還原Cr(VI)的混菌胞外聚合物和細菌群落結構分析

張恩華,戴幼芬,肖 勇,陳必鏈,楊朝暉,趙 峰(1.湖南大學環境科學與工程學院,環境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 41008；.中國科學院城市環境研究所,中國科學院城市污染物轉化重點實驗室,福建 廈門 6101；.福建師范大學生命科學學院,福建 福州 50108)

還原Cr(VI)的混菌胞外聚合物和細菌群落結構分析

張恩華1,2,戴幼芬2,3,肖 勇2,陳必鏈3,楊朝暉1*,趙 峰2(1.湖南大學環境科學與工程學院,環境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082；2.中國科學院城市環境研究所,中國科學院城市污染物轉化重點實驗室,福建 廈門 361021；3.福建師范大學生命科學學院,福建 福州 350108)

為了更好地理解混菌還原Cr(VI)機制,比較了源于活性污泥的混菌體系在厭氧和好氧培養條件下Cr(VI)還原能力的差異,分析了相應的胞外聚合物(EPS),并通過MiSeq高通量測序研究了細菌群落結構及多樣性.結果表明,好氧和厭氧兩個混菌體系對Cr(VI)均沒有明顯的吸附作用;隨著培養時間的延長,溶液中的 Cr(VI)逐漸被還原為 Cr(III);培養至 72h,好氧體系和厭氧體系對 Cr(VI)的還原率分別達到 67%和78%.兩種培養條件下,不加Cr(VI)對照組EPS含量明顯高于加Cr(VI)實驗組;實驗組細菌群落多樣性均低于相應對照組,厭氧體系細菌群落多樣性低于好氧體系.接種源中的優勢細菌類群為變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門和放線菌門,但經過 36d馴化培養后所有樣本都是變形菌門占主導地位;在屬水平上,檸檬酸桿菌屬在Cr(VI)脅迫下相對豐度明顯下降,而腸桿菌屬相對豐度明顯提高.

重金屬；Cr(VI)還原；胞外聚合物；細菌群落；高通量測序

冶金、電鍍等工業造成的鉻污染正在威脅著自然環境和人類的健康[1].鉻在環境中主要以Cr(III)和 Cr(VI)兩種價態存在,其中 Cr(VI)易溶于水,遷移能力強,且毒性遠大于 Cr(III)[2].因此,治理 Cr(VI)的主要策略之一是將其轉化成Cr(III),從而降低其環境危害,常用的方法主要包括化學還原法、植物及微生物修復法,與這些方法相比,微生物修復法操作簡單、經濟安全,因此相關研究受到越來越多重視[3].

具有 Cr(VI)還原能力的微生物在自然環境和受 Cr(VI)污染的環境中廣泛存在,已報道的Cr(VI)還原菌既有好氧菌、厭氧菌,也有兼性菌[4-5].目前利用微生物還原 Cr(VI)的研究報道多基于純菌培養[6],利用混菌還原 Cr(VI)的研究則相對較少.但事實上使用混菌比使用純菌還原 Cr(VI)操作更簡單,成本更低,更適合實際應用于Cr(VI)污染的治理,因此對混菌還原Cr(VI)進行深入研究是非常必要的.混菌中不同微生物對 Cr(VI)耐受能力不同,面對 Cr(VI)的脅迫,能建立起自我保護機制的菌種在群落中逐漸占優,反之則被淘汰,這將引起微生物群落結構和多樣性的變化.胞外聚合物(EPS)作為菌體與環境之間的緩沖層,有助于減小環境因素對菌體的損害[7],微生物通過調節EPS的產量和組分構成可能是應對 Cr(VI)脅迫的有效方式.然而,在馴化混菌還原Cr(VI)的過程中,我們對微生物群落結構及其多樣性,混菌群落 EPS在馴化前后有何差異知之甚少.

本研究開展了馴化混菌還原 Cr(VI)的實驗,分析了混菌在好氧和厭氧條件下馴化后還原Cr(VI)能力的差異,測定了相應的EPS產量,通過高通量測序測定了細菌群落結構及多樣性,期望通過這些分析對混菌還原 Cr(VI)有更深入的認識,為微生物法還原 Cr(VI)投入實際應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗過程

本研究以廈門市集美污水處理廠二沉池的活性污泥作為接種源.實驗采用 M9培養基(pH 7.0),成分為(g/L):Na2HPO4·12H2O 15.12, KH2PO43.0,NH4Cl 1.0,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.492, CaCl2·2H2O 0.02,葡萄糖 4.0.設置好氧與厭氧培養兩個混菌體系,厭氧培養基采用通入高純度氮氣1h的方式除氧.取5mL活性污泥,接種于60mL的好氧和厭氧體系培養基中,分別設對照組和加入10mg/L Cr(VI)實驗組,每組3個平行,置于25℃,轉速150r/min的搖床中培養.3d為一個培養周期,轉接培養12個周期后,進行后續實驗.

1.2 檢測方法

鉻的測定:Cr(VI)采用國標二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467-87)測定.以電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-OES)測定溶液中的總Cr,預先用2%HNO3(V/V)配制一系列濃度的總鉻溶液,取樣進行標曲測定,樣品也用2%HNO3稀釋至合適濃度后進行測定.菌體吸附的Cr的含量由初始加入培養基的Cr(VI)含量減去所測總Cr含量得到.

EPS的提取與測定:EPS的提取采用加熱法提取[8],將待測菌液離心收集菌體并用0.9%NaCl溶液洗滌后重懸,置于60℃下水浴30min,離心收集上清液,上清液即為加熱法提取到的EPS溶液.胞外聚合物中的多糖和蛋白分別采用蒽酮比色法[9]和改良型 Bradford法[10]蛋白質濃度測定試劑盒(上海生工)測定.

EPS的熒光光譜分析:所用儀器為 Hitachi F-4600型熒光光譜儀.掃描波長范圍: Ex=200～400nm, Em=250～550nm;激發和發射狹縫寬度均為5nm,步長均為5nm,掃描速度為1200nm/min.

1.3 微生物群落結構分析

DNA的提取:使用 FastDNA SPIN Kit for Soil(MP, USA)試劑盒提取微生物基因組 DNA,凝膠電泳檢測合格后保存于-20℃備用.

PCR擴增與測序:PCR擴增引物采用細菌16S rDNA通用引物對338F/806R對V3+V4區進行PCR擴增引物.PCR反應體系為20μL,產物用 2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,切膠回收 PCR產物并進行定量,制備 Miseq PE文庫并用Miseq(Illumina, USA)進行高通量測序.

2 結果與討論

2.1 Cr(VI)還原效果

好氧和厭氧兩個培養條件下,無菌培養基中加入的 Cr(VI)含量基本保持不變,說明培養基對Cr(VI)沒有去除效果,對后續實驗不造成干擾.在第12個培養周期,每隔12h取樣測定溶液中的總Cr和Cr(VI)含量,并計算出Cr(III)的含量.圖1表明,好氧和厭氧體系溶液中所測總Cr量與加入體系中的初始 Cr(VI)量基本保持一致,說明這兩個體系中的混菌對Cr沒有明顯的吸附或吸收作用.隨著培養時間的延長,溶液中的 Cr(VI)逐漸被還原為Cr(III).培養72h后,好氧體系和厭氧體系對Cr(VI)的還原率分別達到67%和78%.前12h兩個體系對 Cr(VI)的還原速率均較低,可能是因為微生物正處在生長階段,體系中菌量較少,限制了Cr(VI)的還原.隨后菌量不斷增加,Cr(VI)還原速率也相應加快.而在 48h至 72h階段,兩個體系Cr(VI)還原速率逐漸產生差異.在 72h數據顯示,厭氧體系Cr(VI)還原率比好氧高11%.造成這種差異的原因可能是在48h后,兩體系內的菌量已經不再是還原 Cr(VI)的限制因素,而因培養條件不同導致的兩體系內微生物群落結構的不同成為了相應的 Cr(VI)還原機制和速率存在差異的主要原因.由此可知,雖然在0h至48h這一階段,厭氧混菌和好氧混菌 Cr(VI)還原率基本一致,但此后厭氧混菌表現出更高的 Cr(VI)還原率,說明在混菌治理 Cr(VI)污染過程中,保持厭氧環境有利于Cr(VI)的還原.

圖1 不同培養條件下鉻濃度變化Fig.1 Variation of Cr concentration in different conditions

2.2 EPS分析

在第12周期末期測定EPS含量,由圖2可知,好氧和厭氧條件下不加Cr(VI)對照組EPS含量均顯著高于加Cr(VI)實驗組,對照組EPS中多糖含量也顯著高于實驗組.一些已報道純菌還原Cr(VI)實驗中,實驗組 EPS含量通常要比對照組高[11],這與本實驗結果不一致.其原因可能是,本實驗為混菌體系,無 Cr(VI)對照組微生物群落組成中有些菌種高產 EPS但 Cr(VI)耐受性差,加Cr(VI)實驗組中,這些菌無法耐受 Cr(VI),在群落占比中明顯減少,這就使得對照組EPS含量高于實驗組.本實驗中厭氧加Cr(VI)實驗組EPS含量比好氧加 Cr(VI)實驗組含量高,尤其是蛋白含量明顯高于好氧實驗組,結合厭氧實驗組 Cr(VI)還原率比好氧實驗組高 11%這一結果,可得出與之前研究一致的結論,即EPS對重金屬的去除起到重要作用,尤其蛋白的含量是影響去除效率的關鍵因素[12-13].Das、Kang等的研究表明EPS具有還原 Cr(VI)的能力,參與還原過程的主要是蛋白和一些還原性多糖,進一步的分析證明,蛋白中的酰胺基團(酰胺I帶、酰胺II帶)、羧基,以及多糖中的羥基、醛基、甲基、亞甲基是EPS與Cr(VI)作用的主要官能團[14-17].

圖2 對照組和實驗組中EPS含量Fig.2 EPS content in the control groups and the experimental groups

不同培養條件下混合菌的EPS組分的熒光光譜分析見圖 3, 1峰(Ex/Em=280/335～340nm)屬于色氨酸類化合物和酪氨酸類化合物,2峰(Ex/Em=225/310～325nm)歸屬于芳香族類蛋白質, 3峰(Ex/Em=350/440nm)是腐殖酸類物質,4峰(Ex/Em=275/440～445nm)是富里酸類物質

[18_21].由圖3a、3c可知,只有從好氧體系混菌提取得到的EPS才存在較明顯的腐殖酸類和富里酸類物質的熒光峰,厭氧體系中則檢測不到明顯的對應峰,說明這是由于好氧和厭氧兩種不同培養條件導致的.在 EPS成分上的不同可能也是好氧和厭氧兩個體系 Cr(VI)還原能力存在差異的原因.

圖3 兩個混菌體系EPS的EEM熒光光譜Fig.3 EEM fluorescence spectra of EPS extracted from two mixed cultures

2.3 細菌群落結構分析

表1 所有樣本細菌群落α-多樣性Table 1 Alpha diversity of bacterial communities of all samples

在第12周期結束后取樣分析微生物群落結構.微生物群落α-多樣性:以16S rRNA基因序列97%相似度水平歸類OUT并統計各樣本的α-多樣性見表1.各樣本的coverage值都接近1,說明測序數據可以較好地反映微生物群落的真實情況.與其他樣本相比,接種源樣本OTU值、Chao1值和Shannon值均最大,說明其群落多樣性最豐富.各樣本經過 12個周期培養后多樣性降低,加Cr(VI)實驗組多樣性顯著低于相應對照組,說明Cr(VI)的脅迫會造成實驗組群落多樣性的降低.由此可知,鉻污染可能會造成相應土壤、水體中原有微生物群落多樣性的降低.厭氧體系對照組和實驗組多樣性比相應好氧體系偏低,表明如果應用到 Cr(VI)的治理中,好氧體系由于多樣性較高,面對實際應用中運行參數和環境條件波動時,其系統穩定性可能更高.

細菌群落結構組成和相對豐度:圖 4a(樣品編號同表1)是樣本群落結構在門水平上的相對豐度,接種源樣本中主要存在四個門的細菌類群:變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria).經過不同條件的馴化培養后,物種多樣性減小,綠彎菌門和放線菌門占比幾乎為 0,除了厭氧對照組樣本中有少部分的厚壁菌門存在,其他樣本中幾乎都是變形菌門.厭氧對照組中厚壁菌門占比高于好氧對照組,說明其更適合在厭氧條件下生長.加Cr(VI)實驗組中厚壁菌門相對豐度非常低,說明其對Cr(VI)耐受性差.變形菌門細菌在所有樣本中占據絕對主導地位,在好氧及厭氧條件下均大量存在,屬于優勢菌群,同時說明變形菌門中可能存在大量耐受Cr(VI)細菌.

圖4 各樣本細菌群落在門(a)和屬(b)水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of phylum (a) and genus (b) in all samples

圖4b進一步從屬水平上對群落結構進行分析.在無Cr(VI)脅迫下,檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)無論是在好氧還是厭氧條件下均屬于優勢種群,相對豐度均大于40%.在Cr(VI)脅迫下,檸檬酸桿菌屬的相對豐度顯著下降,相對豐度均小于 5%,同時腸桿菌屬(Enterobacter)相對豐度顯著提高,相對豐度均大于 70%.說明檸檬酸桿菌屬大部分細菌對 Cr(VI)耐受能力較弱,而腸桿菌屬中存在對Cr(VI)耐受能力較強的菌種.已有研究報道,腸桿菌屬中存在某些兼性還原菌,在好氧和厭氧條件下均可耐受一定濃度的 Cr(VI)[22],與本實驗結果一致.好氧無 Cr(VI)脅迫下假單胞菌屬(Pseudomonas)平均相對豐度大于20%,在Cr(VI)脅迫下相對豐度小于 10%.厭氧條件不存在假單胞菌屬,證明假單胞菌屬屬于好氧Cr(VI)還原菌,與之前報道一致[23].不動桿菌屬(Acinetobacter)主要出現在好氧條件下,且有 Cr(VI)存在時其豐度更大,表明該屬對 Cr(VI)的好氧還原可能具有比較重要的作用.

3 結論

3.1 好氧和厭氧培養的混菌均可還原 Cr(VI)為Cr(III),但對Cr沒有明顯的吸附或吸收作用,厭氧培養條件下Cr(VI)的還原率高于好氧培養.

3.2 不加 Cr(VI)對照組 EPS含量明顯高于加Cr(VI)實驗組,可能是由于對照組和實驗組中微生物群落結構的不同造成的.

3.3 加 Cr(VI)實驗組細菌群落多樣性均低于相應對照組,厭氧體系多樣性均低于對應好氧體系.Cr(VI)的加入會顯著降低細菌群落多樣性,腸桿菌屬是加 Cr(VI)實驗組中的優勢屬,表明該屬可能具有較強的 Cr(VI)耐受性甚至 Cr(VI)還原能力.

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Analysis of extracellular polymeric substances and bacterial community in mixed cultures for Cr(VI) reduction.

ZHANG En-hua1,2, DAI You-fen2,3, XIAO Yong2, CHEN Bi-lian3, YANG Zhao-hui1*, ZHAO Feng2
(1.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Urban Pollutant Conversion, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China；3.College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：352～357

To better understand the mechanisms of Cr (VI) reduction by mixed microbial communities, Cr (VI) bio-reduction was performed by mixed cultures from activated sludge under both aerobic and anaerobic conditions. The component and quantity of extracellular polymeric substances (EPS) were analyzed, and the bacterial communities were determined by high throughput sequencing. No chromium adsorption was observed by the mixed cultures in the present study. In the 12th acclimation cycle, 67% and 78% of Cr(VI) was reduced by the aerobic and anaerobic cultures in 72h, respectively. More EPS were extracted from control groups than that from Cr(VI)-treated groups. The diversities of bacterial communities in Cr(VI)-treated groups were lower than those in control groups. Proteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi and Actinobacteria were the most dominant phyla in the inoculum sample. But, all samples were dominated by Proteobacteria after a culture of 36days with Cr(VI). While the relative abundance of Citrobacter in cultures was significantly decreased by Cr(VI), the relative abundance of Enterobacter was remarkably increased by Cr(VI).

heavy metal；Cr(VI) reduction；EPS；bacterial community；high-throughput sequencing

X172

A

1000-6923(2017)01-0352-06

張恩華(1991-),男,河南鶴壁人,湖南大學碩士研究生,主要研究方向為水污染控制.

2016-05-20

國家自然科學基金資助項目(51208490,51478451);中國科學院知識創新工程青年人才領域前沿項目(IUEQN201306)

* 責任作者, 教授, yzh@hnu.edu.cn