江蘇省河蟹主養區微孢子感染情況調查報告

趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇南京 210017）

江蘇省河蟹主養區微孢子感染情況調查報告

趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇南京 210017）

2015年7月江蘇省興化及周邊鹽城地區河蟹養殖大范圍爆發河蟹肝胰腺壞死病，經調查研究確認為微孢子蟲感染。采用PCR的方法對江蘇省河蟹主要養殖區養殖塘口進行抽樣調查，對所采集的河蟹標本進行微孢子蟲感染情況調查。結果表明：抽樣的八個河蟹主要養殖區，均有微孢子蟲感染情況，其中以興化和鹽城的河蟹微孢子蟲感染情況最為嚴重。

河蟹；感染；微孢子蟲；調查報告

河蟹學名為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），肉味鮮美，營養豐富，是我國名貴的淡水養殖品種之一。同時河蟹也是蟹類養殖中病害最為嚴重的一種，每年4—10月均有發病，7—9月是發病的高峰季節[1]。

微孢子蟲（Microsporidian）作為一種真核生物專門寄生于細胞中，是一類古老的細胞內寄生物。宿主范圍比較廣泛，能夠感染人類、水生甲殼類以及昆蟲等多種生物。自1857年Nageli首次發現家蠶微粒子病病原生物Nosema bombycis后,人們對其進行了大量研究，特別是近年來，免疫缺陷患者體內微孢子蟲的發現，更加引起了生物學界和醫學界的廣泛關注[2]。微孢子蟲種類繁多，在顯微鏡下觀察包囊形狀也各異，如球形、紡錘形和橢圓形，其中以球形較為常見[3]。國內對于水生動物微孢子蟲的研究較少，主要集中在家蠶的微孢子蟲的研究上。然而，近些年來在水產養殖中頻發微孢子蟲病，嚴重威脅著一些經濟水產動物的養殖[4]。

河蟹的養殖從20世紀80年代以來飛速發展，進入21世紀后，其產業得到了迅猛的發展[5]。江蘇作為河蟹的主要養殖區，年產值可達到200億，成為支撐江蘇水產養殖的重要支柱。河蟹一旦感染疾病，在發病初期癥狀較輕，甚至不表現出明顯癥狀，一旦蟹病大規模流行，就較難控制[6]。然而自2015年入夏后，興化和鹽城等地出現大批量養殖河蟹死亡的情況，主要表現為活力下降，不進食，開蟹蓋后可見內臟及肝胰腺發白、壞死等情況，也就是養殖戶俗稱的“水癟子”病，經研究表明為微孢子蟲感染所致。因而本調查采用丁正峰等[7]建立的河蟹微孢子蟲PCR檢測方法對江蘇省其他河蟹主要養殖區微孢子蟲感染情況進行抽樣調查。

1 材料及方法

1.1 樣本采集

本次調查研究樣品采集時間為2015年7—11月，采集地點是江蘇省南京、常州、蘇州、泰興、無錫、鹽城、揚州、鎮江等地的河蟹養殖塘口，每個地方挑選2~4個不同的養殖戶，每個養殖戶采集河蟹30只，規格大約50 g每只，具體樣本采集情況見表1。江蘇省河蟹養殖方式主要為精養模式，塘口養殖前采用生石灰潑灑消毒，放苗時間一般為2月下旬，放養的蟹種規格比較齊全，體質強壯，活動性強，無明顯可見病害。所有樣品采集時均活力旺盛，采集后采用不同容器分裝，采集當天帶回實驗室進行處理，處理時所采集樣本均處于存活狀態。

表1 微孢子蟲普查地區分布情況表

1.2 樣本處理

樣本實驗室處理時，分別標注采集地點和養殖戶，分離河蟹肝胰臟用于實驗研究，部分河蟹開殼后可見明顯肝胰腺有發白現象，取樣時方法嚴謹，防止不必要的交叉感染。

1.3 檢測方法

根據需要配制實驗所需裂解液（100 mmol/L NaCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，25 mmol/L EDTA，pH值8.0，2%SDS，0.5%N-laurylsar-cosine；0.5 mg/mL蛋白酶K）；然后取河蟹肝胰臟100 mg于離心管中，使其破碎，加1 m L裂解液，混合均勻后65℃水浴1 h，加入5 mol/LNaCl，使得NaCl最終濃度為0.7 mol/L，緩慢加入10%體積的CTAB/Na－Cl，混勻后65℃水浴10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混均抽提，無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，干燥后DNA即可溶于0.1×TE緩沖液中，放于4℃貯存。

實驗室檢測采用的PCR檢測方法：上游引物為MF1：5'-CCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3'，下游引物為MR1：5'-GACGGGCGGTGTGTACAAA-3'，以被測樣本DNA為模板，以MF1/MR1為正向和反向引物，進行片段擴增，PCR反應體系為引物MF1（10mM）0.5μL，引物MF2（10mM）0.5μL，EX 10X Buffer2μL，dNTPs（2.5 mM）2μL，EX Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2μL，模板DNA1μL，去離子水13.8 μL，總體積為20μL。反應條件為：95℃變性4 min；接著35個循環的95℃1 min，58℃30 s，72℃1min；最后是72℃延伸5min，4℃保存。

PCR反應結束后，取10μL反應產物，以DNA Ladder作為分子量標準在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，凝膠成像系統拍照觀察，當陰性對照無條帶，陽性對照和樣品均在931 bp大小處出現條帶，即可判定為陽性。

2 結果與分析

調查結果顯示，江蘇省河蟹主要養殖區微孢子蟲感染普遍存在，在普查的13個縣（市、區）共33個養殖戶中，共抽取中華絨螯蟹990只，其中有449只感染微孢子蟲，陽性率達到45%，其中興化的感染率最高達到77%，其次為鹽城感染率達到68%，具體感染情況見表2。

微孢子蟲普查地區具體地理位置如圖1所示，采集位置分別為南京、常州、蘇州、無錫、泰州、鹽城、揚州及鎮江，河蟹的主要養殖區集中在江蘇省蘇南地區，并且各個地區均查出微孢子蟲感染，尤其以鹽城和泰州的感染較為嚴重。

3 小結

從本次調查報告可以看出，在江蘇省河蟹的主要養殖區，均有微孢子蟲感染情況存在，尤其是興化市和鹽城市，微孢子蟲感染率較高，這也和2015年河蟹“水癟子”病發病呈現正相關性。河蟹微孢子蟲大范圍感染，部分專家認為可能與近年來大規模養殖，水質污染嚴重有關。個別養殖戶為了私人利益，違背繁殖規律，早育早繁，導致蟹苗的抗病力差，成活率低[8]。河蟹養殖密度過高必然會導致投餌量、蟹體的排泄物及水中的有機質增加，從而也為微孢子蟲的傳播創造了條件[9]。同時，由于養殖密度的加大，養殖水體內源性污染加重，病原微生物大量滋生，養殖環境呈現惡化趨勢[10]。養殖環境的變化以及河蟹本身抵抗力的下降造成病害大范圍傳播，從而促使養殖戶不規范的使用藥物進行治療，最終形成一個惡性循環。

因而，制定一個科學合理的選藥和用藥制度對于河蟹的養殖具有重要的意義。養殖動物長期處于不良環境中，機體易受到損傷，病害發生頻率增加

[11]。目前河蟹的許多傳染性疾病因缺乏相關的防治對策的研究而未能得到及時防治，造成了巨大的經濟損失[12]。針對河蟹微孢子蟲病，目前尚無有效的治療方法，但是可以按照殺滅寄生蟲的方法給予適當的治療，放養前要徹底清塘消毒、把好蟹種質量關、合理控制放養密度、加強飼養管理；在蛻殼處于“軟殼”階段時，密度不要過大，以免加重互相打斗[13]；使用無公害藥物定期或不定期地進行水體消毒，也可使用微生態制劑來改善和穩定池塘環境[14]。還可以從提高河蟹抗病力入手，針對河蟹飼料添加營養因子，提高其抗病力，從而抵抗微孢子蟲的感染。

表2 2015年7月—2016年1月江蘇省中華絨螯蟹微孢子蟲普查情況

圖1 微孢子蟲普查地區地理位置分布圖

[1]楊先樂，黃志華，陳力.中華絨螯蟹病害的流行態勢及其對產業發展的思考[J].淡水漁業，2010（40）：74-79.

[2]Despoptes-Livage I.Human microsporidiosis and AIDS：recent advance[J].Parasite，1996（3）：107-113.

[3]王元，房文紅，周俊芳，等.脊尾白蝦肌肉微孢子蟲病的病原和病理分析[J].上海海洋大學學報，2013，22（5）:726-733.

[4]Wu H B，Wu Y S，Wu Z H.Occurrence of a new microsporidium in the abdominal cavity of Epinephelus akaara[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，2005，29（2）：150-154.

[5]農業部漁業局.中國漁業年鑒：2008[M].北京:中國農業出版社，2008.

[6]徐海圣，舒妙安.中華絨螯蟹疾病研究進展[J].漁業現代化，2000（4）:12-14.

[7]Ding Z，Meng Q，Liu H，et al.First case of hepatopancreatic necrosis disease in pond-reared Chinesemitten crab，Eriocheir sinensis，associated withm icrosporidian[J].Journal of Fish Diseases，2016，11（15）：1-9.

[8]谷孝鴻，趙福順.長江中華絨螯蟹的資源與養殖現狀及其種質保護[J].湖泊科學，2001，13（3）：267-271.

[9]沈南平.河蟹養殖業的現狀分析與思考[J].漁業致富指南，2005（4）：20-21.

[10]王海表.淺析河蟹養殖存在的問題及發展對策[J].漁業致富指南，2009（3）：12-13.

[11]宋遷紅.目前我國河蟹養殖業存在的問題及發展方向[J].科學養魚，2001（2）：5-8.

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[13]金珊，李政，陳寅兒，等.梭子蟹養殖中的一種新疾病[J].水產養殖，2003，24（6）:24.

[14]陳寅兒，王國良，金珊，等.三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理變化研究[J].海洋科學，2008，32（5）：36-39.

Investigation report ofm icrosporidian infection on Chinese m itten crab in Jiangsu main cultivation areas

Zhao Yanhua，Liu Hongyan，Ding Zheng feng，Sun Meng ling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Chinesemitten crab；infection；microsporidian；investigation report

S945

：A

：1004-2091（2017）01-0011-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.003

2016-05-23）

河蟹“水癟子”病防控關鍵技術研究與應用示范（Y2016-25）

趙彥華（1986-），女，研究實習員，主要從事水產病害研究.E-mail：njzhaoyanhua@163.com

薛暉（1968-），男，研究員級高級工程師.E-mail：jsxuehui@163.com

Abstradt:An epidemic of hepatopancreatic necrosis disease（HPND）occurred in Chinese mitten crab in Xinghua and Yancheng of Jiangsu province in July，2015.We confirmed it was microsporidian infection caused the HPND after some researches.We used PCR method to know the infection on Chinesemitten crab in Jiangsu main cultivation areas and completed an investigation report.The results showed that the crabswere infected by microsporidian in all the eightareas，especially in Xinghua and Yancheng.