綿柔型白酒釀造用功能性細菌代謝典型風味化合物研究

張聰芝，張龍云，李燕榮，蒲春

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800)

綿柔型白酒釀造用功能性細菌代謝典型風味化合物研究

張聰芝，張龍云，李燕榮，蒲春

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800)

研究了綿柔型白酒釀造用功能性細菌風味化合物的代謝情況。確立了不同菌株代謝不同風味化合物優勢性能；并通過優化配方組合研究，建立了典型菌株混合發酵代謝典型風味化合物的最佳配比組合；進一步對比分析不同比例及不同發酵形式下的代謝產物的含量，明確了優化組合混合發酵在代謝四甲基吡嗪等典型化合物方面的優勢。

綿柔型白酒；功能性細菌；風味化合物；四甲基吡嗪

以洋河藍色經典系列白酒為代表的綿柔型白酒逐漸受到消費者的青睞[1-2]，綿柔型白酒釀造用功能性細菌是綿柔型調味酒釀造的關鍵，是綿柔型白酒風格形成的基礎。綿柔型白酒釀造用功能性細菌是經過定向選育的釀酒有益功能微生物，通過運用現代生物工程技術及設備用于釀酒生產[3-4]。一方面功能性細菌為嗜熱芽孢桿菌，能夠代謝產生以四甲基吡嗪、愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚等為主的典型風味化合物，四甲基吡嗪等典型化合物能夠為酒體提供焦香、烘烤香等堅果香氣[5]；同時，嗜熱芽孢桿菌代謝的酶系在高溫下能夠進一步推動美拉德反應進程，促進了芝麻香香氣成分及前驅物質的形成[6]。頂空固相微萃取-氣質聯用（HS-SPME-GC-MS）是近幾年發展起來的測定大曲、酒醅、發酵液風味物質的方法，相比傳統風味物質的提取、測定，具有快速、高效、無溶劑揮發等特點[7]。本研究利用頂空固相微萃取-氣質聯用的方法，對本公司生產用12株功能性細菌風味化合物形成情況進行了定性定量分析，確定了不同菌株代謝典型風味化合物的優勢；同時通過優化組合確定了代謝以四甲基吡嗪為主的典型化合物的最佳組合；通過風味化合物代謝的研究確定了功能性細菌代謝風味化合物的優勢，為促進制曲工藝的提升及進一步提高調味酒質量奠定了基礎，同時為綿柔型白酒生產及風格的形成奠定了基礎[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌株：實驗菌株為枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌等，均為本公司篩選并保藏的菌株。

試劑：葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、無機鹽、氫氧化鈉、氯化鈉等；儀器：PHS-3E臺式pH計，LDZH-200KBS立式滅菌鍋，DNP-9162A電熱恒溫培養箱，島津氣質聯用儀，HW-150C溫控振蕩培養箱，90-3恒溫雙向磁力攪拌器。

培養基：細菌平板及斜面培養基為牛肉膏、蛋白胨培養基；細菌種子培養基為葡萄糖、蛋白胨等培養基；細菌麩曲培養基為麩皮添加適量無機鹽培養基；種子培養基的滅菌條件為：121℃，滅菌20m in；發酵培養基滅菌條件為溫度121℃，滅菌20m in。

1.2 實驗方法

培養方法：細菌液體三角瓶種子培養方法：裝液量300m L/500m L三角瓶，取1環新鮮細菌于培養基中，置于特定條件下搖床培養。在1000m L三角瓶中進行固態麩曲培養；綿柔型生產用細菌曲采用現代化圓盤制曲設備進行控溫、通風、攪拌發酵培養；定期取樣檢測[3]。

分析方法：pH值采用全自動pH計測定；微量風味物質采用頂空固相微萃取聯合氣質聯用（HS-SPME-GCMS）進行定性定量分析[7]。

2 結果與討論

2.1 功能性細菌三角瓶固態發酵風味物質定性定量分析

2.1.1 功能性細菌固態發酵風味物質定性分析

通過純種液態培養功能性細菌種子液，然后接種到固態麩皮培養基中進行單菌種固態發酵，研究單個功能性細菌風味物質形成情況；運用頂空固相微萃取-氣質聯用的方法進行定性分析。

圖1 代表菌株146#吡嗪類化合物氣相色譜圖

經過分析可知，功能性細菌定性到的化合物數量和種類都較多，既有相同又有獨特的風味化合物：12株功能性細菌分別定性到30種、20種、30種、24種、27種、28種、28種、17種、27種、29種、38種、31種含量較多的風味化合物，風味化合物數量最多的是151#菌；功能性細菌代謝風味化合物主要集中在醛類、酮類、吡嗪類化合物、多元醇、烯醇類、芳香族化合物、呋喃類化合物及其他雜環化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中定性到較多的吡嗪類化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪（圖1）等，其中四甲基吡嗪可以賦予酒體焙烤香氣和焦香味；并且定性到吡嗪類化合物的前體2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在3#和152#菌株中定性到；3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）在1#、3#、35#、102#、109#、139#、150#和152#8株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加綿、甜、柔軟、細膩感[8]，3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠長后味，嗜熱芽孢桿菌可以代謝這些物質形成吡嗪類化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈創木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈創木酚等含量較高。

2.1.2 功能性細菌固態發酵典型風味物質定量分析

通過運用內標法計算，進一步對幾種典型風味化合物含量進行定量分析，結果見表1、圖2。

表1 功能性細菌典型風味化合物含量

圖2 代表菌株139#菌風味化合物氣相色譜圖

由表1可知，吡嗪類化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中產量相對豐富，四甲基吡嗪產量最高的是139#菌，為23.45×10-10g/g，其次是3#菌，為20.54×10-10g/g，146#菌為20.13×10-10g/g，109#菌為19.99×10-10g/g；β-苯乙醇在12株菌中均定性定量檢測到，其中151#菌產量最高，為1.26×10-10g/g，3#菌為0.66×10-10g/g，35#菌為0.54× 10-10g/g；愈創木酚產量最高的是146#菌，為11.04×10-10g/g，其次是109#菌，為2.96×10-10g/g；4-乙烯基愈創木酚產量最高的是146#菌，為44.86×10-10g/g，其次是139#菌，為35.28×10-10g/g。β-苯乙醇具有濃郁的水果和蜂蜜的香氣，能夠賦予酒體自然發酵的香氣，愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚則可以提供較多的堅果類香氣，賦予酒體成熟的焦香、醬香，可以賦予調味酒較多的復合感、幽雅感。

2.2 功能性細菌三角瓶固態發酵典型風味物質配方組合研究

通過以上定性定量的綜合分析，鑒于139#、146#高產四甲基吡嗪及3#高產三甲基吡嗪的性能，151#高產β-苯乙醇性能，基于通過增加139#、3#、146#菌株比例提高四甲基吡嗪含量，增加146#、139#菌比例，提高4-乙烯基愈創木酚含量，增加151#比例，提高β-苯乙醇含量，增加152#比例，提高2,3-丁二醇含量，結合前期1#、109#、151#等發酵性能的優勢，選取1#、3#、109#、139#、146#、151#進行優化配方組合研究。

2.2.1 功能性細菌三角瓶固態發酵典型風味物質配方組合設計

首先純種培養各株菌種子液，按照配方優化組合（表2）方案，按比例接種到三角瓶固態發酵培養基進行發酵，探尋功能微生物代謝以四甲基吡嗪為主，三甲基吡嗪、愈創木酚等典型風味物質的最佳組合，分別對混合發酵結束的功能性細菌麩曲的四甲基吡嗪、三甲基吡嗪含量等典型風味化合物指標進行測定，結果見表3。

表2 配方組合研究設計

由表3可知，三甲基吡嗪產量最高的組合是組合5，為1.67×10-10g/g，四甲基吡嗪產量最高的組合是組合8，為3.49×10-10g/g，愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚產量最高的組合是組合2，為4.51×10-10g/g；其中組合8（1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26）在代謝四甲基吡嗪方面最為有利，四甲基吡嗪可以賦予酒體焙烤香氣和焦香，選取優化組合8并進行比例化整（即比例A，1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10），確定選取1#、3#、139#、146#、151#共5株菌進一步進行典型風味化合物混合發酵研究。

表3 功能性細菌10種組合典型風味化合物含量

2.2.2 功能性細菌三角瓶配方組合發酵典型風味物質驗證分析

通過功能性細菌單菌株發酵及配方組合混合發酵確定了在代謝典型風味物質方面的特征，現通過對比研究3種比例混合發酵在代謝四甲基吡嗪等典型風味物質方面的性能，即比例A：經過化整的優化組合8（即5株強化細菌組合1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）；比例B：10株細菌（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#）等比例；比例C：5株強化細菌組合（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）與7株細菌9∶1混合發酵；發酵結束運用頂空固相微萃取聯合氣質聯用儀測定典型風味化合物含量，結果見表4。

表4 A/B/C 3種不同比例細菌麩曲典型風味化合物比對

由表4可知，比例A在四甲基吡嗪代謝方面具有非常強的優勢性能，48 h代謝產量達到130.85×10-10g/g，即化整后的組合8中的5株菌以比例A（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）進行的固態混合發酵，代謝四甲基吡嗪方面確實具有優勢性能，與2.2中趨勢具有一致性，但是其產量的37倍多，同時4-乙烯基愈創木酚含量達到68.94×10-10g/g。

2.3 不同發酵條件下功能性細菌典型風味物質綜合分析

對功能性細菌純種發酵、配方組合混合發酵、強化菌株混合發酵，及實際生產中的細菌曲、混合曲氣質聯用檢測的典型風味物質進行綜合分析，結果見表5。

表5 不同形式下功能性細菌風味物質含量

由表5可知，就典型性風味化合物四甲基吡嗪而言，單株細菌固態麩曲發酵139#菌代謝四甲基吡嗪能力在12株菌中最強，為23.45×10-10g/g，進行配方組合優化時四甲基吡嗪含量最高的是組合8（即1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26），四甲基吡嗪產量達到3.49×10-10g/g，低于純種發酵條件下139#的產量，說明功能性細菌之間的交互作用影響典型風味化合物的代謝，但是在比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合發酵時四甲基吡嗪產量達到130.85×10-10g/g，是純種139#菌發酵的6倍，是6株菌混合發酵即組合8的40倍，說明適宜菌種與適宜比例的混合發酵對代謝四甲基吡嗪方面具有一定優勢，同時也可以說明109#菌對混合發酵的四甲基吡嗪代謝具有一定的抑制作用；并且比例A混合發酵情況下其他典型風味化合物的含量如三甲基吡嗪、愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚都達到了最高水平。實際生產中的細菌曲（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪產量達到51.33×10-10g/g，而實驗室條件下（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪產量高達113.75×10-10g/g（表4），后者是前者的2.2倍，說明實際生產中和實驗室條件下四甲基吡嗪產量差距較大，同樣的菌種、同樣的比例在實際生產中由于生產的不可控因素影響了四甲基吡嗪等風味物質的代謝；同時，實際生產中的混合曲四甲基吡嗪產量為7.60×10-10g/g，是實際生產條件下細菌曲的1/6.8倍，與復混比例基本具有一致性。

3 結論

本實驗研究了綿柔型白酒釀造用功能性細菌風味化合物代謝情況：首先，通過對12株功能性細菌單菌株固態發酵產風味化合物的定性定量分析可知，功能性細菌代謝產生的風味化合物數量和種類非常豐富，主要集中在醛類、酮類、吡嗪類化合物、多元醇、烯醇類、芳香族化合物、呋喃類化合物及其他雜環化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中吡嗪類化合物主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2, 4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，其中139#菌代謝四甲基吡嗪能力在12株菌中最強，為23.45×10-10g/g，確立了不同菌株代謝不同風味化合物優勢性能；其次，通過對選取的6株優勢菌株進行混合發酵配方組合研究以及不同比例情況下的對比驗證，確定了比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合發酵時四甲基吡嗪產量最高，為130.85×10-10g/g，4-乙烯基愈創木酚達到68.94（×10-10g/g），建立了典型菌株混合發酵代謝典型風味化合物的最佳配比組合；進一步通過對不同發酵條件下功能性細菌典型風味物質綜合分析可知，適宜菌種適宜比例的混合發酵在代謝四甲基吡嗪等典型風味化合物方面具有一定優勢，比例A代謝三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚以及β-苯乙醇均達到了最高水平，建立了典型菌株混合發酵代謝典型風味化合物的最佳配比組合。

通過本研究確定了功能性細菌在純種發酵和組合發酵代謝以四甲基吡嗪為主的典型風味化合物的優勢，為促進綿柔型白酒釀造用復合功能曲制曲工藝的提升及改進奠定了基礎，對綿柔型白酒調味酒及綿柔型白酒生產具有重要意義。

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Metabolites of Functional Bacteria for Soft-Flavor Baijiu Production

ZHANG Congzhi,ZHANG Longyun,LIYanrong and PU Chun
(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

In this study,the metabolites of functional bacteria for soft-flavor Baijiu production were investigated.The metabolic flavoring compounds from different bacteria strains were identified.Through the analysis of the ratio of different flavoring compounds,the optimum ratio of different bacteria strains for mixed fermentation was determined.Furthermore,the content of the metabolic flavoring compounds under different fermenting conditions was com pared.The preponderance of metabolic tetramethyl pyrazineetc.in mixed fermentation w as revealed.

soft-flavor Baijiu;functional bacteria;flavoring compounds;tetramethyl pyrazine

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）02-0040-04

10.13746/j.njkj.2016152

2016-05-03；

2016-12-09

張聰芝（1986-），男，山東高唐人，碩士研究生，主要從事釀酒微生物選育、發酵性能及風味化合物研究，E-mail：congw dyx@126.com。

優先數字出版時間：2017-01-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170104.1401.002.htm l。