大鱗副泥鰍生長優秀家系篩選以及基因型對生長性能的影響

潘文賢，李彩娟，王國成，葉竹青，凌去非

（1.蘇州大學水產研究所，江蘇蘇州 215123；2..常熟市水產技術推廣站，江蘇常熟 215500）

大鱗副泥鰍生長優秀家系篩選以及基因型對生長性能的影響

潘文賢1，2，李彩娟1，王國成1，葉竹青1，凌去非1

（1.蘇州大學水產研究所，江蘇蘇州 215123；2..常熟市水產技術推廣站，江蘇常熟 215500）

本試驗構建了11個大鱗副泥鰍家系，并進行了生長性能優秀家系的篩選，利用生長相關SSR標記對各家系進行生長性狀與基因型相關分析，探究不同基因型對生長性能的影響。結果顯示AB2013F-7、AB2013F-89、AB2013F-45等家系的體質量、體長和全長均值顯著（P＜0.05）大于其他家系，其中AB2013F-7家系各生長指標均值最大；以上三個家系117 d內的絕對增重率也表現最好，分別為0.068、0.051和0.048 g/d。對各家系基因型進行分析，顯示各家系所擁有優勢基因型的數量與生長性狀均值大小成正相關，含生長相關標記優勢基因型的數量越多，家系的生長性能表現越優秀。

大鱗副泥鰍；家系；生長；基因型；微衛星

家系選擇（family selection）是一種選擇育種策略，即通過建立家系，對家系后代的經濟性狀進行有目的的選擇和比較分析，是水產動物種質改良的重要途徑之一[1]。然而傳統的家系選育育種周期長，耗時耗力，需要經歷十多代的交配繁殖來獲得相關純系或純種[2-3]，通過分子標記輔助選擇則可縮短育種進程。目前，國內外學者對牙鲆[4]、鮑[5]、馬氏珠母貝[6]等進行了分子標記輔助育種相關研究，改善了相關水產動物抗病性以及生長等性狀。

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus Sauvage）是鰍科小型重要經濟魚類，也是近年來養殖規模增長較大的魚類之一，其味道鮮美，營養價值較高，在國內外市場也廣受歡迎。目前分子標記輔助家系選育工作在相關水產動物中得到了一定的應用[7-9]，但國內外均未見大鱗副泥鰍家系選育的相關報道。本研究通過建立大鱗副泥鰍家系，并對家系父母本基因型進行分析，預測子代基因型情況，探討優勢基因型與家系生長性狀的關系，為大鱗副泥鰍分子標記輔助選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 家系構建

試驗用大鱗副泥鰍由蘇州奧博生物科技有限公司泥鰍養殖基地提供。2013年6月6日挑選來自洪澤湖的野生大鱗副泥鰍親本11組，按照雌雄配比為1∶1進行人工催產，各組親本分別放于獨立水族箱中產卵，產卵后，撈出各家系父母本，剪鰭條保存于95%的乙醇中備用。1 d后魚苗孵化出膜，2 d后平游，投喂開口餌料。10 d后將11家系移至設置在同一池塘的11個網箱中進行培育，網箱規格為2 m×1m×1 m，網箱網目為80目，每個家系密度控制在1 000尾，培育期間，保持各家系的生長環境盡可能相同。于2013年7月21日再次對試驗網箱中各家系密度進行控制，每個家系密度為55尾，并測量各家系的平均初始體質量。2013年11月15日，每個家系撈取30尾，進行生長指標（體長、體質量和全長）測量。

1.2 父母本基因組DNA提取

60尾大鱗副泥鰍基因組DNA的提取參照標準酚-氯仿抽提程序進行。紫外分光光度計測定DNA樣品的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳測定DNA基因組的完整性，稀釋DNA至50～100 ng/μL，-20℃保存備用。

1.3 引物合成和PCR反應

采用的微衛星標記由本實驗室第二代測序技術自行開發獲得[10]，由上海生工生物工程有限公司合成引物，11個標記是（表1）本實驗室前期已篩選的大鱗副泥鰍生長相關微衛星標記。PCR擴增采用20μL體系：2×Mix 10μL，H2O 7μL，DNA 1μL，上下游引物各1μL（10μM）。整個反應28個循環，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，各對引物的特異退火溫度見表1。首次循環前先預變性3 min，最后一次循環結束后72℃延伸5 min。

1.4 電泳及染色

PCR擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為0.5×TBE，上樣1μL，150 V電泳80 min。參照改良的銀染方法檢測微衛星帶型[10]，染色10min，水洗2次（1 min/次），顯色液預冷，顯帶后水洗；采用凝膠成像系統（BIO-RAD）拍照并分析帶型。

1.5 數據處理

表1 11對大鱗副泥鰍微衛星引物信息

采用SPSS 20.0對11個大鱗副泥鰍家系體質量、體長、全長均值進行單因素方差分析（One way ANOVA），利用最小顯著極差法（least significant difference，LSD）對各個家系間的測量數據進行多重比較；計算各家系絕對增重率。

絕對增重率AGRW（g/d）=（W2－W1）/（T2－T1）式中W1、W2分別為T1和T2時的體質量。

根據各家系父母本基因型，結合試驗1中的各生長相關SSR標記的優勢基因型，分析優勢基因型對家系生長性能的影響。

2 結果

2.1 大鱗副泥鰍不同家系間生長性能比較

11個家系全長、體長和體質量的平均值、標準差見表2。各家系全長大小關系為：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-74＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-70＞AB2013F-77＞AB2013F-36＞AB2013F-81；體長大小關系為：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-74＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-77＞AB2013F-70＞AB2013F-81＞AB2013F-36；體質量大小關系為：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-74＞AB2013F-81＞AB2013F-70＞AB2013F-77＞ AB2013F-36。由此可見，AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45家系的全長、體長以及體質量均值為所有家系中最高的。通過LSD多重比較發現AB2013F-7號家系全長、體長顯著（P＜0.05）大于除AB2013F-89號家系外的其他所有家系，而其體質量顯著（P＜0.05）大于所有家系；AB2013F-89和AB2013F-45的全長、體長以及體質量也與其他家系具有統計學意義差異（P＜0.05）（見表2），其他家系之間各指標無統計學意義差異。

同時，本研究也采用絕對增重率來評價家系的生長性能（見表2），AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45三個家系117 d內的絕對增重率分別為0.068 g/d、0.051 g/d、0.048 g/d，為11個家系中最高的三個，其中AB2013F-7號家系絕對增重率是AB2013F-36家系的2.8倍。綜合多重比較結果與絕對增重率計算結果發現，家系AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45生長速度顯著快于其他家系，可確定為生長快速家系。

2.2 11個大鱗副泥鰍家系父母本基因分型

采用11個SSR引物對11個家系父母本進行基因分型，并推測出了子代基因型。本研究中的優勢基因型為前期已篩選到的優勢基因型，基因型統計發現11個家系表現優勢基因型的SSR標記個數為1-6個不等（表3），其中AB2013F-3、AB2013F-7家系有6個標記在子代中具備表現優勢基因型的機會，為子代優勢基因型含量最多的兩個家系，其中AB2013F-7家系的表型值也是所有家系中最高的；表現優勢基因型最少的家系為AB2013F-27家系，僅有1個標記在子代中表現優勢基因型，另外家系AB2013F-36、AB2013F-70、AB2013F-74產生優勢基因型的標記在3個以內，AB2013F-27、36、70和74這四個家系其產生優勢基因型數量比3個優秀家系的優勢基因型數量低，且這4個家系各生長指標均低于3個優秀家系。但是結果中標記數量多少與生長性能的好壞并不是一一對應的，可能是主效基因型與微效基因型對生長影響不同造成的，也可能是父母本基因型在子代中因分離組合導致產生特定基因型個體的概率不同而產生的結果。

表2 11個大鱗副泥鰍家系絕對增重率以及生長性能比較

3 討論

3.1 優秀家系選擇

相關學者認為魚類生活史的早期階段生長速度最快，在此階段，魚類生長易受到環境以及自身遺傳基因的影響，產生生長上的差異[11]。部分學者對大鱗副泥鰍同科的泥鰍進行了研究，認為泥鰍在生長初期遺傳差異造成表型差異表現較為顯著[12-13]，故本研究采用了6月齡大鱗副泥鰍進行表型值測定。本試驗中各家系生存環境和飼喂條件均一致，但11個家系生長差異較大，說明各家系遺傳基礎的不同導致了生長性能的差異。AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45三個家系生長速度較快，可以作為進一步選育的基礎群體。

3.2 各家系子代基因型效應對生長影響分析

分子標記聚合育種是將幾個主效基因的優勢基因型聚合到一個個體上的技術[14]，優勢基因型的聚合對于動物品種性狀的改良與提升具有很大的促進作用。相關學者在豬[15]產仔數、中國荷斯坦牛[16]產奶性狀的優勢基因型聚合上進行了研究，研究表明基因聚合能夠有效改良目標性狀。徐磊[17]等采用8個生長相關分子標記進行了生長優勢基因型的數量與大口黑鱸生長速度相關性研究，發現生長優勢基因型的數量與生長速度呈正相關。本研究發現各家系能表現優勢基因型數量與生長性狀均值大小有一定的關系，例如AB2013F-7家系生長速度最快，其優勢基因型數量也最多。但也存在例外情況，如AB2013F-3家系有6個優勢基因型，比AB2013F-89要多，但生長指標卻低于后者，推測原因之一可能是相關標記優勢基因型在子代的表現概率大小不同，如在普通家系AB2013F-3家系中，Pda48的優勢基因型BF表現概率為50%，而在優秀家系AB2013F-89中為100%；還有可能是主效基因與微效基因相互作用的結果，主效基因與微效基因對性狀的貢獻大小不同，導致表型值的大小與優勢基因型數量不呈直線正相關，例如優秀家系AB2013F-89生長相關標記的數量僅為4個，但Pda48的BF基因型在此家系中表現概率為100%，為所有家系中最大概率，推測BF基因型對生長指標貢獻值較大的緣故。AB2013F-7家系優勢基因型數量與AB2013F-3家系相同，但是標記的種類和各標記的表現概率不同，這可能是導致兩家系生長狀況差異的原因。Pda261的優勢基因型在AB2013F-7家系中表現概率為100%，在AB2013F-3家系中為50%，而Pda316的優勢基因型在AB2013F-3家系中表現概率為100%，在AB2013F-7家系中為50%，但是AB2013F-7家系表型值顯著大于AB2013F-3家系，推測可能Pda261位點連鎖基因對生長的貢獻值大于Pda316。

Pda247、Pda315在11個家系父母本中沒有相關優勢等位基因，但可以通過在另外的群體（混合選育群體）中選擇具有優勢等位基因的個體與家系個體交配，從而引入優勢基因型。有的家系雖未表現優勢基因型，但是卻含有組成優秀基因型的等位基因，也具備育種潛力，如Pda371在普通家系AB2013F-3子代中為AB基因型，如果家系內個體交配，則可產生含優勢基因型AA個體。在非優勢家系中，一些標記也能產生優勢基因型，優勢家系中也不是全部標記都可以產生優勢基因型，主要因為生長相關標記屬于數量性狀，其最終表現需要多基因的協同作用，主效基因與微效基因對生長速度的影響效果差別較大，僅從有無優勢等位基因及優勢基因型的數量多少來判斷家系的好壞有一定的局限性，因此，后期研究應重點加強主效基因標記優勢基因型的甄別和富集以進一步加快良種選育進程。

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湖北荊門發布通知2017年年底前全部拆除全市養殖網箱

記者從2016年12月擬訂的《關于取締湖庫圍欄圍網網箱養殖的實施方案》上了解到，關于湖庫圍欄圍網網箱養殖的目標為：通過規范整治，在荊門市境內實現水域無珍珠養殖、湖庫無圍欄圍網（網箱）、水庫無投肥投餌養殖的“三無”目標。到2016年12月底前全市拆圍達到30%以上，2017年12月底以前全面拆除完成；全市湖庫水質明顯改善，飲用水源區湖庫水質達到Ⅲ類標準以上。到2020年，所有湖庫水質全部達標。

根據方案，從現在起至2017年6月，全面啟動拆圍工作。從2017年6月至8月開展聯合整治。嚴格控制在湖庫集水區范圍內新增污染物排放設施。對公共水域水面漁業養殖權和捕撈權對外承包，在2017年8月底前全部收回，并注銷《水域灘涂養殖證》。對不按照規范時間拆除的，由公安、環保、水務、水產等具有執法權的單位聯合予以強制拆除。從2017年9月至11月，對湖庫進行全面巡查檢查，防止反彈，對已經治理仍然進行珍珠養殖、圍欄圍網（網箱）養殖的依法予以處罰，發現一起查處一起。

（www.bbwfish.com）

Screening fast-grow ing fam ilies and analysis of the effect of genotypes on grow th of Paramisgurnus dabryanus

Pan Wenxian1，LiCaijuan2，W ang Guocheng2，Ye Zhuqing2，Ling Qufei2
（1.Fisheries Institute of Soochow University，Suzhou 215123，China 2.Fisheries Technology Extension Station of Changshu city，Changshu 215500，China）

Eleven families of large-scale loach were established and fast-growing families were screened by comparing growth traits among the families，and growth-associated SSRswere used to analyze the effect of genotype on growth by genotyping.The results bymultiple comparisons showed that：themean value of body length，total length and body height of family AB2013F-7，AB2013F-89 and AB2013F-45 were significantly greater than other families（P＜0.05）；with family AB2013F-7 growing fastest in all three growth traits.During the 117 days of cultivation，the three families with the highest daily weight gain were AB2013F-7，AB2013F-89 and AB2013F-45（0.068 g/d，0.051 g/d and 0.048 g/d respectively）.The results of genotyping of 11 pairs of parents showed that the growth rate of each family were in accord with the number of growth associated dominant genotypes.The number of dominant genotypes of each families and the mean of growth trait was positive correlation. Themore dominantgenotype the family had，the faster the growth rate of the family.

Paramisgurnus dabryanus；family；growth；genotype；SSR

Q173

：A

：1004-2091（2017）01-0001-06

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.001

2016-04-29）

江蘇省科技廳農業重大科技支撐項目（BE2012354）；江蘇省水產三項工程項目（PJ2011-62）；江蘇省農業自主創新項目[CX（13）2042]

潘文賢（1958-），男，工程師，研究方向水產養殖.E-mail：PWX8210@163.com

凌去非，教授.E-mail：lingqf@suda.edu.cn