納米零價鐵對耐四環素菌耐藥特性的影響

陸 賢,郭美婷*,張偉賢(1.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海 200092；2.同濟大學環境科學與工程學院,上海 200092)

納米零價鐵對耐四環素菌耐藥特性的影響

陸 賢1,2,郭美婷1,2*,張偉賢1,2(1.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海 200092；2.同濟大學環境科學與工程學院,上海 200092)

研究了納米零價鐵對污水中耐四環素菌的影響.在不同濃度、反應時間和含氧條件下用納米零價鐵對耐藥細菌進行處理.結果表明,當納米零價鐵終濃度為5000mg/L,反應時間為12h,厭氧條件下,納米零價鐵對耐四環素菌有較好的抑制效果.納米零價鐵對細菌的耐藥能力有消極作用,因而引起耐藥性的減弱.50mg/L濃度的納米零價鐵較大提高了基因轉移效率,為原來的2.15倍,因此需綜合評估納米零價鐵對耐藥性的影響.

納米零價鐵；耐四環素菌；耐藥特性；基因轉移

醫療和養殖等行業抗生素的過量使用極大加劇了細菌的耐藥性風險,對公共健康和疾病預防治療帶來極大威脅.耐藥細菌的環境行為是當前研究的熱點問題之一,城市污水廠由于匯集多種抗生素及濃度較高的細菌,成為環境中耐藥污染物的重要儲存庫,已在污水中檢出多種類型的耐藥細菌及耐藥基因[1-2].

納米材料由于具有突出的理化特性近年來得到廣泛應用.納米材料的環境影響,特別是生物效應也引起廣泛關注.研究表明,納米材料對細菌具有明顯的生態毒性.Li等[3]發現新鮮合成的未負載的納米零價鐵在較低濃度下有毒性.納米材料對微生物的毒性可能受多種因素影響[4]. Cristian等[5]發現納米材料能使耐藥細菌光鈍化.納米材料可能導致細菌發生氧化應激反應破壞細胞[6].

污水是納米顆粒排放到環境的重要匯集地.已有多種納米顆粒在污水中被檢出,其濃度可達μg/L～mg/L[7-8].耐藥細菌作為特殊的微生物,毋庸置疑將受到納米材料的影響,可能對其后續生態風險產生顯著變化.然而至今,納米顆粒對耐藥細菌歸趨的研究仍較少.本研究以納米零價鐵作為代表,考察其對耐四環素大腸桿菌歸趨特性的影響,從其生態毒性、耐藥特性和基因轉移特性影響等 3個方面評價,以期為評價納米顆粒對耐藥細菌環境風險的影響提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 納米零價鐵懸濁液的制備

納米零價鐵按照文獻[9]描述的方法進行制備,即使用NaBH4和Fe(NO3)3?9H2O通過化學反應制備.合成后的納米零價鐵顆粒用去離子水沖洗2次(4000r/min離心5min).制備的納米零價鐵儲存液濃度為1g/L.

1.2 污水中耐四環素大腸桿菌的篩選

取污水廠活性污泥混合液稀釋一系列梯度后取1mL分別加入至含四環素(36mg/L)或紅霉素(32mg/L)的大腸桿菌或糞腸球菌選擇性培養基中,充分振蕩混合,冷卻凝固后置于培養箱 37℃培養24h;從各含有抗生素的平板中分別挑4～5株菌落接種至液體 LB培養基中,于搖床中恒溫培養 24h;將培養后的菌液于含相應抗生素的斜面LB培養基進行劃線分離,培養24h后挑取3株單菌落于液體LB培養基中37℃培養24h;以1%量將上述菌液擴培后分裝于 2mL離心管,加入 20%甘油-80℃保存;另各取一管上述純菌液送出測序,將測序結果輸入genbank經blast比對,發現符合大腸桿菌K12的序列.

1.3 耐四環素菌落數統計

采用改進的傳統平板法進行.取經納米零價鐵處理后的菌液 1mL,10倍梯度稀釋,之后加入到滴有四環素的LB培養基上混合均勻.四環素的濃度為 36mg/L.平板冷卻凝固后在37℃培養箱內培養24h.每個梯度設置3個平行樣本.統計細菌數量在20～300CFU的平板中菌落數目.將不經過納米零價鐵處理的樣品同樣進行上述操作作為空白.

1.4 納米零價鐵毒性影響因素研究

將各不同終濃度(2,10,50,100,200,500,1000, 2000,5000mg/L)的納米零價鐵加入到一定體積的耐藥細菌純菌液中,混合液在 5mL離心管中,150r/min下與常溫搖床反應15min.為考察反應時間的影響,設定時間分別為5、15、30、45、60min、12、24、48h,反應的納米零價鐵終濃度為 2mg/L;為考察氧氣含量影響,參考了 Diao等[4]的方法,將2mL離心管作為缺氧條件,10mL離心管作為有氧組進行反應.所有的反應在室溫下進行的.

1.5 耐四環素大腸桿菌的耐藥特性實驗

測定納米零價鐵處理后耐藥細菌的耐藥特性變化.簡要地,將處理后的耐藥細菌分別加入至含不同濃度的四環素(36,100,200,300,400,500, 800mg/L)的LB平板,在37℃下培養24h,記錄存活細菌的數目.將未經納米零價鐵處理的細菌作為空白樣品同樣進行測定.

1.6 納米零價鐵對耐藥基因轉移的影響

本實驗中,納米零價鐵終濃度分別為 2,10,50, 200mg/L.采用培養接合法進行耐藥基因的轉移,將篩選的耐四環素大腸桿菌 K12作為供體菌,將大腸桿菌NK5449(中國普通微生物菌種保藏管理中心購買,對利福平(＞160mg/L)和萘啶酮酸(＞50mg/L)有很高的抗性)作為受體菌,反應后考察.將供體菌和受體菌分別接種到LB液體培養基培養至對數期,將菌液離心棄上清液后用污水廠二沉池過膜的過膜污水重新懸浮使OD600在1.0左右;將等量供體菌和受體菌混合后置于搖床培養18h;用同時含四環素(濃度為36mg/L)和利福平(濃度為40mg/L)的LB平板篩選轉移接合子,用含利福平的LB平板篩選受體菌,對接合子和受體菌分別計數后將二者的比值作為接合頻率.

1.7 數據分析

1.7.1 耐四環素細菌的劑量-反應曲線 反應混合液樣品總的細菌抗生素抗性水平是用以下方法估算的.對四環素有抗性的細菌的劑量反應曲線數學上與含有四個參數的邏輯方程相吻合

[10].方程如下:

式中:存活率表示為平板上加入四環素與不加入四環素的細菌數量的比值;a表示不加入抗生素的數值,初始值為 100;b表示無窮大,初始值為0;y表示半抑制濃度,mg/L;x表示抗生素,mg/L;p表示決定曲線陡峭程度的坡度因子.

邏輯劑量反應曲線用origin軟件進行擬合.

1.7.2 抗生素濃度區間耐藥細菌階段存活率的估算 細菌的存活率用來估計在每一個抗生素濃度區間的細菌耐藥水平.濃度區間的細菌存活率用以下公式表示:

式中:存活率(%)a表示抗生素濃度為a mg/L時的細菌存活率;存活率(%)b表示抗生素濃度為 b mg/L時的細菌存活率.

1.7.3 抗生素對耐藥細菌抑制率的計算方法

1.7.4 轉移效率的計算方法

1.7.5 統計分析 使用卡方檢驗法檢驗數據的顯著差異性(P≤0.05).

2 結果與討論

2.1 納米零價鐵對耐藥細菌生態毒性及相關因素影響

如圖 1a,當納米零價鐵濃度較低時(＜200mg/ L),抑制率較低,在 200mg/L為 21.2%.此結果和Chen等[11]報道類似;當納米零價鐵濃度大于500mg/L時,抑制率顯著提高,當納米零價鐵濃度為5000mg/L時,抑制率達45.5%. Bahareh等[12]用納米氧化鈣處理細菌,證實了最好的抑制效果出現在高濃度納米顆粒的實驗條件下.另外,Wang等[13]發現隨著納米二氧化鈦濃度的增加,存活的細菌數量顯著減小.因此,作為一種納米材料,高濃度的納米零價鐵懸濁液對耐四環素菌大腸桿菌有較顯著的抑制效果.

納米零價鐵和耐藥細菌反應時間對耐四環素菌的影響見圖1b.當反應時間從5min至30min時,納米零價鐵對耐藥細菌的抑制率沒有很明顯的區別.而當反應時間繼續增加,抑制率增加的速率明顯加快,從45min時的24%到12h的80%.當反應時間進一步增加,納米零價鐵對耐藥細菌反而具有促進作用而非抑制作用.24h和 48h反應時間下的促進率分別為 47%和 103%.當反應時間增加時,納米零價鐵和細菌的反應變得越來越穩定,最大的抑制率在反應時間 12h處得到.Raphael等[14]指出,納米材料表面的死細菌會阻止納米材料與活細菌的直接表面接觸進而導致納米顆粒抗菌能力的消失.這也可能是因為,隨著接觸反應時間延長,納米零價鐵被氧化,失去其抑制耐藥菌的能力.而此時氧化的納米零價鐵作為載體,提供了耐藥菌繁殖的條件,促使其數量增加.具體原因還有待于進一步研究.

圖1 a.納米零價鐵濃度對耐四環素菌抑制的影響;b.反應時間對耐四環素菌抑制的影響;c.氧氣含量對耐四環素菌抑制的影響Fig.1 a.influence of nZVI concentration on tetracycline resistant bacteria inactivation; b.influence of reaction time on tetracycline resistant bacteria inactivation; c.influence of redox state on tetracycline resistant bacteria inactivation

2.2 氧含量的影響

反應條件是否有氧對納米零價鐵對耐藥菌的滅活率有明顯影響.如圖 1c所示,有氧條件下,當納米零價鐵濃度增加,細菌存活率增加.而厭氧條件下耐藥菌的存活率相比要低.這可能是因為納米零價鐵在有氧條件下更容易被氧化,從而失去其抑制耐藥菌的能力.因此,反應中低的氧氣含量能保證較高的耐藥菌抑制率.

2.3 納米零價鐵對細菌耐藥圖譜的影響

加入一定濃度納米零價鐵對耐藥菌的耐藥圖譜有一定影響.相比于對照樣,投加納米零價鐵的耐藥菌圖譜向左偏移;但隨著納米零價鐵濃度升高,存活曲線趨近于空白樣.如圖2所示,從半抑制濃度結果看,當納米零價鐵濃度分別 0,2, 10mg/L時,四環素的半抑制濃度分別為 335.3, 210.7,307.2mg/L.這表明,加入的納米零價鐵協同四環素增加了對耐四環素菌的滅活.但隨著納米零價鐵濃度的增加,其協同效果有所降低.這可能是因為濃度較高的納米零價鐵反而限制了耐藥菌與納米零價鐵的接觸,從而導致其抑制效果降低.

圖2 不同納米零價鐵濃度反應后耐藥細菌的抗生素濃度-存活率曲線Fig.2 Tetracycline concentration-survival rate curve of tetracycline resistant bacteria under different nZVI concentration

圖 3表示了四環素各濃度范圍內的耐四環素菌的階段耐藥率.對于階段存活率,將四環素濃度分為36～200, 200～400和400～800mg/L,分別代表低、中和高抗生素濃度.對于低四環素濃度,加入納米零價鐵后,存活率要大于空白.即在低抗生素濃度范圍內,加入納米零價鐵可促進耐藥菌生長,這種促進作用的原因還不明確.然而,對于中濃度的四環素,加入納米零價鐵意味著更低的存活率.而對于高濃度四環素,不同納米零價鐵濃度下的階段存活率互為接近,這是因為四環素濃度足夠高,以至85%細菌被殺滅;而此時的納米零價鐵作用已不凸顯.階段存活率結果表明,納米零價鐵對耐藥菌階段耐藥率的影響與抗生素濃度有關;兩者在不同濃度下的協同作用有待進一步深入研究.

圖3 四環素各濃度范圍內的耐四環素菌的階段耐藥率Fig.3 Stage survival under different tetracycline concentration

圖4 不同納米零價鐵反應后耐藥基因的轉移頻率Fig.4 Influence of nZVI concentration on bacteria transfer efficiency

圖 4表示了不同納米零價鐵反應后耐藥基因的轉移頻率.可以看到,較低濃度下,納米零價鐵對轉移效率有積極影響.轉移效率相對于空白分別提高了19.2%(納米零價鐵濃度為2mg/L)和115%(納米零價鐵濃度為50mg/L).轉移效率在納米零價鐵濃度為 50mg/L時達到了峰值,此時轉移效率為 5.6×10-6.然而,當納米零價鐵濃度增加到200mg/L時,轉移效率的增加反而有所降低,轉移效率為 2.8×10-6.這與 Qiu等[15]的研究結果相似.他們研究發現,納米氧化鋁、納米二氧化鈦、納米二氧化硅和納米氧化鐵都能促進質粒的轉移.對于納米氧化鋁,對 RP4的轉移效率在5mmol/L時達到頂峰,而在50mmol/L減小.

3 結論

3.1 納米零價鐵濃度為5000mg/L時,其對耐四環素菌有較好的抑制效果,抑制率為 45.5%.當反應時間為12h時,抑制率達80%;3.2當反應時間為48h時,納米零價鐵對耐四環素菌具有促進作用. 3.3納米零價鐵削弱細菌耐藥程度并促進基因轉移.轉移效率在納米零價鐵濃度為 50mg/L時達到最大,為5.7×10-6.目前,納米零價鐵對細菌影響的報道較有限.本研究可對該方面提供一些重要信息.需要進一步研究納米零價鐵抑菌特性和機理.未來的研究重點應該聚焦更多的納米材料對耐藥細菌去除和基因轉移的影響,以期獲得更全面的了解.

[1] Szczepanowski R, Linke B, Krahn I, et al. Detection of 140clinically relevant antibiotic-resistance genes in the plasmid metagenome of wastewater treatment plant bacteria showing reduced susceptibility to selected antibiotics [J]. Microbiology, 2009,155(7):2306-2319.

[2] Castiglioni S, Pomati F., Miller K, et al. Novel homologs of the multiple resistance regulator marA in antibiotic-contaminated environments [J]. Water Res, 2008 42(16):4271-4280.

[3] Li Zhiqiang, Karl G, Pedro J J A, et al. Adsorbed polymer and NOM limits adhesion and toxicity of nano scale zerovalent iron to E. coli [J]. Environ. Sci. Technol., 2010,44:3462–3467.

[4] Diao Minghui, Yao Maosheng. Use of zero-valent iron nanoparticles in inactivating microbes [J]. Water Research, 2009, 43:5243-5251.

[5] Cristian A S, Matthias O, Rodrigo Q A et al. Photoactive hybrid anomaterial for targeting, labeling, and killing antibiotic-resistant bacteria [J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2009,48:7928 –7931.

[6] Maria L S, Carmen F, Mar N, et al. Effects of nano zero-valent iron on Klebsiella oxytoca and stress response [J]. Microb Ecol, 2013,66:806–812.

[7] Bojeong K, Chee-sung P, Mitsuhiro M, et al. Discovery and Characterization of Silver Sulfide Nanoparticles in Final Sewage Sludge Products [J]. Environ. Sci. Technol., 2010,44(19):7509–7514.

[8] Bojeong K, Mitsuhiro M, Benjamin P C, et al. Characterization and environmental implications of nano- and larger TiO2particles in sewage sludge, and soils amended with sewage sludge [J]. J. Environ. Monit., 2012,14:1128-1136.

[9] Wang Chuanbao, Zhang Weixian. Synthesizing nanoscale iron particles for rapid and complete dechlorination of TCE and PCBs [J]. Environ. Sci. Technol., 1997,31:2154–2156.

[10] Huang Jingjing, Hu Hongying, Lu Sunqin, et al. Monitoring and 372 evaluation of antibiotic-resistant bacteria at a municipal wastewater treatment 373plant in China [J]. Environ. Int., 2012, 42:31–36.

[11] Chen Qi, Li Jing, Wu Yan, et al. Biological responses of grampositive and gram-negative bacteria to nZVI (Fe0), Fe2+and Fe3+[J]. RSC Adv. 2013,3:13835–13842.

[12] Bahareh S, Sedigheh M, Mehdi A. Investigation of antibacterial effect of cadmium Oxide nanoparticles on Staphylococcus Aureus Bacteria [J]. Journal of Nanobiotechnology, 2014,12:26.

[13] Wang Shuang, Chang Li-Yan, Wang Yong-Jun, et al. Nanoparticles affect the survival of bacteria on leaf surfaces [J]. FEMS Microbiol Ecol, 2009,68:182–191.

[14] Raphael D H, Bruna A L, Ant?nio G S F, et al. Nanostructured silver vanadate as a promising antibacterial additive to waterbased paints [J]. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2012,8:935–940.

[15] Qiu Zhigang, Yu Yunmei, Chen Zhaoli, et al. Nanoalumina promotes the horizontal transfer of multiresistance genes mediated by plasmids across genera [J]. PNAS, 2012,109:4944-4949.

致謝：作者感謝污水處理廠提供的污水樣品.

Influence of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on resistance character of tetracycline resistant bacteria.

LU Xian1,2, GUO Mei-ting1,2*, ZHANG Wei-xian1,2
(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China；2.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：381～385

Effect of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on tetracycline resistant bacteria in wastewater was investigated. Specifically drug resistance, gene transfer, microbial growth and separation in municipal wastewater were examined. Tetracycline resistant bacteria were treated with nZVI particles under a verity of experimental conditions such as concentration, reaction time, availability to dissolved oxygen and redox state. Experimental results suggest that nZVI was effective for the inactivation of tetracycline resistant bacteria when nZVI concentration is over 5,000mg/L, or reaction time was over 12hours under anaerobic condition. nZVI could also trigger rapid decrease on the antibiotic resistance. Furthermore, addition of 50mg/L nZVI could enhance the transfer efficiency by 215%. Results demonstrate that nZVI was highly reactive in wastewater and there was an urgent need to understand the influence of nZVI on microbial drug resistance.

nZVI；tetracycline resistant bacteria；resistance character；gene transfer

X172

A

1000-6923(2017)01-0381-05

陸 賢(1990-),男,上海崇明人,同濟大學碩士研究生,研究方向為納米零價鐵的應用研究.

2016-05-20

國家自然科學基金資助項目(51308399) * 責任作者, 副教授, guomeiting@tongji.edu.cn