熒光示蹤技術對土壤中誘變菌的生長研究

王 婷,孫紅文,毛洪鈞 (南開大學環境科學與工程學院,天津 300071)

熒光示蹤技術對土壤中誘變菌的生長研究

王 婷,孫紅文*,毛洪鈞 (南開大學環境科學與工程學院,天津 300071)

采用熒光染料DAPI(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole)對外源微生物Bacillus subtilis 38(B38)的DNA分子進行標記,利用熒光示蹤技術對外源微生物的生長繁殖進行有效監測.通過篩選DAPI 工作液的使用濃度與菌懸液的稀釋比例,得出采用0.1 μg/mL濃度的DAPI對稀釋106倍的菌懸液進行染色,熒光信號強度適宜,菌體分散度良好,可實現準確計數.采用上述染色條件,對60d內土壤B38菌體數量的變化進行階段性監測.結果發現,接種后菌體濃度顯著增加,平衡后菌體濃度達到(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初期施加量相比,增長量達到3個數量級.以上結果表明,采用DAPI染料對外源微生物進行熒光示蹤計數,為監測外源微生物的生長繁殖狀態提供了一種簡便、有效的方法.

熒光標記；熒光計數；DAPI；細菌；土壤

生物強化技術作為土壤重金屬污染的一種原位修復手段,近年來成為環境領域的研究熱點

[1-2].接種到土壤中的外源微生物需要適應新的環境條件,并且外源微生物與土著微生物之間存在相互競爭作用,引入的外源微生物能否在土壤中得到正常的生長繁殖、發揮其最大活性決定著生物強化技術實施的成敗[3],因此有必要對外源微生物的生長繁殖情況進行跟蹤調查.

目前,對土壤微生物計數的研究方法主要有傳統的培養分離法[4],放射性同位素標記法[5-6],穩定同位素標記法[7-8]和熒光標記示蹤法[9-11].

近年來,一些學者致力于土壤中微生物的靶向示蹤研究.錢明媚等[12]采用穩定性同位素方法,以13C標記了自養固碳微生物的cbbLR基因,利用分子生物學手段分析標記后的 cbbLR基因多樣性,從而揭示了自養固碳微生物在免耕水稻土中的豐度和多樣性. Kinsella等[13]將放射性同位素 2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖(18FDG)標記的拉恩菌加入模擬的酸化礦質土壤中,利用正電子發射斷層成像技術(PET)對標記后的微生物進行放射性成像分析,以對微生物的地下活動情況進行原位監測.鮑林林等[14]選擇氨單加氧酶基因(amoA)作為分子標記物,通過分子生物學手段對標記的基因進行克隆和測序,以跟蹤北運河表層沉積物中的氨氧化古菌和氨氧化細菌的群落多樣性、豐度、系統發育及其與環境因子的響應關系.

但是放射性同位素標記法中使用的放射性同位素不可避免的會給待測微生物造成損害,影響微生物正常的傳代,影響計數結果的準確性.此外,放射性同位素標記試劑具有放射性,會造成環境污染,且通常需要復雜的放化設備及防輻射防護措施,因此在實際土壤的修復中應用存在局限性.而穩定同位素標記法中用到的穩定同位素試劑為高技術含量、高附加值的高端科研用試劑,存在國外試劑壟斷國內市場的局面[15].此外,生物標記物的定量測定需要借助色譜、質譜等大型儀器[8,16].因此,該技術存在成本高、方法復雜、實驗周期長等缺點.

熒光染色法分為熒光免疫染色法和熒光染料染色法.熒光染料主要分為2大類:一類不能夠透過活細胞膜,僅能夠對固定的細胞和細胞膜有破損的細胞核進行染色的染料,例如碘化丙啶(PI)[17]和溴化乙錠(EB)[18]等;另一類能夠透過活細胞的細胞膜進入細胞內部進行染色,例如羧基二乙酸熒光素(CFDA)[19]、羅丹明123(Rh123)[20]、4’, 6’-二脒基-2-苯基吲(DAPI)[21]等;顯然,后者更有可能在保持外源微生物的活性的前提下進行熒光標記.其中DAPI與DNA結合之后,熒光強度比結合之前增加了近25倍[21].此外,DAPI可以穿透完整的細胞膜,與 DNA分子穩定結合,因此不僅可以對固定細胞進行染色,還可以用于活細胞的染色.

1976年,Williamson等[22]首先將DAPI用作DNA 熒光染料,成功的用于觀測酵母菌的線粒體DNA.之后Lin等[23]將DAPI用于檢測姊妹染色體的交換,并應用到染色體顯帶技術上[21].后來許多研究者使用 DAPI來研究原核生物的DNA和真核生物的細胞核以及核外DNA.DAPI比其他的熒光染料具備以下優點:采用直接染色法,操作方便快速;靈敏度非常高,能檢測到 2× 10-4pg DNA;使用量非常少,通常不超過 0.5μg/ mL;穩定性好,熒光衰退期要低于其他染料.

近年來,DAPI 被引入微生物生態學的研究,在熒光原位雜交技術中,用 DAPI 對微生物的DNA 進行標記,較多的應用于污水處理系統或土壤等樣品的微生物總量估計[24-25].例如,陳琛等

[26]使用 DAPI熒光染色計數法測量了感潮河段沉積物中的細菌數量,通過調整染料濃度、染色時間等影響因素,成功對沉積物中的細菌總量進行了計數.但是將其應用于單一外源微生物的靶向定位示蹤的研究甚少.

為實現對土壤修復過程中所加入的單一外源微生物的生長繁殖情況進行跟蹤監測的目的,本論文創新性的引入熒光示蹤技術.使用熒光染料DAPI對誘變菌的DNA 進行標記,與微生物載體諾沃肥復合后,接種于受污染土壤.通過篩選DAPI 染料的使用濃度與菌懸液的稀釋比例,采用熒光計數技術,成功的實現對外源微生物在土壤中的生長繁殖情況的跟蹤研究.為外源微生物生長繁殖的定量化研究提供了一種簡便、快捷的方法,保證生物強化修復技術的順利實施.

1 材料與方法

1.1 培養基及溶液的配制

使用液體牛肉膏-蛋白胨培養基對活性菌株B38進行培養.培養基的配制方法為:準確稱取蛋白胨 10g/L,氯化鈉 5g/L,牛肉膏5g/L,用 1mol/L的鹽酸和 1mol/L的氫氧化鈉調節 pH=7.2,于121

℃高壓蒸汽滅菌30min備用.

0.85 %(M/V)生理鹽水的配制:準確稱取0.85g氯化鈉,溶解后用蒸餾水稀釋至 100mL,于121℃下高壓滅菌30min備用.

DAPI 儲備液的配制:用雙蒸水將 DAPI 粉末配制成 1.0×103μg/mL的儲備液,于-20℃保存備用.

DAPI工作液的配制:用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)分別稀釋儲備液至 10μg/mL、0.1μg/mL,制得DAPI工作液,于4℃保存備用[27].

1.2 菌種的培養及生長曲線的測定

本實驗中用到的誘變菌種 B38為實驗室前期以枯草芽孢桿菌為初始菌種,通過紫外誘變5min得到的高效鎘耐受性的誘變菌種[28].出發菌枯草芽孢桿菌購買自國家普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC).出發菌株對鎘有一定的抗性,其最小抑制濃度(MIC)為 0.25mmol/L,而選育出的 B38菌種,其抗鎘性能大大提高,MIC達到了3mmol/L[29].

將B38菌體接種于5mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中,于37℃,150r/min活化培養10h至對數生長期中段;之后取 1mL菌懸液接種于 100mL牛肉膏蛋白胨液體培養基,于37℃,150r/min擴大培養.每隔 2h,利用紫外可見分光光度計測定菌懸液的OD600值,并同時對菌懸液進行顯微計數,測定B38的生長曲線[29].每組實驗設置3個平行.

1.3 DAPI染料對誘變菌的熒光染色方法

挑取一環B38誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基中,于 35℃,150r/min下活化培養10h至對數生長期中段.取1mL活化的B38菌懸液,接種于100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基,于35℃,150r/min,擴大培養10h.

取10mL菌懸液,9000r/min離心10min,棄去上清液,用滅菌的 0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.加入37%的甲醛溶液固定B38細胞.

各取2mL固定后的菌懸液,分別加入0.2mL,濃度為1.0×103μg/mL、10μg/mL和0.1μg/mL的DAPI熒光染料,避光染色15min.

分別將染色的菌懸液用 0.85%的生理鹽水稀釋至104和106倍使用.用0.22μm的黑色核孔濾膜過濾染色后的菌懸液,用 0.85%的生理鹽水洗滌 6次,以洗去多余的染料.用 1:1的甘油和PBS試劑配制封片劑,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察細菌染色情況[25].以未熒光標記的菌體作為對照,每組實驗設置 3個平行.

1.4 熒光標記誘變菌在液體培養基中的傳代實驗

挑取一環B38誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基中,35℃,150r/min下活化培養10h.取1mL活化的菌懸液,接種于100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基中.于 35℃,150r/min,擴大培養10h.

取10mL 菌懸液,3000r/min離心10min,棄去上清液,用滅菌的 0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.在2mL 菌懸液中加入通過熒光染色實驗確定濃度的DAPI 熒光染料,避光染色15min.用0.85%的生理鹽水洗滌 6 次,以洗去多余的染料.取1mL菌懸液接種至 100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基,傳代培養10h.

提取10mL菌懸液,稀釋至適當濃度.取2mL菌懸液用 0.22μm的黑色核孔濾膜過濾,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察計數.以未經熒光標記的菌體作為對照,每組實驗設置3個平行.

1.5 熒光標記誘變菌的土壤熒光示蹤方法

采集天津市津南區污水灌溉多年的蔬菜農田土壤0～20cm表層土,風干后過2mm篩.其理化性質見表1.

表1 供試土壤的理化性質與重金屬背景含量Table 1 Properties and heavy metal concentrations of the tested soils

挑取一環B38 誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基中,35℃,150r/min下活化培養10h至對數生長期中段.取1mL活化的B38菌懸液,接種于 100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養基.于35℃,150r/min,擴大培養 10h.取 10mL菌懸液,在3000r/min下,離心 10min,棄去上清液,用滅菌的0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.取 2mL菌懸液,加入選定濃度的 DAPI熒光染料,避光染色 15min.用0.85%的生理鹽水洗滌6次,以洗去多余的染料.

微生物載體諾沃肥取自天津市經濟技術開發區諾維信?(中國)生物技術有限公司.將諾沃肥風干后磨碎,過2mm篩備用.

選擇諾沃肥與土壤的質量比為2%的施用量,以20mL/kg的接種量(即2%的施用水平)將熒光標記的 B38菌懸液與微生物載體充分接觸制備成改良劑,繼而與土壤(800g)充分混合均勻后于人工氣候箱中培養,溫度控制在 25±1℃,光周期為12:12,定期澆水以保持一定的土壤濕度.

培養第 1、5、10、20、30、60d采集 0.5g土壤樣品,加入 10mL生理鹽水于室溫下 200r/ min振蕩15min以提取土壤中的微生物.取10mL提取液,稀釋后取2mL菌懸液用0.22μm的黑色核孔濾膜過濾,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察計數.土壤微生物數量的計算方法為,將計數所得數量轉換為每克干土所含微生物數(cells/g).以未經熒光標記的菌體作為對照,每組實驗設置3個平行.各組處理見表2.

表2 分組設置Table 2 Treatments with different amendments designed in the experiment

2 結果與討論

2.1 誘變菌B38的生長曲線

圖1 B38菌種的生長曲線Fig.1 The growth curve of B38 species

誘變菌B38的生長曲線如圖1所示.B38的生長繁殖分為4個階段:調整期(1)、對數期(2)、穩定期(3)和衰亡期(4).B38在 2h左右進入對數生長期,此階段菌體快速生長,生物量迅速增加;12h后,菌體進入穩定期,活菌數曲線和渾濁度曲線同時達到峰值.處于對數生長期中后段的菌株具有較高的生理活性,因此,選擇培養時間為10h,即培養至對數生長期中后段的菌懸液進行后續實驗.

將12h以內的活菌數與菌懸液的OD600值進行線性回歸,擬合結果見圖 2.從接種期至對數生長期結束,活菌數與菌懸液的 OD600值之間存在顯著正相關關系(r2=0.9766),因而在后續培養實驗中,采用測定對數生長期B38菌懸液OD600值的方法,通過線性回歸計算對細菌數量進行計數,這一發現可顯著提高實驗效率.

圖2 活菌數與菌懸液的OD600值之間的線性關系Fig.2 The linear regression of biomass concentration versus OD600

2.2 DAPI對誘變菌B38的熒光染色結果

DAPI對誘變菌B38的熒光染色結果見圖3.圖3a為未染色的B38菌體(對照組),在紫外光下觀察不到熒光反應,因此排除了菌體自發光對實驗的干擾.為探索適宜的DAPI染料濃度,選擇不同濃度梯度的 DAPI儲備液和工作液進行熒光染色實驗.圖 3b為使用 1.0×103μg/mL的 DAPI儲備液對 B38菌體進行染色的結果,可見 DAPI對B38染色成功,但是視野中熒光反應過強,因而判斷染料濃度過高.繼而稀釋儲備液,使用濃度為10μg/mL的 DAPI工作液進行染色,結果熒光反應仍然過強,無法識別菌株個體,因此需對 DAPI工作液進一步進行稀釋(圖3c).圖4d為使用濃度為0.1μg/mL的DAPI工作液進行染色的結果,視野中熒光反應強度適中,但濾膜上可觀察到一定厚度的藍色菌膜,這是由于菌體濃度過高導致,為進行準確計數需對菌懸液進行稀釋.嘗試將菌懸液稀釋 104倍(圖 3e),菌膜消失,但是菌體仍呈現團聚狀態,無法對個體進行識別和準確計數,因此進一步將菌懸液稀釋至106倍(圖3f),如圖可見菌體分散度良好,且熒光反應強度適宜,可進行計數分析.因此,選擇0.1μg/mL 的DAPI染料濃度、菌懸液稀釋106倍進行后續研究.

圖3 誘變菌B38的熒光染色結果(×50)Fig.3 B38cells stained with DAPI (×50)

2.3 熒光標記誘變菌在液體培養基中的傳代研究

使用濃度為0.1μg/mL的DAPI染料對菌懸液進行染色,稀釋 106倍后進行熒光顯微計數,得到菌懸液濃度為(3.21±0.22)×108cells/mL.根據菌體計數與菌懸液的OD600值線性關系方程(圖2),由菌懸液的 OD600值計算得到擴大培養后的菌懸液濃度為(4.92±0.15)×108cells/mL.熒光計數濃度與理論濃度吻合,因而 DAPI熒光染色顯微計數方法可用于對B38菌體的計數研究.

對傳代培養 10h 后的菌懸液進行熒光顯微計數,所得菌體濃度為(5.58±0.13)×108cells/mL,查找 B38 生長曲線(圖 2),該菌體濃度符合 10h培養應有的濃度.因此,熒光特性成功的在B38傳代過程中得以保持,計數準確有效,DAPI熒光染色顯微計數方法對于B38的傳代示蹤研究可行.

2.4 熒光標記誘變菌在土壤中數量隨時間的變化

使用的菌懸液初始接種濃度為(5.58±0.13)× 108cells/mL,以 2%的接種量接種于土壤中,計算得到土壤中 B38 初始濃度為(1.12±0.03)× 107cells/g.

圖4 誘變菌B38在土壤中的熒光標記示蹤結果(S0:對照;SB:僅添加熒光標記的B38;SNB:同時添加諾沃肥和熒光標記的B38)Fig. 4 Concentrations of fluorescence labeled B38 strain in soil samples under different treatments (S0: control; SB: soil amended with labeled B38; SNB: soil amended with NG and labeled B38)

采集第1、5、10、20、30、60d的土壤樣品對B38誘變菌進行熒光計數,結果見圖4.添加未進行熒光標記 B38 菌體的對照組(S0)未觀察到熒光反應,這就同時排除了土著微生物自發光對熒光計數的干擾.僅添加熒光標記的 B38(SB),土壤B38 菌體濃度呈不斷上升的狀態,30d 后達到平衡,直到 60d 菌體濃度仍維持穩定水平,濃度達到(3.02±0.09)×108cells/g,以20mL/kg的接種量換算,可得濃度相當于(1.51±0.004)×1010cells/mL,與初始接種量相比,濃度增加了超過3個數量級.諾沃肥與標記的 B38復合的一組(SNB),自施加后菌體濃度迅速上升,1d之后即迅速達到穩定狀態并可以保持至 60d,最終濃度為(2.09±0.28)× 108cells/g,以20mL/kg的接種量換算,可得濃度相當于(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初始接種量相比,濃度提高了近3個數量級.

熒光示蹤第 60d的各組處理土壤樣品 B38標記菌的熒光成像結果見圖 5.添加未進行熒光標記的B38菌體的對照組觀察不到熒光反應,外源微生物 B38和土著微生物都不存在自發光現象,對計數結果不存在干擾影響.僅添加熒光標記的B38的一組(SB),鏡檢下土壤中B38菌體濃度最高.諾沃肥與標記的B38復合的一組(SNB),標記菌濃度反而低于SB組處理.

前期使用 DNA擴增-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術對各組處理土壤總的微生物豐度進行研究,與對照相比,僅添加 B38的處理(SB)土壤微生物多樣性并沒有明顯改善,而加入諾沃肥后(SNB)土壤總的微生物豐度顯著提高

[30].結合本文針對外源微生物B38的DAPI熒光計數結果可見,B38作為一株在高濃度鎘脅迫下通過紫外誘變獲得的高效重金屬耐受菌株,與土著微生物相比,對高污染、低肥力的惡劣環境條件有著較高的適應性及發展潛力,在與土著微生物的競爭中取得明顯的優勢.載體諾沃肥含有較高的有機質含量(91.8%)與陽離子交換容量(107.8cmol/kg),可為土壤微生物提供碳源、氮源等營養物質[30],因此,添加諾沃肥后,土壤肥力得到提高,環境條件的改善使得土著微生物得以生長繁殖,這就使得土著微生物開始對外源微生物B38的生長造成競爭性抑制,因此SNB處理下的B38菌體濃度反而低于SB的處理.但是,在達到平衡后,SNB處理下B38的生物量與初期施加量相比增加至近 3個數量級(圖 4),參考生長曲線(圖 1),B38對數期的菌體濃度峰值((8.38±0.12)× 108cells/mL)與初期接種量((1.56±0.08)×106cells/ mL)相比翻倍達到近3個數量級,因此,B38投加到受污染的土壤中后生長繁殖狀況良好.這說明在生物強化處理技術的實施過程中,外源微生物B38的活性得到了保持與發揮,這就保證了投加外源微生物可以按照所預期的思路加速生物修復進程.

圖5 不同處理下誘變菌B38 60d熒光照相結果(×50)Fig.5 Fluorescence microscopy of the cells of fluorescence labeled B38 strain at 60d under different treatments

3 結論

3.1 為研究土壤中施加外源微生物B38后,其菌體濃度隨時間的變化情況,本文創新性的引入了DAPI熒光染色技術標記微生物的DNA分子進行顯微熒光示蹤計數研究.選擇不同濃度梯度的染料進行對比,結果顯示使用高濃度的工作液鏡檢下熒光反應過強,無法識別單個菌體,最終選擇0.1μg/mL的DAPI為最適濃度.

3.2 為能夠對菌體數進行準確計數,選擇不同稀釋倍數進行鏡檢.結果發現當菌懸液稀釋 106倍后,菌體分散度高、數量適中,可實現計數.使用熒光顯微計數得到的 B38 菌體濃度為(3.21± 0.22)×108cells/mL,使用OD600值換算得到的濃度為(4.92±0.15)×108cells/mL,二者達到高度一致,因此熒光染色顯微計數方法準確可行.

3.3 將標記后的B38加入土壤中,傳代培養10h后,提取土壤微生物懸液對B38菌體進行熒光計數,所得菌體濃度為(5.58±0.13)×108cells/mL,符合B38的生長曲線.因此經過標記的外源微生物的熒光特性在傳代過程中得到了良好的保持.

3.4 在60d的時間內跟蹤外源微生物B38在實際土壤修復過程中的數量變化.結果發現B38對惡劣的環境有較高的適應性和發展潛力;在添加了微生物載體后,由于載體物質為土著微生物和外源微生物同時提供碳源、氮源及其他營養物質,此時,土著微生物對B38的生長繁殖起到了部分競爭抑制作用,但是 B38菌體濃度仍達到(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初期施加量相比,提高了近3個數量級,外源微生物得到了良好的生長繁殖.

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Investigation of growth in a UV-mutant species in soil using fluorescent tracing technique.

WANG Ting, SUN Hong-wen*, MAO Hong-jun
(College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：328～335

The DNA molecular of the exotic microorganism Bacillus subtilis 38 (B38, a mutant species of Bacillus subtilis) was used labelled by a fluorescent dye, DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole), to monitor the microorganism growth during the process of soil remediation by bioaugmentation technique. By optimizing the DAPI concentration and the dilution ratio of the bacterial suspension, an ideal DAPI concentrations of 0.1 μg/mL and a bacterial suspension dilution fold of 106were applied, and the appropriate fluorescence intensity and cell dispersity for the accurate fluorescent dot counting were obtained. The quantitative changes of B38 in 60 days soil remediation was monitored under the optimized conditions. The results showed that the numbers of B38 in soil increased obviously, and then reached an equilibrium concentration of (1.05±0.01)×1010cells/mL. The equilibrium concentration was as high as 3orders of magnitude of the initial dosage. Thus, DAPI labelled fluorescent tracing technique was a convenient and effective approach to monitor the growth and reproduction of exotic microorganism.

fluorescent labeling；fluorescent counting；DAPI；bacterium；soil

X53

A

1000-6923(2017)01-0328-08

王 婷(1985-),女,天津人,講師,博士,主要從事土壤重金屬污染修復研究.發表論文10余篇. 4′-6-diamidino-2-phenylindole with DNA and metaphase chromosomes [J]. Chromosoma, 1977,60:15-25.

2016-03-25

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(青年項目) (15JCQNJC15200);國家科技支撐計劃項目(2014BAC23B0205)

* 責任作者, 教授, sunhongwen@nankai.edu.cn