煙草堿法提取基因組DNA的改進

徐宗昌王萌孔英珍

（1. 中國農業科學院煙草研究所 中國農業科學院煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，青島 266101；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙草堿法提取基因組DNA的改進

徐宗昌1，2王萌1，2孔英珍1

（1. 中國農業科學院煙草研究所 中國農業科學院煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，青島 266101；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081）

為能夠快速高效的對大量轉基因煙草樣品進行DNA提取，對堿法提取煙草組織DNA的方法進行了改進。采用0.01 mol/L的NaOH溶液為提取液，破碎轉基因煙草葉片組織后無需經過加熱煮沸中和等步驟，上清液可直接用作PCR反應的模板。結果表明，0.01-0.1 mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能成功擴增，該方法制備的DNA模板不依賴特殊的反應條件，多種品牌的PCR Mix均能成功進行擴增反應。與傳統SDS提取法和試劑盒提取法獲得的DNA相比，PCR結果沒有明顯差異。此提取方法在小麥、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的實驗效果。通過本方法制備的DNA模板，其PCR擴增的產物可直接用來測序分析。該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡便、成本低，沒有交叉污染，能夠在短時間內處理大量樣品，因此能夠對大量的轉基因煙草樣品進行DNA的快速提取和鑒定。

煙草；DNA提取；堿裂解；PCR；轉基因檢測

煙草（Nicotiana tabacum）目前是國內一種重要的經濟作物。培育優質、低害、抗病抗逆、適產的煙草品種是目前煙草育種的主要目標［1］。隨著分子生物學的快速發展和轉基因技術的逐漸成熟，轉基因技術已成為煙草育種的重要方法［2］。近年來，隨著Crispr-Cas9技術的發展，在煙草基因組中定點突變一個或多個基因甚至是整個基因家族成為可能。該技術能夠對目標性狀進行精確改良，通過篩選得到穩定表達轉基因株系，不僅能夠縮短作物的育種周期，還能夠解決傳統育種方法不易解決的問題，如有害性狀與優良性狀的緊密連鎖不易打破分離［3］。這給煙草的轉基因育種帶來了新的機遇。

為了降低假陽性的存在，在抗性培養基上長出的轉基因苗還需進行進一步的檢驗。目前，多采用簡便快捷，靈敏度高的PCR方法進行這一檢測［4］。而要進行PCR檢測則首先需對被檢測樣品進行DNA提取。目前，在眾多植物種類中應用最廣泛的提取DNA的方法是采用商業化的試劑盒或是基于CTAB/ SDS裂解后的酚：氯仿抽提法［5，6］或者是由此為基礎衍生而來的改良法。然而，這些方法都需要在液氮或是冷凍干燥條件下將樣品粉碎，緊接而來的是很多繁瑣的步驟進行DNA的純化。這些方法不僅使用了很多有害試劑和昂貴的試劑儀器，并且使用的植物組織多，步驟繁瑣費時，因此當需要檢測的轉基因植株較多時，這些方法顯得不太適用。在植物領域也有一些快速提取DNA的方法報道［7-15］。然而，所有這些建立在堿液裂解基礎上的快速提取方法模板在進行PCR之前都需要進行加熱/煮沸或者加入中和液（TE或者Tris-HCl）進行中和。這一些額外的步驟顯然會增加樣品之間的交叉污染，樣品多時也會耗費大量時間。

隨著煙草基因組測序的完成和眾多煙草突變體庫的建立，突變體的篩選以及煙草轉基因的研究勢必迅速發展。而這些研究則需要提取大量煙草單株的基因組進行PCR擴增來篩選目的單株。因此，本實驗以前人的研究結果為基礎，對NaOH堿裂解法提取煙草基因組進行改進，使其在進行大量樣品的處理時更加簡便、有效，旨為轉基因煙草分子育種的實際應用創造良好的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 煙草轉基因植株采用的是通過Crispr-Cas9基因組編輯技術對煙草兩個木糖基轉移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030進行編輯的T0代植株，對照植株為非轉基因植株K326；該實驗用到的甜高粱由本實驗室保存；該實驗用到的棉花、小麥、玉米和水稻材料由山東省農科院棉花研究室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 1 mol/L，0.5 mol/L，0.25 mol/L，0.1 mol/L，0.05 mol/L，0.01 mol/L和 0.001 mol/L的NaOH溶液；SDS提取方法參考Edwards（1991）［5］，所用到SDS，Tris等試劑均從青島塞恩斯試劑公司訂購；DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；2×Taq PCR Mix購自北京全式金生物技術有限公司（2×EasyTaq PCR SuperMix+dye，AS111）、青島擎科梓熙生物技術有限公司（2×TSINGKE Master Mix，TSE004）、Thermo Scientific公司（2×DreamTaq Green PCR Master Mix，K1081）和青島生物科技MDBio公司（2×PCR Master Mix，P002）；PCR 擴增儀T100 Thermocycle（Bio-Rad）；自動磨樣機（Qiagen TissueLyser II）等實驗室常規儀器。

1.2 方法

1.2.1 模板制備 一個直徑0.25 mm的鋼珠和250 μL 提取液事先加入2 mL的離心管中，然后取大約10 mm2的植物葉片組織放入。在磨樣機上以23 Hz頻率磨樣2 min，1 μL上清即可直接作為模板進行PCR反應。

1.2.2 引物設計 本實驗所用到的引物均用在線設計網站Oligo Calc（http://biotools.nubic.northwestern. edu/OligoCalc.html）進行設計，引物名稱和序列見表1。引物均在青島擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.2.3 PCR體系和擴增程序 PCR擴增體系采用20 μL反應體系，包括2× PCR Mix 10 μL，前引物和后引物各 6 pmol，DNA模板1 μL，用ddH2O補齊體積。PCR擴增程序如下：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，36個循環；最后72℃延伸10 min。取6 μL PCR 產物在150 V電壓，1.5%瓊脂糖凝膠中電泳15 min檢測擴增情況。凝膠用EB進行染色，凝膠成像系統拍照分析。

表1 本研究所用到的引物

1.2.4 NaOH溶液濃度篩選 本實驗不經加熱煮沸及中和等步驟，采用上清直接作為模板進行PCR擴增，因此需對堿提取液的濃度進行篩選。取煙草品種K326的葉片放入不同濃度梯度的NaOH提取液中（0.001-1 mol/L共7個濃度梯度），用磨樣機打碎，取1 μL上清液作為模板，用引物Ntab0067020-SF/ Ntab0067020-SR進行PCR擴增，篩選合適的NaOH濃度。

1.2.5 適宜NaOH濃度提取液在不同品牌PCR Mix中的擴增穩定性 將煙草品種K326的葉片在適宜NaOH濃度提取液中磨碎，取1 μL上清液作為模板，使用購自上述（1.1.2）4家公司的PCR Mix用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和 Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進行擴增，檢驗篩選到的適宜NaOH濃度提取液在不同品牌PCR Mix中的擴增穩定性。

1.2.6 本實驗方法與傳統方法擴增結果的比較 煙草品種K326葉片分別用SDS和本實驗方法進行DNA提取，各取1 μL DNA溶液作為模板，用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和 Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR及另外兩個半乳糖基轉移酶基 因Ntab0733630和Ntab0774310的 特 異 引 物Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR和 Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR進行PCR擴增，進行結果比較。

1.2.7 本實驗方法在鑒定煙草轉基因植株上的應用 通過Crispr-Cas9技術編輯的兩個煙草木糖基轉移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株已通過PCR產物連接TA克隆載體，對單菌落進行挑菌測序得到驗證。本實驗采用兩個基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用NaOH提取法獲得模板對可能存在的編輯區段擴增進行PCR擴增，獲得的DNA片段進行回收純化，直接測序，進行結果比對，驗證該方法在煙草轉基因植株鑒定工作中的適用性。

1.2.8 本實驗方法對其他作物進行PCR擴增 小麥、甜高粱、煙草、棉花、水稻和玉米分別用試劑盒和本實驗方法進行DNA提取，用各自的ACTIN基因引物進行PCR擴增，對擴增結果進行分析比較，驗證本實驗方法在其他作物上應用的可能性。所用引物，見表1。

2 結果

2.1 適宜NaOH提取液濃度篩選

如圖1所示，0.01 mol/L-0.1 mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能擴增出條帶，說明NaOH溶液粗提物可以直接作為PCR反應的模板。0.001 mol/L的NaOH溶液提取的模板雖然也能擴增出條帶，但條帶亮度較弱，而高于0.25 mol/L（包含0.25 mol/L）的NaOH溶液制備的DNA模板則不能擴增出條帶。從擴增效果和節約試劑的角度考慮，本實驗選擇0.01 mol/L 的NaOH溶液作為提取液進行實驗。

2.2 不同品牌PCR Mix擴增結果

如圖2所示，本實驗室及所內其他實驗室常用的4種不同品牌PCR Mix對0.01 mol/L NaOH濃度制備的K326模板用引物Ntab0067020-SF/Ntab00670-20-S和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進行擴增，4種PCR Mix均能擴增出明亮單一的條帶，擴增結果之間沒有明顯的差異。

圖1 不同濃度NaOH溶液提取模板PCR結果電泳圖

圖2 NaOH提取法在不同品牌PCR Mix中擴增反應穩定性電泳圖

2.3 不同DNA提取方法擴增結果比較

對用傳統SDS方法提取的DNA作為模板和NaOH法提取的DNA模板進行PCR擴增的結果進行比較。如圖3所示，4個糖基轉移酶基因特異引物 Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR、Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR、Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在SDS法和NaOH法提取的DNA模板上進行擴增均能擴增出條帶清晰，明亮的條帶。兩種方法制備的模板PCR擴增結果沒有顯著差異。

圖3 SDS方法與NaOH提取法擴增結果對比電泳圖

2.4 本實驗方法在鑒定煙草轉基因植株上的應用

本實驗對實驗室已經確認的兩個通過Crispr-Cas9技術編輯的煙草木糖基轉移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株在編輯位點附近設計了兩個基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用NaOH提取法獲得模板進行PCR擴增、測序驗證。如圖4-A、4-B所示，引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在對照和轉基因植株上均能擴增出明亮單一的條帶。對PCR產物直接進行測序，測序結果如圖4-C、4-D所示，以A1、A3、A7、A8和B1、B3、B7和B8植株的測序結果為例，A3和B3植株為已知轉入Crispr-Cas9載體但未能在基因組上成功編輯的植株，基因特異引物擴增測序結果分別與對照A1和B1一致；而A7、A8和B7、B8是在基因組上成功編輯的植株，可以看到在這4株植株上擴增的片段在各自的靶位點上都進行了編輯，存在堿基的插入/缺失，這與我們之前的鑒定結果一致。說明本實驗方法提取的DNA模板可以用來對通過Crispr-Cas9技術編輯的轉基因植株進行陽性苗的鑒定。

2.5 本實驗方法在其他作物上的應用

如圖5所示，對小麥、高粱、煙草、棉花、水稻及玉米等作物的幼葉用試劑盒及NaOH兩種方法制備的模板進行ACTIN基因的擴增。結果表明，通過試劑盒方法制備的模板能在5種作物上擴出條帶，而通過NaOH方法制備的模板在棉花中的擴增失敗，但在其他4種作物上均能夠擴增出條帶，且與試劑盒擴增的效果基本一致，在煙草和水稻中甚至能擴增出長達1.5 kb的片段。

圖4 NaOH提取法在煙草轉基因植株鑒定中的應用

圖5 NaOH提取法在其他作物上擴增結果電泳圖

3 討論

本研究的主要目的是對堿裂解提取植物基因組的方法進行改進，并應用到煙草中以適用于大量轉基因煙草陽性株的鑒定工作，節約時間成本。本研究所改進的DNA提取方法使用儀器少，樣品消耗少，簡單，快速，成本低。粗提上清液可以直接用來作為PCR反應的模板，能夠有效的對煙草轉基因植株進行鑒定。利用此方法進行DNA模板制備，一個工作人員在1 h之內就可以提取至少600個樣品，提高了工作效率。另外，此方法只利用大約10 mm2的植物材料就可以提取足夠200次PCR反應的模板溶液，大大減少了對植物材料的浪費。因此，篩選可以在植株生長的早期進行，加速實驗進程。

堿裂解法快速提取基因組DNA的方法在擬南芥、大麥、大豆、甘蔗、水稻、玉米等植物中已經有文獻報道［7，10，12-17］。與這些已經報道的方法相比，本方法最大的改進是上清液不經加熱或中和就可以直接用來作為模板，這樣盡最大的可能節省了時間降低了費用并且還能有效的避免不同樣品之間的交叉污染。0.01 mol/L NaOH的pH值大約在12.93［9］，我們通過對市面上4家不同公司的PCR Mix產品進行PCR擴增的穩定性實驗（圖2）表明，1 μL 0.01 mol/L NaOH提取液不會對20 μL的PCR反應體系造成影響，實驗結果依然穩定、可靠。但是我們注意到高于0.25 mol/L（包含0.25 mol/L）NaOH溶液制備的模板直接用來進行PCR擴增時失敗（圖1），這可能是由于高濃度的NaOH溶液超出了PCR Mix中Tris-HCl緩沖液的緩沖能力，造成PCR結果失敗。

雖然傳統的SDS提取法和試劑盒提取的DNA量多質優，但是PCR技術對DNA質量的要求并不高，只需要一點模板的存在就可以成功擴增［7］。我們的實驗結果證明了此方法提取的DNA在煙草及其他作物，如小麥、高粱、玉米中能夠穩定的擴增，實驗結果可靠、穩定，在煙草和水稻中甚至能擴增出長達1.5 kb的片段（圖3，圖5），并且在煙草中擴增出的PCR產物可以直接用來進行測序分析（圖4）。因此，此方法可以在這些作物中得到廣泛的應用。但是用此方法制備的模板卻不能在棉花中成功擴增。Xin等［16］在快速法（有堿提取液煮沸中和的步驟）提取擴增實驗中也得到了類似的結果，煙草和高粱組織制備模板后在PCR混合體系中加與不加雜質抑制劑BSA和PVP都能擴增出條帶，但是棉花組織卻必須加入BSA和PVP才能夠成功擴增。Burr等［18］報道超過1 mm2的植物材料進行粗提時，其中的葉綠素等雜質會抑制PCR反應，或許棉花葉片組織中的一些物質能夠抑制Taq DNA聚合酶的活性，從而影響擴增效果。綜上所述，本研究改進的煙草基因組DNA堿提取方法不僅能夠對轉基因煙草進行檢測，對在其他作物上的應用也具有借鑒意義。

4 結論

本研究改進的NaOH法制備PCR擴增模板不需要液氮、不需要昂貴的儀器、無需離心、無需更換離心管、沒有加熱煮沸中和等步驟，粗提物可直接用作PCR反應的模板。進行大量樣品DNA模板制備時能夠在最大程度上節省時間和實驗花費并減少樣品之間的交叉污染。此方法用來檢測轉基因煙草陽性株，實驗結果準確，穩定，重復性好。此外，此方法的所有步驟都在室溫操作并且10 mm2的葉子制備的DNA模板就足夠200余次PCR反應使用，可減少對樣品的浪費并在植株生長早期即可進行檢測，加速實驗進程。此改進方法提取的煙草基因組DNA能夠用于對轉基因煙草進行陽性植株鑒定。

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（責任編輯 狄艷紅）

Improvement of Alkaline Lysis Method for DNA Extraction from Tobacco

XU Zong-chang1，2WANG Meng1，2KONG Ying-zhen1
（1. Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Qingdao 266101；2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

To expeditiously extract DNA templates from a large number of transgenic tobacco samples，the alkaline lysis method of extracting DNA from tobacco was improved in this study. Solution of 0.01 mol/L NaOH was used as the extraction buffer and the supernatant could be directly used as a template for PCR reaction，after crushing transgenic tobacco leaf tissues without heating/boiling and neutralizing procedures. The results showed that DNA template produced by NaOH solution of 0.01-0.1 mol/L was amplified successfully. The DNA template produced by the improved method did not rely on particular reaction condition，a variety of types of PCR Mix buffer all amplified successfully. Compared with the traditional SDS extraction method or commercial kits method，PCR results showed no significant differences. In addition，the improved method presented promising results while it was applied to other crops such as wheat，sorghum，rice and maize. The PCR products amplified from the DNA template by the improved method was able to be directly used for sequencing analysis. In conclusion，the improved method is in need of fewer instruments and less sample consumption，rapid，simple，low cost，no cross-contamination，and very efficient to handle a large number of samples，thus，it may rapidly extract and identify the DNA from a large number of transgenic tobacco samples.

tobacco；DNA extraction；alkaline lysis；PCR；transgenic detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.009

2016-09-18

國家自然科學基金項目（31470291，31670302），國家科技支撐計劃項目（2015BAD15B03-05），中國農業科學院青年英才計劃

徐宗昌，男，博士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：xuzc1110@163.com

孔英珍，女，博士，研究員，研究方向：細胞壁多糖合成；E-mail：kongyingzhen@caas.cn