一株枯草芽孢桿菌噬菌體的生物學(xué)特性分析及抗性菌株的誘變篩選

劉秀俠 徐海燕 辛國芹 穆熙軍 孫學(xué)森 谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000）

一株枯草芽孢桿菌噬菌體的生物學(xué)特性分析及抗性菌株的誘變篩選

劉秀俠 徐海燕 辛國芹 穆熙軍 孫學(xué)森 谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000）

枯草芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵過程中經(jīng)常出現(xiàn)噬菌體污染的問題，分離篩選以枯草芽孢桿菌為宿主菌的噬菌體，分析其生物學(xué)特性并采用自發(fā)突變方法篩選噬菌體抗性菌株。以枯草芽孢桿菌KC-260為宿主菌，從車間異常發(fā)酵液中分離純化得到一株噬菌體，將其命名為P260，富集培養(yǎng)后測定效價(jià)，對其熱穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)、宿主范圍、抑制劑和消毒劑耐受性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。為防治噬菌體P260的污染，利用自發(fā)突變的方法篩選對噬菌體P260有抗性的枯草芽孢桿菌突變菌。結(jié)果顯示，分離純化得到一株效價(jià)為3.45×1010PFU/mL的噬菌體P260，該噬菌體具有一定的宿主專一性，對凝結(jié)芽孢桿菌和短小芽孢桿菌不敏感。噬菌體P260在高溫條件下很容易失活，不耐熱，70℃處理15 min存活率下降極為明顯；25 mg/L的ClO2對P260有極強(qiáng)的殺滅作用；0.5%的草酸銨和檸檬酸銨對該噬菌體有一定的抑制作用。P260感染宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，增殖的潛伏期為15 min，45 min進(jìn)入裂解期。通過自發(fā)突變的方法獲得了抗噬菌體菌株ZF-260，發(fā)酵過程中添加噬菌體后ZF-260的生長不受影響，說明ZF-260是一株可以抗噬菌體P260的優(yōu)良菌株。研究了噬菌體P260的生物學(xué)特性，獲得了遺傳穩(wěn)定且活菌數(shù)高的抗性菌株ZF-260。

枯草芽孢桿菌；噬菌體；抑制劑；消毒劑；自發(fā)突變

枯草芽孢桿菌在目前工業(yè)微生物發(fā)酵方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，是各種酶類的理想表達(dá)宿主［1］。但是，在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中極易遭受噬菌體感染而使生產(chǎn)受到影響。噬菌體污染后難以治理，因此發(fā)酵過程中對噬菌體污染問題應(yīng)綜合防治、預(yù)防為主［2］。建立發(fā)酵車間內(nèi)部及周邊環(huán)境的常規(guī)定期消毒制度是枯草芽孢桿菌噬菌體污染的主要防治措施，Clevenger等［3］研究表明次氯酸鹽、氯氣等常規(guī)氯化消毒劑對枯草芽孢桿菌及其噬菌體有較好的滅活效果。陳衛(wèi)團(tuán)等［4］實(shí)驗(yàn)表明200 mg/L二氧化氯（ClO2）作用枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢10 min殺滅對數(shù)值≥5.0。在噬菌體污染的發(fā)酵液中添加螯合劑或二價(jià)陽離子Ca2+、Mg2+等［5，6］可抑制噬菌體的侵染。選育防御噬菌體感染、繁殖和抗噬菌體的枯草芽孢桿菌突變菌株對于科學(xué)研究、醫(yī)療和工業(yè)應(yīng)用方面有較為重要的意義［7］。

在枯草芽孢桿菌KC-260發(fā)酵生產(chǎn)過程中，活菌數(shù)下降、菌體裂解、菌液變澄清等異常現(xiàn)象時(shí)有出現(xiàn)。采用更換菌種和單純的環(huán)境治理雖然在一定程度上可以減輕噬菌體污染的情況，但是卻沒有起到實(shí)質(zhì)性的治理效果。為了對污染芽孢桿菌的噬菌體有進(jìn)一步的詳細(xì)了解，需要分離純化感染芽孢菌的噬菌體，并對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，以便有針對性地治理噬菌體污染問題。

本研究從異常發(fā)酵液中分離純化得到一株噬菌體P260，對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并檢測多種抑制劑、消毒劑對其抑制殺滅效果，同時(shí)采用自發(fā)突變的方法選育抗噬菌體菌株，以期在工業(yè)化生產(chǎn)過程中為噬菌體污染的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌菌株KC-260、其他供試芽孢桿菌及噬菌體P260均由山東寶萊利生物工程公司分離并保存。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鈉（天津凱通化學(xué)試劑有限公司）、氯化鈉（天津博迪化工股份有限公司）、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、酵母浸膏（天津市英博生化試劑有限公司）等。

1.1.3 主要儀器 THZ-C恒溫振蕩器、 DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱、S22PC型可見分光光度計(jì)、GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱、BCD-196TMPI冰箱、JJ300型電子天平等。

1.1.4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖2 g/L、NaCl 10 g/L，調(diào)pH7.0；底層培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基（瓊脂粉濃度為15 g/L），上層培養(yǎng)基為半固體培養(yǎng)（瓊脂粉濃度為5 g/L）。

1.1.5 抑制劑溶液 500 mg/L蘋果酸母液的配制方法為稱取0.05 g蘋果酸加到100 mL無菌水，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存（其他抑制劑母液的配制方法類似）。在培養(yǎng)至對數(shù)前期的枯草芽孢桿菌菌液中，添加抑制劑母液，使終濃度分別為預(yù)計(jì)濃度。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化和效價(jià)測定

1.2.1.1 噬菌體的分離和純化 用雙層平板法分離純化噬菌體［8］：取10 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾除菌后，適當(dāng)稀釋后取100 μL濾液與300 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長前期（OD600為0.4左右）的枯草芽孢桿菌KC-260混合，37℃靜置15 min后與4-5 mL預(yù)先融化并冷卻到48℃以下半固體培養(yǎng)基混勻，混勻后立即倒在預(yù)先倒好、已凝固的底層瓊脂培養(yǎng)基上，鋪平待凝；置37℃培養(yǎng)12-24 h，肉眼觀察噬菌斑形態(tài)及大小。

用牙簽挑單個(gè)噬菌斑接入含有對數(shù)前期的枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，富集培養(yǎng)3-5 h后離心，取上清過濾除菌，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后取100 μL與300 μL處于對數(shù)期的宿主菌菌液混合，37℃放置15 min后倒雙層平板，次日挑單個(gè)噬菌斑繼續(xù)按相同步驟操作，如此反復(fù)多次，直到平板上噬菌斑大小、形狀均比較一致。

挑取單個(gè)噬菌斑接入處于對數(shù)前期的宿主菌菌液中，培養(yǎng)至菌液澄清后離心取上清，過濾除菌后即為純化后的噬菌體溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 噬菌體效價(jià)測定 將噬菌體溶液10倍梯度稀釋后，分別取100 μL與300 μL處于對數(shù)前期的宿主菌菌液混合，倒雙層平板，過夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。按如下公式計(jì)算噬菌體效價(jià)：噬菌體效價(jià)（PFU/mL）=噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.2.2 噬菌體特性研究

1.2.2.1 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定 感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）是指初始感染時(shí)加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值，是研究病毒感染宿主時(shí)兩者間比例關(guān)系的重要的生物指標(biāo)［9］。將保存的噬菌體原液梯度稀釋至不同濃度，按不同感染復(fù)數(shù)（100、10、1、0.1、0.01和0.001）加入噬菌體原液/稀釋液和處于對數(shù)前期的宿主菌溶液，然后加入適量液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)3-5 h，離心取上清液過濾除菌后測定效價(jià)。以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)對應(yīng)的感染復(fù)數(shù)為最佳感染復(fù)數(shù)［10］。

1.2.2.2 噬菌體熱穩(wěn)定性測定 將保存的噬菌體溶液稀釋至108PFU/mL，分別于50℃、60℃、70℃和80℃水浴5-20 min，測定不同溫度處理后的噬菌體效價(jià)，計(jì)算其存活率。

1.2.2.3 噬菌體宿主范圍的確定 將不同的芽孢桿菌分別培養(yǎng)至對數(shù)前期，分別取300 μL與100 μL噬菌體溶液混合，倒雙層平板，次日觀察是否有噬菌斑形成，以是否形成噬菌斑判斷噬菌體對芽孢菌是否有侵染能力［11］。

1.2.3 噬菌體抑制劑、消毒劑的篩選

1.2.3.1 抑制噬菌體實(shí)驗(yàn) 檢測植酸、蘋果酸、草酸銨、檸檬酸銨、六偏磷酸鈉等對噬菌體的抑制效果。將芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)前期，在菌液中加入噬菌體和待檢抑制劑，以不加噬菌體和抑制劑的作為對照，過夜培養(yǎng)后測定OD600，通過比較對照組與實(shí)驗(yàn)組的OD600值判定抑制劑的抑制效果。

1.2.3.2 滅活噬菌體實(shí)驗(yàn) 將保存的噬菌體溶液稀釋至107PFU/mL，分別利用12.5、25、30、40和50 mg/L的ClO2對噬菌體處理10-40 min后測定效價(jià)，檢測消毒劑對噬菌體的滅活效果。

1.2.4 芽孢桿菌抗噬菌體菌株的選育

1.2.4.1 自發(fā)突變抗噬菌體菌株的選育 在處于對數(shù)期的宿主菌中，按最佳感染復(fù)數(shù)加入噬菌體，過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋后涂布平板，挑取平板上單菌落分別培養(yǎng)至對數(shù)期后加入噬菌體（以不加噬菌體的為對照），過夜培養(yǎng)，觀察生長情況，將生長正常的菌液在加入噬菌體的情況下繼續(xù)傳代培養(yǎng)3次，取菌液培養(yǎng)至對數(shù)期加入噬菌體倒雙層平板，若無噬菌斑出現(xiàn)則確定為噬菌體抗性菌株［12］。

1.2.4.2 突變株遺傳穩(wěn)定性的檢測 將抗性菌株分別在加和不加噬菌體的培養(yǎng)基傳代10次，每次測定OD600，通過比較OD600判定抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4.3 突變株與出發(fā)菌株生長性能的比較 分別將出發(fā)菌株、抗性突變株活化后接入新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后取樣活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離純化和效價(jià)測定

枯草芽孢桿菌KC-260異常發(fā)酵液中分離純化得到的噬菌體P260，能快速裂解宿主，使培養(yǎng)菌液變得澄清，在LB雙層平板上呈現(xiàn)形態(tài)、大小較一致的噬菌斑，噬菌體滴度較高，純化后的噬菌體溶液效價(jià)為3.45×1010PFU/mL。圖1顯示，噬菌體P260噬菌斑形狀近圓形，中間透明，邊緣有暈，過夜培養(yǎng)后直徑達(dá)2-3 mm。

圖1 噬菌體P260噬菌斑形狀

2.2 噬菌體的性質(zhì)分析

2.2.1 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)測定 按照不同的感染復(fù)數(shù)加入噬菌體和宿主菌，培養(yǎng)5 h后收集噬菌體雙層平板法測定管中的噬菌體滴度，結(jié)果見表1。當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI為0.01時(shí)，噬菌體滴度為1.45×1010PFU/mL，在所有的MOI中，該噬菌體滴度最高。因此，確定噬菌體P260感染其宿主枯草芽孢桿菌KC-260的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。

表1 噬菌體P260的感染復(fù)數(shù)測定

2.2.2 噬菌體的一步生長曲線 由圖2可知，噬菌體P260的潛伏期約為15 min，爆發(fā)的時(shí)間約為45 min。

圖2 噬菌體P260的一步生長曲線

2.2.3 噬菌體的熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性分析（圖3）表明，噬菌體P260隨處理溫度升高，存活率下降極為明顯，70℃處理15 min后噬菌體活力幾乎為零。

圖3 不同溫度對噬菌體P260存活率的影響

2.2.4 噬菌體的宿主范圍 通過雙層平板法確定P260噬菌體的宿主范圍，結(jié)果見表2。以枯草芽孢桿菌為宿主菌篩選出的P260可侵染枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，但并不侵染供試的凝結(jié)芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。

表2 噬菌體的宿主范圍

2.3 噬菌體抑制劑、消毒劑的篩選

2.3.1 抑制劑的篩選 通過比較OD600值判定抑制劑對噬菌體P260的抑制效果以及對枯草芽孢桿菌KC-260的影響。由圖4可知，植酸、蘋果酸等6種抑制劑對枯草芽孢桿菌KC-260的生長無顯著抑制作用，0.5%的草酸銨和檸檬酸銨對噬菌體有一定的抑制作用。

圖4 不同抑制劑對噬菌體P260及宿主菌KC-260作用效果

2.3.2 消毒劑ClO2對噬菌體的殺滅作用 圖5顯示，25 mg/L以上濃度的消毒劑ClO2對107PFU/mL噬菌體P260避光作用30 min有較為顯著（P＜0.05）的殺滅作用。

圖5 消毒劑ClO2對噬菌體P260滅活效果

2.4 抗噬菌體芽孢菌的誘變選育

通過自發(fā)突變的方法篩選到一株噬菌體抗性菌株，編號ZF-260。

2.4.1 抗噬菌體突變株噬菌體抗性的穩(wěn)定性 將抗性菌株分別在加和不加噬菌體的培養(yǎng)基中傳代10次，每次測定OD600。表3顯示，傳代10次后突變株ZF-260仍具有噬菌體抗性，說明突變株ZF-260抗噬菌體特性較穩(wěn)定。

表3 ZF-260噬菌體抗性穩(wěn)定性（OD600）

2.4.2 在添加噬菌體P260條件下的500 mL培養(yǎng)瓶發(fā)酵 為了驗(yàn)證ZF-260的抗性，在500 mL搖瓶中分別對ZF-260和KC-260進(jìn)行了培養(yǎng)，并在發(fā)酵5 h時(shí)添加終效價(jià)為1.0×107PFU/mL的P260噬菌體液，結(jié)果見圖6。添加噬菌體P260后5 h時(shí)KC-260菌體明顯稀少（圖6-D）；添加噬菌體P260后15 h時(shí)，顯微鏡觀察到KC-260有大量菌體裂解碎片，只有極少數(shù)形成芽孢（圖6-E）；添加噬菌體P260后25 h時(shí)，KC-260菌體幾乎完全被P260裂解（圖6-F），菌液幾乎澄清；相比較KC-260而言，ZF-260表現(xiàn)出良好的抗噬菌體P260特性（圖6-A、6-B和6-C）。

2.4.3 突變菌株ZF-260與出發(fā)菌株KC-260的活菌數(shù)比較 與出發(fā)菌株KC-260（9.6×108CFU/mL）相比，ZF-260（1.93×109CFU/m）的活菌數(shù)比KC-260高101%。

圖6 ZF-260和KC-260在添加P260噬菌體的條件下的菌體形態(tài)（100×）

3 討論

在酶、氨基酸、乳制品和抗生素等微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，噬菌體污染是導(dǎo)致發(fā)酵異常的一個(gè)常見原因［2］。噬菌體對外界的理化因素，如高溫、紫外線等敏感，張建璀［13］在研究生產(chǎn)肌苷的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液時(shí)分離得到噬菌體TXp1，該噬菌體對紫外線較為敏感，且在80℃處理40 min即可迅速失去活性。而本研究中得到的噬菌體P260對70℃以上的高溫敏感，發(fā)酵罐等可采用高溫滅菌的方式徹底殺滅噬菌體。次氯酸鹽、漂白粉等消毒劑對噬菌體有較好的殺滅效果［3，4］，濃度超過25 mg/L的消毒劑ClO2對107PFU/mL噬菌體P260避光作用30 min有較為顯著的殺滅作用，因此消毒劑ClO2可用于發(fā)酵車間室內(nèi)及室外環(huán)境的消毒。

噬菌體污染對芽孢桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)具有較為嚴(yán)重的安全隱患，篩選對噬菌體抑制效果明顯，同時(shí)又不影響枯草芽孢桿菌正常生長的抑制劑，是有效解決噬菌體污染問題的一個(gè)解決途徑。我們前期的試驗(yàn)已證明0.150%植酸對枯草芽孢桿菌噬菌體P85和P90有明顯的抑制效果［14］。通過本研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)抑制劑雖然不影響枯草芽孢桿菌的正常生長，但是對噬菌體抑制效果極為有限。

通過誘變方法選育抗噬菌體菌株被認(rèn)為是防治噬菌體污染的重要手段，自發(fā)突變、紫外誘變、化學(xué)誘變均是經(jīng)常使用的方法。張建璀［13］在研究枯草芽孢桿菌噬菌體TXp1時(shí)通過自然突變和紫外誘變的方法獲得了噬菌體抗性菌株，從而選育得到可用于菌種輪換的生產(chǎn)菌株。在本研究中篩選得到一株抗性菌株，其生長性能較出發(fā)菌株有所提升［15］。后續(xù)工作中，筆者準(zhǔn)備嘗試采取復(fù)合誘變的方法選育噬菌體抗性菌株。

4 結(jié)論

本研究從車間異常發(fā)酵液中分離、純化、富集得到一株效價(jià)為3.45×1010PFU/mL的枯草芽孢桿菌噬菌體P260。P260感染宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，增殖的潛伏期為15 min，45 min進(jìn)入裂解期。當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)該噬菌體具有最高的滴度，該噬菌體侵染芽孢桿菌的能力較強(qiáng)，比較容易發(fā)生噬菌體污染。噬菌體P260具有一定的宿主專一性，除對凝結(jié)芽孢桿菌和短小芽孢桿菌不敏感外，能侵染枯草芽孢桿菌和部分地衣芽孢桿菌。噬菌體P260在高溫條件下很容易失活，不耐熱，通過70℃處理15 min噬菌體幾乎完全失活。在避光條件下，25 mg/L消毒劑ClO2對噬菌體有較好的殺滅效果。0.5%的草酸銨和檸檬酸銨對該噬菌體有一定的抑制作用。通過自發(fā)突變的方法獲得了抗噬菌體菌株ZF-260，在人工添加終效價(jià)為107PFU/mL的噬菌體的發(fā)酵中，ZF-260的生長不受影響，ZF-260是一株可以抗噬菌體P260并具有高活菌數(shù)的優(yōu)良菌株。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Biological Characteristics of Bacillus subtilis Bacteriophage and Mutagenesis Breeding of Resistant Strains

LIU Xiu-xia XU Hai-yan XIN Guo-qin MU Xi-jun SUN Xue-sen GU Wei
（Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Group，Tai’an 271000）

Bacteriophage infection usually occurs in industrial fermentation，thus this work aims to isolate and screen bacteriophage with Bacillus subtilis as host，to analyze its biological characteristics，and to screen anti-phage strains via spontaneous mutation. With B. subtilis KC-260 as the host bacterium，a bacteriophage，designated as P260，was isolated and purified from the fermentation broth. Its titer was measured after enrichment culture，and then its biological characteristics such as thermal stability，optimal multiplicity of infection，host range，inhibitor，disinfectant-tolerance，etc. were investigated. In order to prevent the contamination from phage P260，anti-phage 260 strains were screened by spontaneous mutations. As results，titer of P260 reached 3.45×1010PFU/mL，it had a certain host specificity，and not sensitive to Bacillus coagulans and Bacillus pumilus. P260 easily lost its activity at high temperature，i.e.，not heat-resistant，and its survival rate under 70℃ condition for 15 min decreased significantly. ClO2in 25 mg/L had a strong exterminate effect on P260. The 0.5% ammonium oxalate and ammonium citrate presented inhibition to P260. Optimal multiplicity of infection of phage P260 to the host was 0.01，one step growth curve showed that the incubation period was 15 min and the lytic stage started after 45 min. An anti-phage strain ZF-260 was obtained by spontaneous mutation. ZF-260 was not affected when adding phage P260，which indicated that ZF-260 was an excellent strain of anti-phage P260. In conclusion，the biological characteristics of phage P260 was studied，and ZF-260 with stable genetic and high viable cell count was obtained.

Bacillus subtilis；bacteriophages；inhibitor；disinfectant；spontaneous mutation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.021

2016-05-03

劉秀俠，女，碩士，研究方向：微生態(tài)制劑的研發(fā)及菌種選育；E-mail：liuxiuxia0208@126.com

穆熙軍，男，助理研究員，研究方向：微生態(tài)制劑的研發(fā)；E-mail：705490100@qq.com