14]，全世界很多國家和地區先后報道了BEV的感染情況，在國外牛群中的流行率約為17.6%～80%[15]。2002年Ley等[16]研究發現與封閉牛群畜牧業相關的環境,包括加拿大白尾鹿、加拿大鵝、動物的飲用水源和牧場下游的臨近河牡蠣都能夠通過RT-PCR等方法檢測的到BEV的存在，其中白尾鹿糞便的陽性率為38%，牛糞便的陽性率為76%。并對所檢測的BEV進行序列分析發現并不完全屬于同一型別。2007年Zheng等[17]從澳大利亞刷尾負鼠體內腸道內容物中分離得到兩株牛腸道病毒W1與W6，均屬于BEV-2型。2008年S Gur等[15]對土耳其部分地區不同物種BEV-1感染情況進行了血清學檢測，其中包括244份人血清、1520份牛血清，檢測結果表明人血清陽性率為30.3%，牛血清陽性率為64.8%，這是首次在人血清中檢測到BEV的抗體，但其是否能夠引起人類的一些臨床癥狀尚未可知。2012年A′kos Boros等[13]從健康羊糞便樣本中利用5′UTR和VP1基因序列鑒定并分離出了一株自然種間重組的豬/牛腸道病毒OEV-1，同時也首次獲得了該毒株的全基因序列。2013年McClenahan等[4]在因呼吸道疾病致死的羊駝肺組織樣品中首次分離得到一株BEV，經后續試驗鑒定其為EV-F。2015年Sobhy等[18]從嚴重腹瀉的牛體內分離到了一株BEV-F2型。

2.2 國內的流行現狀 在國外，BEV的流行及傳播比較普遍，但在中國有關BEV疾病的報告卻還沒有系統的數據分析。但近幾年已多次報道新型BEV的發現，比如2011年李英利等[19]報道過從內蒙古地區的犢牛糞便中分離出了1株BEV，命名為BHM26，并且分析表明中國BEV分離株與國外參考毒株具有較大差異但未鑒定其基因型；2013年侯佩莉等[20]從山東地區的泌乳奶牛的腹瀉糞便樣本中分離出了BEV，命名為BEV-SD。同年，彭小薇等[21]從北京某牛場的泌乳奶牛的腹瀉樣本中分離獲得1株牛腸道病毒2型，命名為BJ001，之后又對分離株進行了全基因組測序分析；2014年從吉林省一個發病率和死亡率較高的牛場分離到三株E種BEV，命名為HY12[22]，從北京地區某牛場分離到一株F種BEV[23]；2015年張海麗等[24]從山西某奶牛場的泌乳奶牛糞便樣品中分離得到一株BEV。

從以上數據可以初步分析國內外BEV均有E型和F型的毒株出現，同時國內的分離株多數是屬于新型分離株，也豐富了BEV屬的種類。該病毒在國內外的流行差異主要在于感染物種的不同，國內現在僅在反芻動物體內監測的到該病毒的存在，如牛、羊等；而國外的感染譜相對比較廣泛，除了牛、養外，還可在羊駝、鹿、豬、馬、鵝、鼠，甚至在人類的血清中都能夠監測的到該病原的存在。對此，在我國未來的牛腸道病毒的研究發展中應該擴大檢測的物種范圍，更加全面系統的監測BEV在我國的感染譜及流行率。

3 BEV的檢測技術的發展

通常多數研究者認為牛腸道病毒的病原性不明顯，廣泛存在于自然界中，其宿主范圍較廣，能夠在一定條件下如侵入其他組織或是繼發感染和混合感染其他病原時引起顯著的癥狀進而導致動物疾病的發生，造成經濟損失[12]，因此簡便快速的檢測技術對BEV的監控和防治是非常必要的。

目前已報道的牛腸道病毒的檢測技術主要有傳統的電鏡檢查、病毒分離、血清學試驗和TaqMan熒光定量PCR等。2005年Jimenez-Clavero等[25]針對BEV 5′UTR基因建立了相關的RT-PCR檢測方法并對西班牙的多個地區的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進行了檢測，結果數據表明，除了在驢的檢測樣本中未檢測到，其余均有陽性樣本存在；2016年Nathamon等[26]根據5′UTR基因設計引物(長約290 bp)建立了RT-PCR的方法并對泰國部分地區的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率做了一個調查和分析，結果表明，以上幾種動物均有BEV的攜帶，其中本地牛的攜帶率最高(76%)。2012年我國學者吳丹等[27]根據5′UTR基因建立了檢測BEV的TaqMan定量PCR方法，并對大量的臨床樣本進行了臨床檢測，檢測結果表明該檢測方法具有較好的特異性而且敏感性比病毒分離法高10倍。2015年朱彤[28]和2014年侯佩莉等[20]分別針對其3D 基因建立了RT-PCR和TaqMan定量PCR方法，兩者所建立的該方法與引起牛的病毒性腹瀉的其它幾種牛的病毒(牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛冠狀病毒(BCoV)等)均無交叉反應,前者所建立的方法檢出敏感度達7.13×10-1拷貝/μL，比常規PCR檢測方法高10倍，后者所建立的檢測方法的敏感度也較高，達10-1TCID50。血清學檢測試驗發展較緩慢，最近幾年有所增多，在2014年郭金玉等[29]利用北京某牛場牛腸道病毒2型(BEV-2) 分離毒株的VP1蛋白構建了BEV抗體的間接ELISA檢測方法。2015年朱彤等[28]通過擴增BEV的VP2基因并進行一系列的轉化、誘導表達、純化出重組蛋白制備了較高效價的多克隆抗體，為BEV的血清學診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎。2016年邢澤黎等[30]應用大腸桿菌表達純化的E種腸道病毒的 VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測BEV病原的雙抗體夾心ELISA 方法，該檢測BEV的抗原方法具有特異性、靈敏度高和快速等特點，并對吉林省不同地區的牛群感染BEV進行了病原流行病學調查，發現不同地區牛群的BEV感染率為8.16%～58.7%。

4 BEV致病機制的研究現狀

BEV的致病性有些爭議，有認為只引起輕度腹瀉或健康牛的隱性感染，致病性弱，也有認為可引起呼吸系統疾病、腹瀉、產奶量下降、睪丸炎、包皮炎、黏膜炎、流產、死胎、盲腸結腸炎等臨床癥狀[13]，這可能是由于不同血清型的病毒對不同組織的嗜性不同而引起的疾病也不同，其致病性機理還不是很清楚。由于其臨床癥狀在臨床實驗動物模型中很難被復制，因而BEV和機體之間的相互作用、致病機理等相關研究仍處于初步研究的階段。

1980年Yilma等[31]研究BEV感染細胞后，通過免疫熒光抗體標記后觀察病毒感染細胞的過程，來研究牛腸道病毒組裝和釋放的形態變化及發生過程，證實病毒通過囊泡釋放到細胞外，部分也存在于細胞質泡中。2011年Blas-Machado等[32]第一次使用BEV-1株通過回歸原動物實驗的方法感染犢牛并觀察BEV-1的致病機制，結果表明，感染組中觀察到了一定程度的腹瀉、呼吸窘迫及厭食等相似的臨床癥狀，但在對照組中也出現了腹瀉等現象，由于缺乏嚴格的對照動物導致該實驗不能夠準確的分析其致病機理，但其在某種程度上也可說明BEV-1株能夠感染犢牛并且可能具有與其它腸道病毒類似的致病機制。2014年Zhang等[33]獲得了新型BEV的分離株并利用50 μL/只的病毒量腹腔注射剛出生1d的乳鼠，結果表明可在其心、肝、肺、腸道以及排泄物中檢測的到病毒的存在，說明該病毒能夠引起呼吸道和消化道的感染。2015年蓋小春等[34]也利用BEV-E種的HY12建立了小鼠的動物感染模型，結果表明只有IRC系小鼠能夠成功感染該病毒株，但昆明小鼠和BALB/c不能。小鼠成功感染病毒后其部分實質器官和腸道組織都能夠出現程度不一的組織病理學的變化，如肺臟、肝臟、腦等器官內產生了大量的炎性細胞浸潤，部分組織的結構消失，腸道上皮細胞脫落，腸壁增厚等等。免疫組織化學方法在機體的實質器官和腸上皮細胞中檢測到了較多的BEV陽性細胞，表明該病毒株可以通過不同途徑感染IRC系小鼠，并可以在不同的器官、組織中進行病毒復制。這些試驗數據結果都為研究BEV的致病機制奠定了基礎。

5 小結

BEV是國內近幾年新發現的一種動物疾病，給養牛業造成了嚴重的經濟損失，我們國內的牛群中既有E種牛腸道病毒也存在F種牛腸道病毒的感染，且兩種血清型之間存在較大差異，給本病的分子流行病學的調查和確診造成了一定的困難。同時，BEV粒子的大小、形態與細小病毒的極為相似，應用電鏡觀察也常常造成誤診。目前關于BEV疾病的診斷和防治還是處于缺乏狀態。對于新型BEV的分離鑒定確定血清之后，多數BEV的致病機制、發病機理都還處于初步研究階段，動物模型的建立也還不夠完善，比如最佳的感染途徑和劑量、動物病例的完整復制、病理組織的變化分析等發病機理還不夠清楚。我國雖在近幾年有關注BEV的動態，但國內還沒有系統的統計和相對應的管理制度，因為BEV的感染可引起的臨床癥狀如發熱、咳嗽、腹瀉等，也會由于和替他病毒的混合感染引起流產、產奶量下降等；而且有的病毒株是隱性感染，但也有些毒株可引起動物的死亡，因而關于BEV的致病性也一直存在著爭議，對此，我們應該在今后的研究中努力完善這些不足。

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(編輯：李文平)

Research Progress on Bovine Enterovirus

HE Huan, ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China)

Bovine enterovirus has begun to gradually popular in recent years in China. It had discovered that many novel bovine enteroviruses, meanwhile there are lots of researchs on establishing of molecules and serotypes. In this study, the basic structures, isolation, detection methods, prevalence and pathogenesis of bovine enterovirus were introduced in detail, which provide a basis for further study of the epidemic status and control measures of bovine enterovirus in China.

bovine enterovirus; isolation; detection methods; pathogenesis

四川省科技計劃項目青年基金(2014JQ0044);西南民族大學中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(2016NGJPY10)

何歡,碩士研究生,從事動物病原分子生物的研究。

張斌。E-mail:binovy@sina.com

2016-10-21

A

1002-1280 (2017) 01-0063-06

S852.653