豨薟草內生抗感染細菌的分離鑒定及生長特性

陳少紅 趙朋超 陳明釗 李洛宜 李悅 賈靖靖

（河南科技大學醫學技術與工程學院，洛陽 471023）

豨薟草內生抗感染細菌的分離鑒定及生長特性

陳少紅 趙朋超 陳明釗 李洛宜 李悅 賈靖靖

（河南科技大學醫學技術與工程學院，洛陽 471023）

豨薟草有多種藥用價值，旨在從豨薟草果實中分離和篩選出高拮抗活性的內生細菌。采用了形態學觀察、生理生化試驗、16S rRNA 序列比對、系統發育樹分析以及OD600值、藥敏試驗和超濾等方法對該抗感染細菌C-5-1進行了相關生物學特性評價。結果顯示，C-5-1為側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus），對多種病原細菌均敏感，尤其是對銅綠假單胞菌；低pH和高NaCl鹽度環境中耐受性有限，在pH≤5.0或鹽度≥15%時其生長受到了完全的抑制甚至是死亡，但在pH范圍7.0-11.0和鹽度范圍0-5%下均能生長良好，說明該菌株為耐堿，但不耐酸和鹽；篩選出了對菌株C-5-1高度敏感而對5種指示病原菌耐藥的抗生素，即氨芐西林；C-5-1發酵上清液中存在著兩種抗菌物質，且它們的相對分子質量均小于2 000。因此豨薟草有著優良微生物資源，可以成為開發抗感染細菌藥物的重要資源。

豨薟草；側孢短芽孢桿菌；氨芐西林；耐堿；超濾

微生物已經成為新型抗感染藥物的重要來源之一。并且隨著分離技術的不斷進步，分離水平的不斷發展，更多的微生物可能會被人類發現利用。經研究發現，植物內生菌存在于各種藥用植物中，菌株分布廣種類多，且在與宿主長期進化過程中，形成了產生某些與宿主植物有著相同或者相似藥用價值能力的化合物。因此，藥用植物內生菌是一類具有重大開發潛力的微生物資源。

豨薟草為菊科植物的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，小毒，歸肝腎經，可以祛風濕、通經絡、清熱解毒，治風濕痹痛、筋骨不利、腰膝無力、半身不遂、高血壓、瘧疾、黃疸、癰腫瘡毒、風疹濕瘡、蟲獸咬傷［1］。近年來，國內外學者對豨薟草的研究越來越重視［2-4］，但有關其內生菌資源的研究至今未見報道。

本研究以豨薟草中篩選分離得到的具有抗感染活性的內生細菌菌株為研究對象，并闡述其相關生物學特性，旨在為進一步研究該菌株的抗感染代謝產物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥用植物 所用材料為無病蟲害、剛成熟的豨薟草果實，采自河南省洛陽市汝陽縣峴山。

1.1.2 指示菌 5種病原細菌均由河南科技大學第一附屬醫院檢驗科細菌室提供。

1.1.3 主要試劑 實驗中使用的PCR酶和DNA Marker購自大連寶生物公司；兩性霉素B購自上海生工；7種藥敏片（濃度均為30 μg/片）購自北京賽為思生物技術開發中心；微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；其他化學試劑購自國藥集團。

1.1.4 培養基組分 內生細菌分離采用改進的LB瓊脂培養基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉 5，氯化鈉10，葡萄糖5，瓊脂粉20。液體發酵采用改進的LB液體培養基。為抑制真菌生長，以上培養基使用前，均需加入終濃度為50 μg/mL的兩性霉素B（用二甲基亞砜溶解）。

1.2 方法

區域內出露的地層主要為太古界太華群、中元古界長城系熊耳群、薊縣系高山河群、新元古界官道口群、中生界白堊系、新生界古近系、新近系和第四系等，其中太古界太華群在區域北部出露，構成本區古老的結晶基底，主要由一套變質達角閃巖相的中深變質巖及少量混合巖組成，為本區金礦物質的主要來源之一。

1.2.1 內生細菌的分離與純化 內生細菌的分離是通過組織表面消毒來去除表生菌，具體操作如下［5］：取新鮮豨薟草果實，用自來水洗凈，消毒紙吸干，滅菌刀片去皮，然后用無菌水再清洗一遍，接著用75%乙醇浸泡3 min后，用0.1%氯化汞漂洗1-2 min，最后用無菌水沖洗 3次并吸干。將消毒后的果實切成6 mm大小的組織塊，種植于LB瓊脂平板上，于37℃靜置培養24 h，挑取少許劃線接種到新的LB瓊脂培養基上，反復純化至單一純菌落，置于4℃冰箱保存待用。為檢測試驗材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次無菌水沖洗液涂布于LB平板上，于同等條件下培養作為對照，如對照平板無菌落長出即表明消毒徹底，后續試驗所分離到的細菌來自果實內部，即為內生菌。

1.2.2 拮抗細菌的篩選 以病源細菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌為指示菌，采用平板對峙法，每一種待測純菌落需做3次重復。無菌條件下，取100 μL指示菌懸液（1×107CFU/mL）均勻涂布于LB平板上，將每個平板均分成4等份，20 min后將直徑約為6 mm的待測菌塊（瓊脂）貼附于指示菌平板中央（每一等份），37℃培養24 h，觀察各培養板指示菌的生長狀況及抑菌圈大小（包含菌塊直徑6 mm，下同），同時作陽性對照（以氯霉素藥片代替菌塊）。各菌株拮抗效果的判定標準為：抑菌圈直徑＞15 mm 為高度敏感，抑菌圈直徑11-15 mm 為中度敏感，抑菌圈直徑7-10 mm 為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感［6］。

1.2.3 菌種鑒定 （1）形態學鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》，革蘭氏染色和芽孢染色光學顯微鏡鏡檢，記錄其顯微形態。（2）生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》，對待測菌株進行相關生理生化指標測定（微量生化鑒定管）。（3）分子鑒定：將待測菌株接種于LB 液體培養基中，37℃搖床過夜培養，CTAB法提取基因組，細菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'）對提取的基因組DNA進行PCR擴增［7］。所得PCR產物送至上海生工測序。在NCBI 數據庫上進行序列相似性分析，再利用MEGA 5.1軟件構建系統發育進化樹。

1.2.4 藥敏試驗 為了后續試驗的開展，本研究需要對待測菌和5種指示菌做藥敏試驗。結合指示菌的臨床藥敏試驗結果，選取了6種藥敏片，即頭孢他啶、頭孢噻肟、復方新諾明、氨芐西林、青霉素以及四環素。

1.2.5 生長特性分析 待測菌經LB液體活化3次，取活化好的種子液以1%的接種量分別接種到不同pH梯度（3.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0）和NaCl濃度（1%、2%、5%、10%、15%和20%）的LB液體培養基中，37℃培養12 h后，在600 nm 波長下測定OD 值，以上每個梯度分別設置3個重復（為了滿足所測得的吸光度值與細菌濃度成線性比例關系，本實驗首先將不同梯度下的培養液進行稀釋至OD600=0.3-0.7，然后將所測得的具體數值乘以稀釋倍數即為該梯度下的OD600值）。

1.2.6 抗菌代謝產物的初步純化 將待測菌株接入LB液體培養基中（50 mL），30℃，220 r/min振蕩培養48 h。發酵液經離心（8 000 r/min，10 min）去除菌體得上清，然后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相和水相分別經旋轉蒸發濃縮至干，用2 mL無菌水將其溶解，取200 μL測量對指示菌的拮抗活性，重復操作3次。將有抗菌活性的水溶液依次經過截留相對分子質量（Mr）為10 kD、5 kD和2 kD的超濾離心管，4℃，12 000 r/min下離心30 min，分別收集相應的濾出液及截留液，放入-70℃冰箱凍存，并進行冷凍干燥，得到的冷凍干燥粉末-70℃保存備用。使用前再將干燥粉末加入中2 mL無菌水，分別獲得濾出液及截留液。

2 結果

2.1 內生細菌的分離及抑菌效果

如表1所示，從豨薟草果實中共分離得到15株內生細菌，其中具有抑菌活性的8株，較明顯的3 株，編號為C-2、C-4、C-5-1，尤以菌株C-5-1的效果最好，對提供的幾種病原細菌均顯示出一定的抑制作用（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中度敏感以上），圖1為菌株C-5-1對銅綠假單胞菌的抑菌活性。說明該菌株是一種廣譜的抗感染細菌且效果顯著，具有較高的研究價值和應用前景。因此，本研究后續實驗的開展就是以C-5-1為實驗菌株。

表1 豨薟草果實內生拮抗細菌的抑菌篩選

圖1 菌株C-5-1（A、C）和C-6（B、D）對銅綠假單胞菌的抑菌效果

2.2 菌株C-5-1的鑒定分析

光學顯微鏡染色觀察，菌株C-5-1的細胞呈桿狀，芽孢側生。革蘭氏染色結果可變，對數期時染色結果為陽性，穩定期時變為陰性。

通過表2所得的16項生理生化試驗結果，結合形態學特征，依據《伯杰氏細菌系統鑒定手冊》，判斷該菌株可能是側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。

以菌株C-5-1的基因組DNA 為模板，PCR 擴增和測序獲得了16S rRNA 基因的部分片段（1 438 bp），NCBI GenBank登錄號為KX170837。選擇同源性較近的菌株與C-5-1構建系統發育進化樹，結果顯示（圖2）該菌株與側孢短芽孢桿菌的同源關系最近。結合形態學和生理生化鑒定結果，確定為側孢短芽孢桿菌，該菌株被命名為C-5-1。

表2 C-5-1部分生理生化特征

圖2 基于16S rRNA基因序列相似性構建的系統發育樹

2.3 藥敏分析

藥敏試驗結果（表3）表明，5種指示菌對氨芐西林均完全耐藥，而本研究所分離得到的菌株C-5-1對氨芐西林是高度敏感的。因此，在后續摸索抗菌代謝物的純化方案中，可以向LB固體培養基中加入適宜濃度的氨芐西林，以抑制發酵液和純化液中菌株C-5-1的生長，而指示菌（銅綠假單胞菌）正常生長。

表3 五種指示菌與側孢短芽孢桿菌C-5-1的藥敏分析

2.4 菌株C-5-1的生長特性

分別測定細菌在不同酸堿度和鹽度的生長特性，從而為該菌株的進一步培養和發酵利用提供依據。結果（表4）顯示，側孢短芽孢桿菌C-5-1在低pH環境中耐受性有限，在pH≤5.0時幾乎沒有生長，但在pH≥7.0時生長良好，并且隨著pH值的升高，菌體量也一直在增加，這說明該菌株耐堿不耐酸。菌株C-5-1在NaCl鹽度≤5%（相當于50 g/L）時正常生長，但隨著鹽度的增加該菌株的生長受到了一定的抑制，當鹽度≥15%時，其生長受到了完全抑制甚至死亡。這是因為不同鹽度能形成不同滲透壓環境，造成細胞不同程度的脫水，從而降低生長速率，甚至失活。

表4 側孢短芽孢桿菌C-5-1生長特性值

2.5 菌株C-5-1抗菌代謝產物的初步純化

由表5可知，側孢短芽孢桿菌C-5-1發酵液的乙酸乙酯相和水相都有明顯的抑菌圈，直徑分別為（28.3±0.8）mm和（29.9±0.5）mm，指示菌為銅綠假單胞菌，這說明該菌株不止產生一種抗菌物質。后又通過超濾離心管對二者進行了純化，研究表明這兩種抗菌代謝產物的分子量均小于2 000。

表5 側孢短芽孢桿菌C-5-1純化液的抑菌活性

3 討論

內生細菌在適宜生境中能通過發酵獲得大量目的活性產物，從而可以緩解某些藥用植物資源短缺、生長周期長、生態系統損害等現象，并能為新藥開發與瀕危藥用植物保護等難題提供重要思路［8，9］。由于病原菌耐藥性增加等問題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。

側孢短芽孢桿菌最初是由Laubach［10］于1916年從淡水中分離得到，并根據它的形態及生理生化特性將其歸為芽孢桿菌屬，到1996年，Shida等［11］按近代生物分類學將其重新劃分為短芽孢桿菌屬。據報道側孢短芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，尤其是對細菌和真菌［12］。近期的全基因組測序結果表明，側孢短芽孢桿菌還具有產生聚酮化合物和非核糖體肽等多種抗感染藥物的潛力，因此其醫用功能潛力巨大［13-15］。Barsby等［16］從巴布亞新幾內亞海岸熱帶海水中分離得到一株側孢短芽孢桿菌，能產生聚酮類Basiliskamides等多種化合物，可以有效抑制大腸埃希菌和白色念珠菌。同樣也是從海洋中分離得到的菌株PNG276能明顯地抑制腸球菌的生長［17］。Yang等［18］從菌株OSY-I1分離到一種能抗革蘭氏陽性菌生長的脂肽抗生素Brevibacillin。本研究從豨薟草果實中獲得一株具有較強抗感染活性的耐堿側孢短芽孢桿菌C-5-1，并且結合其代謝產物的物化性質，推測它們可能是新型抗菌物質。預示著該菌株具有非常高的開發價值，極可能取代部分抗生素進行應用。

由于后續對菌株C-5-1抗感染活性的研究是以其代謝產物為主，為了降低成本和縮短時間，本研究開展了實驗菌株C-5-1與5種指示菌的藥敏試驗，以期篩選到對C-5-1高度敏感而對指示菌耐藥的抗生素，結果表明氨芐西林能滿足此要求。在測量抑菌活性時，首先向熔化的固體培養基中加入適宜濃度的氨芐西林，然后指示菌涂布于平板表面，并將待測樣品直接置于平板中央0.8 cm的孔中。如果按傳統做法，樣品需要經過孔徑為0.22 μm的濾膜過濾后再加入。

4 結論

豨薟草可作為優良微生物資源的來源，從而為開發新型天然抗感染藥物提供寶貴的資源。

［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典［M］. 北京：化學工業出版社, 2015：348.

［2］Lu Y, Qian RQ, Xiao J, et al. Kirenol attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells and inducing apoptosis of effect or T cells［J］. Scientific Reports, 2015, 5：9022.

［3］Lu Y, Qian R, Xiao J, et al. Kirenol, a compound from Herba Siegesbeckiae, induces apoptosis in human chronic myeloid leukemia K562 cells［J］. Pharmazie, 2014, 69（2）：148-153.

［4］Hwang JH, Kim JD. Inhibitory effects of Siegesbeckiae herba extract on angiogenesis and adipogenesis［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011, 1（16）：144-152.

［5］柴明艷. 車前草內生真菌的分離及抑菌活性測定［J］. 江蘇農業科學, 2016, 44（1）：353-356.

［6］周邦靖. 常用中藥的抗菌作用及其測定方法［M］. 重慶：科學技術文獻出版社重慶分社, 1987：100-299.

［7］Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64（2）：795-799.

［8］史應武, 婁愷, 李春. 植物內生菌在生物防治中的應用［J］.微生物學雜志, 2009, 11（6）：61-64.

［9］黃午陽. 植物內生真菌的抗菌活性研究［J］. 南京中醫藥大學學報, 2005, 21（1）：24-26.

［10］Laubach CA. Studies on aerobic spore-bearing non-pathogenic bacteria partⅡ. Spore-bearing organisms in water［J］. Journal of Bacterial, 1916, 1（5）：506-512.

［11］Shida O, Takagi H, Kadowaki K, et al. Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. Nov［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1996, 46（4）：939-946.

［12］陳潺, 陳升富, 王建宇, 等. 側孢短芽孢桿菌的應用研究進展［J］. 山東農業科學, 2015, 47（2）：149-156.

［13］ Djukic M, Poehlein A, Thürmer A, et al. Genome sequence of Brevibacillus laterosporus LMG 15441, a pathogen of invertebrates［J］. Journal of Bacterial, 2011, 193（19）：5535-5536.

［14］Sharma V, Singh PK, Midha S, et al. Genome sequence of Brevibacillus laterosporus strain GI-9［J］. Journal of Bacterial, 2012, 194（5）：1279.

［15］Hong HA, Duc LH, Cutting SM. The use of bacterial spore formers as probiotics［J］. FEMS Microbiology Rev, 2005, 29（4）：813-835.

［16］Barsby T, Kelly MT, Andersen RJ. Tupuseleiamides and basiliskamides, new acyldipeptides and antifungal polyketides produced in culture by a Bacillus laterosporus isolate obtained from a tropical marine habitat［J］. Journal of Natural Products, 2002, 65（10）：1447-1451.

［17］Desjardine K, Pereira A, Wright H, et al. Tauramamide, a lipopeptide antibiotic produced in culture by Brevibacillus laterosporus isolated from a marine habitat：Structure elucidation and synthesis［J］. Journal of Natural Products, 2007, 70（12）：1850-1853.

［18］Yang X, Huang E, Yuan CH. Isolation and structural elucidation of Brevibacillin, an antimicrobial lipopeptide from Brevibacillus laterosporus that combats drug-resistant Gram-positive bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82（9）：2763-2772.

（責任編輯 馬鑫）

Species Identification and Growth Characteristics of Endophytic Anti-infective Bacteria from Herba siegesbeckiae

CHEN Shao-hong ZHAO Peng-chao CHEN Ming-zhao LI Luo-yi LI Yue JIA Jing-jing
（College of Medical Technology and Engineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023）

Herba siegesbeckiae has many healing values，and our aim is to isolate and screen highly active antagonistic endophytes from its fruits. The biological characteristics of anti-infective bacterium C-5-1 were determined by antagonistic experiment，morphological observation，physiological and biochemical tests，sequence alignment of 16S rRNA gene，analysis of phylogenetic tree，measuring OD600，drug sensitive tests，and ultra-filtration centrifugation. The results showed that the C-5-1 was identified as Brevibacillus laterosporus and was sensitive to various pathogenic bacteria，especially Pseudomonas aeruginosa. The strain C-5-1 had limited tolerance to low pH and highly saline environments，i.e.，inhibited completely or even died in pH≤5 or more than 15% NaCl，but it grew well in pH≥7 and 0-5% NaCl，suggesting that C-5-1 had good alkali resistance，but not resistant to acid and salt. Screening experiment revealed that the antibiotic ampicillin was highly sensitive to C-5-1，but resistant to 5 pathogenic bacteria. Fermentation supernatant of C-5-1 contained two antibacterial substances and relative molecular mass of both was less than 2 000. Conclusively，H. siegesbeckiae having excellent microbial resources will be a key resource for the development of anti-bacteria drugs.

Herba siegesbeckiae；Brevibacillus laterosporus；ampicillin；alkali-resistant；ultra-filtration centrifugation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.020

2016-06-14

河南省高等學校重點科研項目（15A180038），河南科技大學博士科研啟動基金項目（4022/13480021），國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201510464048），河南科技大學大學生科研訓練計劃項目（2015125）

陳少紅，女，本科，研究方向：微生物學；E- mail：2351538594@qq.com

趙朋超，男，博士，講師，研究方向：微生物資源及分子微生物；E -mail：pengchao_zpc@163.com