生活垃圾填埋場對河流抗生素抗性基因的影響

黃福義,安新麗,2,李 力,歐陽緯瑩,2,李 虎,2,蘇建強*(.中國科學院城市環境研究所,城市環境與健康重點實驗室,福建 廈門 602；2.中國科學院大學,北京 00049；.麗江市環境監測站,云南 麗江 67400)

生活垃圾填埋場對河流抗生素抗性基因的影響

黃福義1,安新麗1,2,李 力3,歐陽緯瑩1,2,李 虎1,2,蘇建強1*(1.中國科學院城市環境研究所,城市環境與健康重點實驗室,福建 廈門 361021；2.中國科學院大學,北京 100049；3.麗江市環境監測站,云南 麗江 674100)

為研究生活垃圾填埋場對河流抗生素抗性基因的影響,采用高通量熒光定量 PCR技術對廈門市某垃圾填埋場附近河流水中的抗生素抗性基因的多樣性和豐度進行了分析.結果表明,垃圾填埋場背景點河水檢測到了57種抗性基因,下游河流水檢測到了158種抗性基因,下游河流150種抗性基因顯著富集(P ＜ 0.05),其中增加倍數最大的是磺胺類抗生素抗性基因dfrA1,達2299倍,沿河而下,特別是在垃圾填埋場下游河流水中,抗生素抗性基因檢出率、富集倍數都顯著增加,抗性基因污染加劇;可移動元件與抗性基因顯著相關;生活垃圾填埋場可能對河流水抗生素抗性基因的多樣性和豐度產生了影響.

生活垃圾填埋場；河流；抗生素；抗生素抗性基因

抗生素抗性基因(ARGs)被科學家認為是一種新型的環境污染物[1],逐漸引起了世界各國和各種環境健康組織的關注.與傳統的化學污染物不同,抗生素抗性基因由于其固有的生物學特性,例如可在不同細菌間轉移和傳播甚至是自我擴增,可表現出獨特的環境行為[2].各種環境介質中,包括豬場土壤[3],制藥廢水[4],流經市區的河流水體[5],河流沉積物[6],施用豬糞水稻土[7],垃圾滲濾液[8],甚至在城市自來水[9]中也檢測出環境抗生素抗性基因.越來越多的研究表明,致病菌耐藥性與環境微生物抗性和抗生素抗性基因有關[10-13].在醫療行業、畜牧養殖行業存在著抗生素過度和使用不當現象,抗生素使用劑量不斷加大和抗生素使用種類不斷增加,環境中的抗生素殘留以及抗生素抗性微生物不斷被發現,并因此形成了一個惡性循環,并可能導致人類無藥可用的境地,對人類健康造成了極大的健康風險.世界衛生組織(WHO)在2015年11月16～22日開展了首個世界提高抗生素認識周的活動,并把活動周主題定為:慎重對待抗生素.

生活垃圾填埋場是城市生活垃圾、污水廠的處置污泥、垃圾焚燒廠飛灰殘渣等固體廢棄物的主要的最終堆放場所.受人類生產生活的影響,這些固體垃圾中往往有抗生素殘留以及含有抗生素抗性的微生物[14].同時垃圾填埋場從開始垃圾填埋到填埋場封場后一直持續地產生滲濾液.垃圾滲濾液是伴隨垃圾填埋場運營整個生命周期的二次污染物,具有污染物成份復雜,污染物濃度高的特點,處理工藝復雜,垃圾濃縮液深度處置難,整體處理成本高等棘手問題,也是目前水處理研究的難題之一[15].通過研究垃圾滲濾液中四環素類抗生素、磺胺類抗生素等抗生素極其抗性基因的分布情況,表明垃圾填埋場和垃圾滲濾液中高濃度的抗生素及抗生素抗性基因可能是被低估的環境抗生素抗性的來源之一[14].垃圾填埋場填埋受短時強降雨、使用年限、管理運營不善等因素的影響,垃圾雨水混合液以及垃圾滲濾液可能會沖刷或者滲漏到周圍環境水體,從而直接或間接污染河流水體,可能使得河流水環境中微生物抗生素抗性得以增強,進而造成潛在的環境健康與安全風險.

本研究采用高通量熒光定量PCR(HT-PCR)技術,對廈門市某垃圾填埋場附近河流水的抗生素抗性基因進行了研究,從環境抗生素抗性整體集合的角度出發,對河流水中抗生素抗性基因的豐度和多樣性進行分析,以期增加對河流水抗生素抗性基因污染的認識,進一步提高對生活垃圾填埋場營運管制水平,為垃圾填埋場及其伴生的滲濾液潛在環境健康風險評價與管理決策提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 河流水樣品采集

采樣點位于廈門市東部固廢處理中心垃圾填埋場附近的河流.本河流發源于填埋場背后山谷,并最終從廈門市同安區匯入大海.填埋場垃圾填埋庫區和滲濾液污水處理區符合《生活垃圾衛生填埋技術規范》CJJ17-2004[16]中關于距離河流和湖泊 50m以外的規定.采樣點位分別為區域背景點 R0,根據所處區域的地勢高低和雨水匯水流向,確定填埋庫區和污水處理區雨污混合液/垃圾滲濾液潛在的溢流口/滲漏區的上游 R1和下游R2采樣點(圖1),R1和R2點附近的土地利用方式相似,除了與垃圾填埋及處理的相關活動和少量農田外,以原生態的自然環境為主.每個點位分別采集3L河流水樣,3個采樣平行,所采集的河流水樣品放置于低溫采樣箱中并迅速運回實驗室的-20℃冰箱中保存,用于環境樣品的DNA提取.

圖1 河流水采樣點位示意Fig.1 Sketch of sampling sites

1.2 河流水樣品DNA提取

采用六聯抽濾設備 JTFA0215(天津市津騰實驗設備有限公司)對所采集的3個點位河流水樣品進行抽濾,濾膜采用直徑為50mm的0.22μm滅菌過濾膜(ADVANTEC,日本).

3個采樣點位每張過濾膜上過濾的水樣體積分別為1.5、0.5和0.5L.過濾好的濾膜分別用干凈的鑷子對折,用鋁箔紙包好于-20℃冰箱中保存.取出濾膜,濾膜用滅菌過的手術剪剪成約3×5mm 的小紙塊,將這些剪好的小紙塊放入FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals,美國)中的Lysing Matrix E tube,加入978μL試劑盒中自帶的PBS緩沖液.所有經過預處理好的樣品均采用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒提取總DNA,提取操作步驟參照試劑盒自帶說明書,最終洗脫DNA的體積為100 μL,所提取的DNA樣品用QuantiFluor? dsDNA System (Promega Corporation,美國)試劑盒測定雙鏈DNA 濃度.根據測定的樣品DNA濃度,實驗樣品用滅菌的超純水統一稀釋至25ng/μL.最終DNA樣品置于-20℃冰箱中保存.

1.3 抗生素抗性基因高通量熒光定量PCR

采用 SmartChip Real-Time PCR Systems (WaferGen Inc.,美國)高通量熒光定量反應平臺.研究中所采用的 293對引物在先前的相關研究中被有效驗證過[3].此外另外添加了 1對用于檢定超級細菌抗生素抗性基因 blaNDM-1的引物

[13], 1對 intI1整合子基因 (class1integron)引物

[17]和1對CintI1臨床醫學意義上的整合子基因(clinical class 1integon)引物[18].

定量PCR擴增反應的體積為100nL.反應體系中各試劑的終濃度為:1×的 LightCycler 480SYBR?Green Master MixⅠ(Roche Inc.,美國),nuclease-free PCR-grade water,1ng/μL 的BSA,2.5ng/μL的DNA模板,1μmol/L的上下游引物.PCR反應條件為:95℃預變性10min;95℃變性30s,60℃退火延伸30s,總共40個循環;熱循環儀Cycler的程序自動升溫進行熔解曲線分析.高通量定量PCR每個芯片都有不添加DNA模板(用滅菌水超純水替代)的陰性對照.qPCR反應得到的數據通過Cycler預設定的篩選條件(擴增效率介于 1.8～2.2)進行導出.根據 SmartChip Real-Time PCR Systems的靈敏度和精確度,參照DNA樣品濃度,確定循環次數CT值為31時作為儀器的檢測限.每個樣品都進行3次技術重復實驗,當3次技術重復都被擴增出來認為是陽性擴增,3個采樣平行樣品都是陽性擴增時,認為采樣點的目的基因被有效檢出.

1.4 數據分析處理

高通量熒光定量 PCR的數據采用 Excel 2010進行處理,采用R3.2.4軟件[19]的vegan數據包進行PCA分析以及pheatmap數據包進行熱圖分析.河流水中微生物抗生素抗性基因的相對拷貝數(Gene Relative Copy Number)參照 Looft等

[20]的相關研究文獻,用公式(1)進行估計計算抗生素抗性基因的豐度.根據Schmittgen等[21]關于相對定量分析方法,用Fold Change(FC)值用公式(2)來表征河流水中環境抗生素抗性的富集或者衰減狀況.

式中:CT是 PCR反應收集到特定熒光時的循環次數;ARG代表抗生素抗性基因;16S是代表16S rDNA基因;Target是環境實驗樣品;Ref為對照樣品;FC值(Fold Change)是ARGs拷貝數的富集或衰減程度.當FC=2(-(ΔΔCT+2s))＞1時,且student t檢驗具有顯著性時,認為目標實驗樣品相對于對照樣品顯著富集.

2 結果與討論

2.1 河流水中抗生素抗性基因的多樣性

將檢測的抗生素抗性基因類型分為氨基糖苷類抗性基因(Aminoglycoside)、β-內酰胺類抗性基因(Beta Lactamase)、喹諾酮類氯霉素類抗性基因(FCA)、大環內脂類-林肯酰胺類-鏈陽性菌素 B類抗性基因(MLSB)、磺胺類抗性基因(Sulfonamide)、四環素類抗性基因(Tetracycline)、萬古霉素類抗性基因(Vancomycin)和其他類或者發揮外排泵作用(Other/efflux)八類抗生素抗性基因.河流的3個采樣點檢測到的抗生素抗性基因基本涵蓋了目前已知的主要抗生素抗性類型(圖2A),并且覆蓋了3種主要的抗性機制類型——包括抗生素失活、外排泵機制和細胞保護.其中抗生素失活機制占的比例達44.88%,是河流水微生物抗生素抗性的最主要機制(圖 2B).潛在的溢流口/滲漏區的下游 R2(158種)采樣點檢測到的抗生素抗性基因顯著高于區域背景點R0(57種),并且抗性基因的多樣性也顯著升高(圖2A),表明垃圾填埋場下游區域河流可能是潛在的抗性基因存儲庫.

區域背景點檢測到的抗生素抗性基因都存在于潛在的溢流口/滲漏區的上游R1和下游R2采樣點的水體中,這些抗性基因可能是垃圾填埋場區域“土著”的“背景抗性基因”,這些基因涵蓋了主要的抗性基因類型和抗性機制,表明抗生素抗性基因在沒有人類活動的區域也是廣泛存在的,屬于微生物的內在抗性[22].因此在 R1和 R2這 2個點檢測到的其他類型的抗生素抗性基因可能是受垃圾填埋場填埋、運營過程中引入的“外源抗性基因”.進一步的分析表明,“背景抗性基因”和“外源抗性基因”都有獨特的組成特征(圖3),下游R2采樣點β-內酰胺類抗生素抗性基因(Beta Lactamase)的比例增加,并且出現了磺胺類抗生素抗性基因(Sulfonamide)類型.β-內酰胺類抗生素是醫療行業最重要的一類抗感染藥物

[23-24],也是普通居民在藥店可以購買得到并常常被使用的抗生素;而磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥,臨床上主要用于預防和治療感染性疾病.日常生活未被使用而且棄置的這兩類抗生素往往隨著生活垃圾被運送到了城市生活垃圾填埋場,垃圾填埋物中潛在的抗生素類型與檢測到的抗性基因類型一致[25].因此,這兩類抗性基因在垃圾填埋場檢出,表明垃圾填埋等人類活動影響可能改變了河流水的抗性基因組成,可以被認為是“外源抗性基因”.

圖2 河流水抗生素抗性基因檢出種類特征Fig.2 Detected ARGs in river

圖3 河流水檢出抗性基因類型比例特征Fig.3 Ratios of detected ARGs in river

2.2 河流水中抗生素抗性基因分布結構

垃圾填埋場下游河流水中抗生素抗性基因的多樣性較背景點顯著增加,因此用主成分分析方法來進一步評估 3個河流水采樣位點的抗生素抗性基因結構差異(圖 4).在 PCA1軸上(解釋量為84.8%),區域背景點R0與下游R2樣品形成獨立兩簇,明顯分開,經 mrpp顯著性分析檢驗表明垃圾填埋場下游河流水抗性的分布基因結構與背景點呈現顯著差異(P＜0.01).同時上游R1和背景點R0比較接近,表明垃圾填埋場對R1采樣點河流水抗性基因沒有顯著影響.

圖4 河流水抗性基因主成分分析Fig.4 Principle component analysis of ARGs in river

把檢測到的抗生素抗性基因用聚類熱圖進一步深入分析抗性基因在 3個采樣位點中的分布格局和演變趨勢(圖 5).總體上看,樣品的聚類分布結果與主成分分析結果一致,抗性基因可以聚為四類:Cluster Ⅰ,在背景點R0以極低豐度存在或者未檢出,在上游R1和下游R2豐度略有增加;Cluster Ⅱ,在背景點R0和上游R1以低豐度存在或者未檢出,在下游 R2以較高豐度水平存在;Cluster Ⅲ,在所有點位均有存在,并從上游到下游富集趨勢依次遞進;Cluster Ⅳ,所有點位均以高豐度存在,并且在下游采樣點出現顯著富集現象.因此,我們認為 Cluster Ⅲ和 Cluster Ⅳ是“背景抗性基因”類型,Cluster Ⅱ可以認為是“外源抗性基因”.垃圾填埋場附近河流水抗性基因與城市河流水的抗性基因的分布演變趨勢格局相似[5].抗性基因熱圖表明,垃圾填埋活動及可能存在的雨污水沖刷和滲漏的影響下,河流水的“背景抗性基因”的豐度顯著增加,而且河流水輸入了“外源性抗性基因”,從上游到下游抗性基因污染加劇,改變了河流水抗性基因的分布格局.

圖5 河流水抗性基因相對豐度聚類熱圖Fig.5 Pheatmap for relative copy number of ARGs

2.3 下游河流水中富集的抗生素抗性基因

填埋場上游R1點與背景點R0抗生素抗性基因種類和豐度比較相似(沒有顯著性差異, P＞0.05),因此我們著重分析垃圾填埋場下游河流水中抗性基因的富集情況.相對背景點 R0,垃圾填埋場下游河流水顯著富集的抗性基因達到了150種,富集倍數最高的是磺胺類抗生素抗性基因dfrA1,達2299倍(圖6).富集的抗性基因類類型涵蓋了前述的八大類抗生素抗性類型,抗性類型種類數前三的分別是other/efflux、β-內酰胺類和氨基糖苷類抗生素抗性基因.富集結果表明,下游河流水高豐度存在的抗性基因也是富集的抗性基因,垃圾填埋場附近匯水土壤及其淺層地下水可能受到填埋場抗生素抗性基因污染.抗生素抗性基因在填埋堆體、垃圾滲濾液、附近土壤和淺層地表水的遷移、擴散和富集情況需要開展進一步的研究工作.

圖6 下游河流水(R2)富集的抗生素抗性基因Fig.6 Enrichment ARGs in downstream (R2)

2.4 抗生素抗性基因與可移動元件的關系

圖7 可移動元件與磺胺類類/大環內脂類-林肯酰胺類-鏈陽性菌素B類抗生素抗性基因豐度關系Fig.7 Corralation between MGEs and ARGs (Sulfonamide/MLSB)

Ciric等[26]證實了四環素類抗生素抗性基因與一些新型的可移動元件有關.在同一個微生物生境中,抗生素抗性基因可以隨著可移動元件進行水平基因轉移(HGT),從而使得抗性基因在不同種屬微生物遷移傳播[27-28].分析河流水中可移動元件(transposon轉座子、intI1整合子基因和CintI1整合子三類)與各類抗生素抗性基因豐度關系表明,可移動元件(MGEs)與磺胺類(Sulfonamide)/大環內脂類-林肯酰胺類-鏈陽性菌素B類(MLSB)抗生素抗性基因均呈現極顯著的線性相關(P＜0.01),MGEs與 Sulfonamide和MLSB的 Pearson相關系數分別為 0.9474、0.9026(圖7),可移動元件豐度高,抗性基因的豐度也高,進一步證實了垃圾填埋場附近河流水微生物中可移動元件與抗性基因的遷移傳播富集有顯著正相關的關系.

3 結論

3.1 抗生素抗性基因的多樣性、檢出率、豐度和富集程度沿著河流逐漸增加,在垃圾填埋場下游顯著富集,抗性基因污染加劇;

3.2 河流的可移動元件豐度與抗性基因豐度顯著相關,生活垃圾填埋場可能對河流水抗生素抗性基因產生了影響.

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High-throughput profiling of antibiotic resistance genes in river in the vicinity of a landfill.

HUANG Fu-yi1, AN Xin-li1,2, LI Li3, OUYANG Wei-ying1,2, LI Hu1,2, SU Jian-qiang1*
(1.Key Laboratory of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China；3.Lijiang Environmental Monitoring Station, Lijiang 674100, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：203～209

Aquatic environment especially the river is an important reservoir of antibiotic resistance genes (ARGs). For the further insight into the ARGs in a river in the vicinity of a landfill, high-throughput qPCR technique was used to investigate the diversity and abundance of ARGs. The results showed that a total of 57ARGs was detected in control sample, while, 158ARGs was detected in the downstream river sample, in which 150ARGs in the downstream river were significantly enriched (P ＜ 0.05). A maximum enrichment of 2299-fold was detected in dfrA1, which conferred resistance to sulfonamide. The detection number of ARGs and the enrichment of ARGs were significantly increased along the river. The abundance of mobile genetic elements was significantly correlated with the abundance of ARGs. These results implied that landfill may lead to the dissemination and enrichment of ARGs in river.

landfill；river；antibiotic；antibiotic resistance genes

X703.1

A

1000-6923(2017)01-0203-07

黃福義(1987-),男,福建連城人,碩士,助理工程師,主要研究方向為環境抗生素抗性基因污染.發表論文5篇.

2016-03-22

國家重點研發計劃(2016YFD0800205);國家自然科學基金國際(地區)合作交流項目(21210008)

* 責任作者, 研究員, jqsu@iue.ac.cn