珠子參β-香樹素合成酶基因的克隆和生物信息學分析

吳亞運 趙小龍 陳平 張紹鵬

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430070）

珠子參β-香樹素合成酶基因的克隆和生物信息學分析

吳亞運 趙小龍 陳平 張紹鵬

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430070）

β-香樹素合成酶（beta-amyrin synthase βAS）是定向分流齊墩果烷型皂苷和達瑪烷型皂苷的限速酶，對藥用植物三萜皂苷的生物合成具有重要的調控作用。基于珠子參轉錄組數據中βAS轉錄本序列設計引物，利用RT-PCR方法從珠子參根狀莖中克隆得到βAS基因全長cDNA序列，命名為pjβAS。經測序鑒定該基因長度為2 655 bp，包含一個2 286 bp的完整開放閱讀框，編碼761個氨基酸，在GenBank數據庫的登錄號為KX254566。生物信息學分析顯示，其編碼蛋白分子量為87.90 kD，理論等電點（pI）5.84，不含跨膜區，為非分泌蛋白，含有38處磷酸化位點，主要于葉綠體和內質網中發揮生理作用；二級結構預測發現其α-螺旋占39.82%、延伸鏈16.56%、β-轉角10.38%、無規則卷曲33.24%，具有DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY3個氧化鯊烯環化酶（OCS）基因家族特征保守基序；pjβAS蛋白與竹節參（AKN23431.1）序列的一致性為100%，系統進化分析中與竹節參（AKN23431.1）、西洋參（AGG09939.1）、柴胡（ABY90140.2）劃為同一分支。通過實時熒光定量PCR分析pjβAS在珠子參不同組織中的相對表達量，發現pjβAS基因在花、葉、莖、根狀莖中均有表達，在葉中表達量最高，根狀莖中表達量最低。

珠子參；β-香樹素合成酶；三萜皂苷；基因克隆；生物系信息學分析

珠子參又名竹節三七、血參、七葉子，為五加科人參屬植物珠子參（P. japonicus var. major）的干燥根莖［1］，分布于云南、四川、陜西、湖北等省的高海拔地區，在我國西部地區少數民族中運用十分廣泛，是一味非常珍貴的傳統中藥［2］。珠子參含有三萜類、多糖、揮發油等成分，其中三萜類成分三萜皂苷是珠子參中研究最多，最主要的有效成分［3］。三萜皂苷是一類由三萜苷元與糖或糖醛酸組合而成的植物次生代謝產物，在改善缺血性損傷，提高免疫力，抗炎，抗腫瘤等方面效果明顯［4］。此外，三萜皂苷兼具多種生物學活性，如充當植物抗菌素、活性抗氧劑和調節植物生長等［5，6］。三萜類化合物突出的藥理作用和生理活性備受研究人員關注。

在植物體內三萜類化合物的生物合成是多種生物酶參與調控的復雜過程，大體可分為前體物的合成、萜類骨架的構建和環上官能團的修飾［7］。其中，氧化鯊烯環化酶（oxido squalene cyclase，OCS）基因家族催化2，3-氧化鯊烯形成不同類型的三萜碳環，是整個合成過程中的關鍵步驟［8］。β-香樹素合成酶（beta-amyrin synthase，βAS）是OCS家族成員，能催化2，3-氧化鯊烯環化合成β-香樹脂，后者通過一系列生化反應最終生成齊墩果烷型皂苷。在三萜皂苷合成下游途徑中，βAS是指向分流達瑪烷型皂苷和齊墩果烷型皂苷的關鍵限速酶，也是維持植物體內三萜化合物多樣性的因素之一［9］。目前已從人參［10］、甘草［11］、擬南芥［12］等植物中成功克隆得到編碼βAS的cDNA序列，但尚未見關于珠子參βAS基因克隆及其生物信息學分析的報道。

本課題組借助第二代測序技術得到珠子參轉錄組數據［13］，從中篩選出βAS基因核酸拼接片段，采用反轉錄PCR獲得βAS基因全長cDNA序列，對其序列進行生物信息學分析，并通過實時熒光定量PCR分析pjβAS基因在珠子參花、葉、莖、根狀莖4個組織中的表達情況，旨為闡明該基因在珠子參皂苷生物合成途徑中的分子作用機制和表達調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗植物6年生珠子參樣本采自湖北恩施華中藥用植物園，在相同生長環境下取新鮮珠子參植株，經無菌水洗凈后分離花、葉、莖、根狀莖組織，由液氮快速冷凍后置于-80℃保存。

植物總RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM實時熒光定量試劑盒、TaKaRa LA Taq?試劑盒、PMD18-T Vector、DL5000 DNA Marker、E. coil DH5α感受態細胞、MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0質粒抽提試劑盒購自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；IPTG、X-Gal購自美國普洛麥格（Promega）公司；MG96G PCR儀購自杭州朗基（LongGene）科學儀器有限公司；LG 2020凝膠成像分析系統購自上海美吉（Majorbio）生物醫藥科技有限公司；熒光定量PCR儀為美國應用生物系統（Applied Biosystems）公司生產的ABI 7500實時熒光定量系統。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與反轉錄 分別取珠子參花、葉、莖、根狀莖組織樣本0.1 g于液氮中充分研磨，利用北京艾德萊植物總RNA快速提取試劑盒提取RNA，采用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測RNA完整性。取珠子參花、葉、莖、根狀莖組織總RNA各1 μg，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行反轉錄反應，分別合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.2.2 pjβAS基因的克隆 通過珠子參轉錄組測序數據，得到βAS基因核酸拼接序列，利用NoePrimer2.03和Primer6.0引物設計軟件設計特異性擴增引物βAS-F：5'-GAGCTCAATTTTTGTTTGAA GATGTGGAG-3'和 βAS-R：5'-GCGTCTGAACATTT ACTACAGTGCATGC-3'，以珠子參根狀莖cDNA為模板，運用TaKaRa LA Taq?試劑盒進行珠子參βAS基因全長序列PCR擴增，預期擴增片段長度為2 655 bp。PCR反應體系（50 μL）：TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，2×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 5 μL，βAS-F和βAS-R（10 μmoL/L） 各2 μL，ddH2O 31.75 μL。PCR反應條件：98℃預變性5 min；98℃變性1 min，68℃退火25 s，72℃延伸1 min，進行30個循環；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳對擴增產物進行檢測，對PCR擴增所得特異目的片段進行回收純化。將回收所得DNA片段與pMD18-T載體連接后，轉化DH5α感受態細胞，在加有氨芐抗生素的LB平板上進一步培養，經藍白斑篩選、陽性克隆菌落擴大培養、質粒抽提后送往上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.2.3 pjβAS基因的生物信息學分析 依據pjβAS基因測序結果，利用DNAstar中EditSeq軟件獲取基因序列的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）和其所編碼氨基酸序列；使用在線工具BLAST（http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將獲得的核苷酸和氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它物種進行序列比對和同源性分析，并利用MEGA6.0軟件構建系統進化樹；借助ExPASy網站中在線工具Protparam（http://www.expasy.ch/tools/protaparam.html）進行蛋白質基本理化性質預測；蛋白質二級結構預測采用WOLF SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）；運 用 在線 工 具 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/service/ TMHMM-2.0/）預測蛋白質跨膜區結構域；蛋白質亞細胞定位分析運用在線程序WOLF PSORT（http:// wolfpsort.org/）；蛋白質磷酸化位點預測使用NetPhos 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）；蛋白質序列信號位點分析使用Signal P 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/）；采用在線工具SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/） 進行蛋白質三維結構建模。

1.2.4 pjβAS基因在珠子參不同器官中的表達分析 運用實時熒光定量PCR對珠子參花、葉、莖、根狀莖中pjβAS基因的表達量進行檢測。依據pjβAS基因測序結果，運用Oligo7引物設計軟件設計定量分析引物pjβAS-F：5'-AAGATGTGGAGGCTAA-3'和pjβAS-R：5'-CAGAAATGGAGACGAG-3'；分 別以珠子參花、葉、莖、根狀莖的cDNA為模板；采用SYBR Green I法，利用TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒，在應用生物系統（Applied Biosystems） 公 司ABI 7500熒 光 定量PCR儀上進行擴增反應。反應體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL，ROX Reference Dye II 0.6 μL，pjβAS-F和pjβAS-R（10 umoL/L） 各0.3 μL，60 ng/μL的cDNA模 板2 μL，RNase Free H2O 6.8 μL。每個反應進行3次技術重復，并設置一例陰性對照。反應條件：96℃預變性3min；96℃變性20 s，60℃退火35 s，72℃延伸50 s，進行 40個循環。本次實時熒光定量PCR反應選用β-actin（肌動蛋白）基因作為內參基因，內參引物為β-actin-F：5'-GGCATCACACTTTCTACAACG-3'和 β-actin-R：5'-GGCAGGAACATTAAAGGTTTC-3'［14］， 以 2-ΔΔct法計算pjβAS基因的相對表達量［15］。

2 結果

2.1 總RNA提取結果的檢測

通過1%瓊脂糖凝聚膠電泳對珠子參花、葉、莖、根狀莖總RNA進行檢測，結果（圖1）顯示，3條特征條帶完整清晰，其中28S rRNA條帶與18S rRNA條帶亮度比例約為2∶1，且無拖帶現象發生，表明總RNA未發生降解完整性良好。由超微量紫外分光光度計檢測結果表明，各組織器官總RNA的A260/A280值介于1.8-1.9之間、A260/A230值介于2.0-2.1之間，表明總RNA純度高，無多酚類有機物和蛋白質等雜質污染，滿足后續分子實驗要求。

圖1 珠子參不同組織器官總RNA電泳結果

2.2 pjβAS基因PCR擴增檢測

以珠子參根狀莖cDNA為模板，βAS-F和βAS-R為引物，進行普通PCR擴增。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測，結果（圖2）顯示，獲得一條長度約為2 700 bp的明亮條帶，與預期擴增片段大小基本一致。初步判定為珠子參pjβAS基因全長片段，由測序分析進一步鑒定。

圖2 pjβAS基因全長序列PCR擴增結果

2.3 pjβAS基因測序結果和生物信息學分析

測序結果經引物序列的剔除和片段拼接，獲得了1個大小為2 655 bp的cDNA序列片段。經EditSeq軟件分析，該序列包含一段2 286 bp的完整開放閱讀框，編碼761個氨基酸組成的蛋白，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，5'-UTR與3'-UTR的長度分別為98 bp和271 bp。Protparam推測pjβAS蛋白的分子式為C3980H5980N1042O1121S48，相對分子質量為87.90 kD，理論等電點（pI）為5.84，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為74，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）為91。該蛋白平均親水性系數為-0.360，不穩地系數為49.38，脂肪系數為75.14。pjβAS蛋白包含20種基本氨基酸，其中含量最高的是Glu（7.0%），含量最低的是Cys（2.4%）。

將測序得到的核苷酸序列在NCBI中進行BLAST比對，結果顯示，該序列與竹節參 Panax japonicus C. A. Mey（KP658156.1）、 西 養 參 Panax quinquefolius（JX262290.1）、柴胡 Bupleurum chinense DC（EU400220.2）、遼東楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（HM219225.1）和刺揪 Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（KT150523.1）全長序列相似度分別為99%、99%、86%、83%和83%，說明克隆獲得的序列可能為珠子參pjβAS基因。對推衍的珠子參pjβAS氨基酸序列進行同源性分析，結果（圖3）顯示，該序列與竹節參 Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1）、西洋參 Panax quinquefolius（AGG09939.1）、柴胡 Bupleurum chinense DC（ABY-90140.2）、遼東楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（ADK-12003.1）和刺揪 Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（ALO23119.1）氨基酸序列的一致性分別為100%、99%、89%、87%和85%，比對結果經篩選得到3段OSC基因家族特征保守氨基酸序列DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY。由此推測，本研究成功獲得了一個新的珠子參/氧化鯊烯環化酶基因家族成員的全長cDNA序列，命名為pjβAS，將序列提交至GenBank數據庫，獲得的登錄號為KX254566。

2.4 pjβAS基因編碼蛋白的亞細胞定位、信號肽和跨膜區分析

使用WOLF PSORT程序預測pjβAS基因編碼蛋白的亞細胞定位情況，結果如下：葉綠體的定位系數為5.0（chlo5.0）；內質網的定位系數為3.0（E.R 3.0）；線粒體的定位系數為2.0（mito2.0）；細胞核的定位系數為1.5（uncl1.5）；細胞骨架的定位系數為1.5（cysk_uncl1.5）；質體的定位系數為1.0（plas1.0）。Signal P4.0在線軟件預測該蛋白無信號肽，屬非分泌蛋白。在線工具TMHMM2.0預測該蛋白幾乎不含跨膜區，為非跨膜蛋白（圖4）。

2.5 pjβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點預測

運用NetPhos程序對pjβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點進行預測，結果（圖5）顯示，該蛋白含有14處潛在的絲氨酸磷酸化位點，8處潛在的蘇氨酸磷酸化位點，16處潛在的酪氨酸磷酸化位點。

2.6 pjβAS基因編碼蛋白的二級結構和三級結構預測

利用SOPMA在線軟件對pjβAS基因編碼蛋白的二級結構進行預測，結果（圖6）顯示，該蛋白由39.82%α-螺旋，16.56%延伸鏈，10.38%β-轉角和33.24%無規則卷曲構成，表明α-螺旋和無規則卷曲是主要的二級結構元件。使用SWISS-MODEL工具，運用同源建模法對pjβAS基因編碼蛋白進行三級結構建模（圖7）。

圖3 珠子參pjβAS基因編碼蛋白的多序列比對

2.7 pjβAS基因編碼蛋白的系統進化分析

為了解pjβAS蛋白在自然界中大致的進化關系，從NCBI數據庫中篩選出與pjβAS基因編碼蛋白同源性較高的16種植物的βAS蛋白序列，分別為竹節參 Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1）；西 洋 參 Panax quinquefolius（AGG09939.1）； 柴胡 Bupleurum chinense DC（ABY90140.2）；遼東 楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（ADK12003.1）；刺 揪Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（ALO23119.1）；番茄 Lycopersicon esculentum Mill（NP_001234604.1）；麻花艽 Gentiana straminea Maxim（AHX97777.1）；黃花蒿 Artemisia annua Linn（ACA13386.1）；綠玉樹Euphorbia tirucalli L.（BAE43642.1）；百脈根 Lotus corniculatus L.（BAE53429.1）；可可 Theobroma cacao（XP_007023608.1）；大豆 Glycine max（Linn.）Merr（AHI17180.1）； 南 非 醉 茄 Ashwagandha（AGA17940.1）；烏拉爾甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch（ADE88148.1）；蒺 藜 苜 蓿 Medicago truncatula（XP_003604121.1）；紫 菀 Aster tataricus L. f.（AAX147161）；由ClustalW序列比對后，通過MEGA6.0軟件采用NJ法，構建進化樹，結果（圖8）顯示，pjβAS基因與同屬植物竹節參、西洋參和傘型科植物柴胡的βAS基因親緣性最近，劃歸于同一分支，與菊科植物黃花蒿和紫菀在進化水平上遺傳距離較近，而與豆科植物大豆、烏拉爾甘草、百脈根和蒺藜苜蓿遺傳距離較遠。

圖4 pjβAS基因編碼蛋白跨膜區域分析

圖5 pjβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點預測

圖6 pjβAS基因編碼蛋白的二級結構預測

2.8 pjβAS基因在珠子參不同組織中的表達分析

以珠子參花、葉、莖、根狀莖cDNA為模板，pjβAS-F和pjβAS-R為引物，β-actin為內參基因進研究的深入，已成功從珠子參中分離出了28個皂苷單體，囊括了齊墩果烷型三萜皂苷和達瑪烷型三萜皂苷兩大類，其中竹節參皂苷Ⅳa作為珠子參的主要藥用活性成分被2010版《中國藥典》收錄［16，17］。近期，珠子參總皂苷在抑制大鼠心肌細胞凋亡和拮抗氧化應激損傷等方面的應用［18］，已成為臨床研究行實時熒光定量PCR反應，檢測不同組織中pjβAS基因轉錄層面的相對表達量。結果（圖9）顯示，pjβAS基因在葉中表達量最高，在根狀莖中的表達量最低。珠子參的主要藥用部位為根狀莖，而pjβAS基因的組織差異表達，說明珠子參中皂苷類成分的代謝、合成與積累可能存在指向性和組織間的轉運。

圖7 pjβAS基因編碼蛋白的三級結構預測

圖8 17種植物βAS基因的系統進化樹

圖9 珠子參不同組織中pjβAS基因的相對表達量

3 討論

珠子參作為人參屬植物中的重要藥材，在我國擁有悠久的藥用傳統。隨著其化學成分和藥理活性的熱點。然而，珠子參中皂苷類成分含量較低，對活性單體皂苷的分離，傳統的化學提純法提取成本高且收益率低。加之珠子參為多年生草本植株，收獲周期長，對土壤、氣候和海拔高度等生長條件要求較高，使得珠子參在醫藥領域和日常生活中的推廣應用受到限制。因此，利用合成生物學的研究思路，借助分子生物學和生物信息學的分析方法，探索珠子參中皂苷類成分的生物合成途徑，實現合成途徑中關鍵調控基因的定位、克隆和高效表達［19］，將成為三萜皂苷大規模外源合成的可行辦法。目前，對藥用植物βAS基因的研究已取得了一定的進展。吳瓊等［20］，首次在西洋參中克隆得到βAS基因全長序列，并進行了序列特征分析和聚類分析。焉雅濤等［21］，分析了不同種屬間氧化鯊烯環化酶（OSC）基因家族的特征構型、表達調控和進化關系。王康寧等［22］，在人參15個組織器官中對βAS基因表達量和皂苷含量進行了相關性分析，證實人參總皂苷和單體皂苷Rb1與βAS基因的表達呈顯著正相關。本課題組在早期研究中通過Illumina高通量測序平臺，獲得了15.6 Gb的珠子參轉錄組數據，并從中篩選出了包括βAS基因在內的大量參與三萜皂苷生物合成的候選基因［13］。

在藥用植物中，OSC家族處于三萜皂苷合成途徑的中游位置，負責催化皂苷前體物的合成，βAS是OSC家族中目前唯一發現的調控齊墩果烷型皂苷合成的限速酶。本研究首次從珠子參中克隆得到βAS基因全長cDNA序列，編碼761個氨基酸，整個多肽鏈中存在38處磷酸化位點，包括14處絲氨酸磷酸化位點，8處蘇氨酸磷酸化位點和16處絡氨酸磷酸化位點。蛋白質磷酸化是生物體內一種調節蛋白質活性與功能的普遍機制，氨基酸殘基經磷酸化作用致使蛋白質分子帶有電荷，進而使其分子結構和功能發生改變［23］。Haralampidis等［8］研究發現，βAS基因中鄰近絡氨酸Tyr261的氨基酸易產生突變，致使四環三萜類與五環三萜類產物發生互換。pjβAS基因與竹節參βAS基因氨基酸序列一致性為100%，而核苷酸序列相似度為99%，磷酸化作用可能是導致親緣性較近的不同個體間基因功能發生改變的原因。在與其它OSC氨基酸序列的比較分析中，發現pjβAS基因含有OSC家族3個特征保守基序DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY。序列DCTAE被視為環氧己烷親電活化的質子供體，作用于底物結合［24-26］；QW（QXXXXXW）為一段帶負電荷的芳香族序列，在2，3-氧化鯊烯的環化過程中作用于正電荷中間體，達到穩固蛋白質結構的作用［27］；在OSC基因家族中，MWCRCY序列于βAS中較為保守，其序列中的色氨酸（W）經研究發現參與調控三萜化合物碳骨架的生物合成［28］。

亞細胞定位分析表明，pjβAS蛋白在葉綠體和內質網中定位系數較高，且該蛋白無信號肽，不含跨膜區。推測pjβAS蛋白主要在附著于內質網的核糖體上合成，后由相應的信號肽定向輸送到細胞內的靶位點發揮其生物學作用。實時熒光定量PCR檢測表明，pjβAS基因在珠子參葉、莖、花、根狀莖中表達量依次降低，表達量的變化與皂苷含量的分布相違背，珠子參根狀莖中皂苷含量最高，莖和葉次之，花中含量最低［29］。由此推測珠子參中皂苷類成分主要在葉和莖中合成，通過物質轉移通道運輸到根狀莖中儲存，這種分布狀態也符合草本植物在脅迫環境下自身防衛機制的客觀要求。

4 結論

本研究克隆得到的珠子參pjβAS基因全長2 655 bp，包含一個2 286 bp的完整開放閱讀框，編碼761個氨基酸。生物信息學分析顯示，pjβAS編碼蛋白分子量為87.90 kD，理論等電點（pI）5.84，不含跨膜區，為非分泌蛋白，含有38處磷酸化位點，主要于葉綠體和內質網中發揮生理作用。二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，具有DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY3個保守基序。pjβAS蛋白與竹節參（AKN23431.1）一致性達100%，和西洋參（AGG09939.1）、柴胡（ABY90140.2）的親緣關系較近，劃為同一支。pjβAS基因在珠子參不同組織中均有表達，在葉中表達量最高，根狀莖中表達量最低。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning of β-amyrin Synthase Gene from Panax japonicus var. major and Its Bioinformatics Analysis

WU Ya-yun ZHAO Xiao-long CHEN Ping ZHANG Shao-peng
（College of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430070）

β-amyrin synthase（βAS），the rate-limiting enzyme saponin of directional shunt oleanane and dammarane types，plays an important role in biosynthesis of triterpenoid saponin in medical plants. The primers were designed based on the transcript sequence of βAS from the transcriptome dataset of P. japonicus var. major. And the full-length cDNA sequence of βAS was cloned from the rhizome of P. japonicus var. major by utilizing RT-PCR method，named as pjβAS. The length of this gene was 2 655 base pairs containing a complete open reading frame of 2 286 base pairs and encoding 761 amino acids. The accession number in GenBank is KX254566. The bioinformatics analysis showed that the putative molecular weight and theory isoelectric point of protein encoded by pjβAS were 87.90 kD and 5.84，respectively. The protein contained no transmembrane domain，was a non-secretory protein with 38 phosphorylation sites，it played a physiological role in chloroplast and endoplasmic reticulum. The secondary structure of the protein indicated that α-helix accounted for 39.82，extended strand for 16.56%，β-turn for 10.38%，and random coil for 33.24%. Meanwhile，three feature conserved motifs of oxido squalene cyclase（OSC）were found in pjβAS，i.e.，DCTAE，QW（QXXXXXW），and MWCRCY. The results of the sequence homology comparison concluded that the protein encoded by pjβAS was in 100% similarity with Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1），and pjβAS gene was classified in the same branch with Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1），Panax quinquefolius（AGG09939.1），and Bupleurum chinense DC（ABY90140.2）in phylogenetic analysis. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the relative expression quantity of pjβAS gene in different tissues of P. japonicus var. major，the results showed that there were different expression trends in flowers，leaves，stems and rhizomes，with the highest in leaves but the lowest in rhizomes.

Panax japonicus var. major；β-amyrin synthase；triterpenoid saponin；gene cloning；bioinformatics analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.016

2016-06-17

國家自然科學基金（81274023）

吳亞運，男，碩士研究生，研究方向：中藥功能基因組學；E-mail：282595491@qq.com

張紹鵬，男，講師，研究方向：中藥功能基因組學；E-mail：shaopeng@whpu.edu.cn