基于四環素調控系統的葉綠體啟動子在大腸桿菌中活性檢測

于曉俊 曹紹玉 董玉梅 畢保良 張應華 許俊強

（云南農業大學 云南省滇臺特色農業產業化工程研究中心，昆明 650201）

基于四環素調控系統的葉綠體啟動子在大腸桿菌中活性檢測

于曉俊 曹紹玉 董玉梅 畢保良 張應華 許俊強

（云南農業大學 云南省滇臺特色農業產業化工程研究中心，昆明 650201）

旨在研究四環素調控系統在葉綠體基因工程中調控啟動子活性。以四環素基因及四環素特異性識別序列的核心操控區為基礎，首先合成帶有四環素核心操控區的prrnO1O2啟動子，通過酶切連接的方法連接到表達載體Bio3-GFP，并在大腸桿菌中驗證該啟動子的活性。結果表明，在該啟動子的驅動下GFP基因表達使菌落呈明亮綠色；構建四環素誘導下GFP基因的表達載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP，篩選出適應大腸桿菌生長的最高四環素使用濃度為5 μg/mL；然后構建四環素調控系統下的GFP表達載體，在未加入四環素時，prrnO1O2啟動子的功能被抑制，加入四環素后，GFP基因表達出綠色熒光蛋白。說明利用四環素調控系統可以在大腸桿菌中控制葉綠體啟動子prrnO1O2的活性，從而避免了核基因組對質體基因組的調控干擾，為進一步利用質體基因工程育種提供有效的方法和途徑。

四環素調控系統；葉綠體；啟動子；prrnO1O2；大腸桿菌

四環素誘導調控系統（tetracycline regulatory system）始于原核細胞，后應用于植物細胞，是目前研究最多的誘導調控系統。在大腸桿菌的四環素抗性操縱子的啟動子區存在兩個基本相同的操縱序列（operator）。轉座子Tn10編碼的TetR（tet repressor）蛋白可與上述操縱序列緊密結合，阻止轉錄起始復合物的形成，從而抑制四環素基因的表達。當外源的四環素分子進入細胞后，可特異結合TetR蛋白，改變其構象而從操縱序列脫離，轉錄起始復合物可以形成。按四環素誘導調控系統的表達特點，可分為激活系統Tet-on和抑制系統Tet-off兩類。添加小分子效應劑dox后轉錄調控子rtTA介導基因表達，雖然在迅速啟動基因表達，但是該系統受到dox長半衰期的抑制，所以Schmidt等［1］通過體內選擇分離了導致rtTA-介導報告基因表達有效快速關閉的充當dox拮抗劑的rtTA-結合多肽，這個肽代表了新型的效應分子，通過速轉換基因表達開、關補充“Tet-系統”。

Normanno等［2］利用TetRs模型尋找多陣列位點，并定量分析人類細胞單分子追蹤和單細胞蛋白-DNA聯合測定的搜索過程，發現TetRs探索細胞核并零散的通過3D擴散與非同源位點瞬態交互達到靶目標。Huang等［3］分析了藍藻細菌中人工TetR調控啟動子的壓制效應下滲漏基因表達，用L09啟動子與L10、L11、L12作對比，DNA開放概率間的差異在TetR結合位點上是很小的，表明了它們結合到TetR具有相同的動力學速率常數，L09啟動子泄露問題可能是由于下游區域RNA聚合酶—啟動子的相互作用的增強。此外，有報道分離了一組與細菌TetR互作來誘導TetR調控體內基因表達的多肽［4-7］，這些由1-16個氨基酸組成的多肽可替代Tc的功能，它們通過結合到TetR的Tc結合域發揮功能［8，9］。

葉綠體基因工程是隨著葉綠體基因組研究的深入而出現的。Boynton等［10］利用基因槍法，用帶有atpB野生型基因的葉綠體DNA直接轟擊3個含atpB突變型基因的衣藻細胞，使其完全恢復了光合能力。Svab等［11］利用類似技術轉化煙草，首次獲得了可穩定遺傳的葉綠體轉基因植物。目前葉綠體基因組轉化技術已在煙草、番茄、馬鈴薯、擬南芥、大豆、胡蘿卜、花椰菜、油菜、水稻和棉花等高等植物中獲得了成功［12］。Iamtham等［13］利用在同一質體中可進行多次重組的現象，通過短的正向重復序列的環出將選擇標記基因刪除，這是一個持續的過程，刪除過程復雜而無法控制。而后Hajdukiewicz等［14］建立了噬菌體Cre/loxp重組酶刪除系統，但操作過程復雜，并產生了一些不可預測的葉綠體基因組重排［15］，影響植物的正常生長。

四環素調控系統已成為分析生物基因功能的有用工具，Tc很容易通過細胞膜，因此可能在植物細胞中發揮作用。由于Tc屬于影響70S核糖體的抗生素，Tc對蛋白合成的影響可能在葉綠體和線粒體中［16］。使用一定濃度的Tc不抑制葉綠體和線粒體蛋白合成，但誘導轉基因植株表達仍是一個有效方法。本研究利用四環素誘導調控系統控制葉綠體啟動子的活性，避開核基因組對質體基因組的調控干擾，以期為進一步四環素調控的質體基因工程育種提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本式煙草、表達載體Bio3-GFP（帶有prrn啟動子、GFP報告基因）為本實驗保存；Trans T1、Trans（DE3）感受態細胞、TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶購自北京全式金公司；四環素購自于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據本實驗中所用到的表達載體及從NCBI中搜索煙草ppsbA啟動子序列，設計引物（表1）。

表1 本研究中所用的引物

1.2.2 prrnO1O2啟動子的合成 根據已知的葉綠體啟動子prrn，將Tet兩個核心操縱區嵌入該啟動子中（圖2），將該啟動子送昆明碩陽生物公司全基因合成，命名該啟動子為prrnO1O2。

1.2.3 煙草葉綠體ppsbA啟動子的克隆及活性鑒定 根據NCBI中煙草（Nicotiana tabacum）葉綠體基因組序列（GenBank：Z00044.2）設計引物。提取本氏煙草葉片基因組DNA，ppsbA-F/ppsbA-R為引物。RT-PCR擴增體系含ddH2O 14 μL，5×PCR 緩沖液（Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，引物各1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀釋模板DNA 1 μL。PCR 擴增參數為： 95℃ 2 min；95℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s；35個循環。將回收目的片段分別連接到pEASY-Blunt simple克隆載體，并轉化至大腸桿菌感受態細胞，取陽性克隆進行鑒定并測序。將克隆得到的ppsbA啟動子與Bio3-GFP載體用Hind III/Xba I雙酶切，回收目的條帶后連接，構建Bio3-ppsbAGFP載體，轉化大腸桿菌，并觀察菌體的顏色。

1.2.4 四環素誘導下的GFP基因的表達載體構建 用Tet-Sal/Tet-Kpn引物對擴增TetR，并連接到克隆載體構建pB-TetR，然后將pB-TetR載體與Bio3-ppsbA-GFP均使用Sal I/ Kpn I雙酶切構建Bio3-ppsbA-TetR（圖1-A）；將合成的prrnO1O2啟動子與Bio3-GFP載體均使用Hind III/Xba I雙酶切，回收目的片段后，T4連接酶連接，構建Bio3-prrnO1O2-GFP（ 圖1-B）；ppsbA-F/psbA-Hind引 物 對 擴 增ppsbA+TetR+psbA區段，后用Hind III單酶切該區段，構建四環素誘導下的GFP基因的表達載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP（圖1-C）。

圖1 四環素誘導下的GFP基因的表達載體示意圖

1.2.5 四環素誘導基因表達的濃度篩選 將構建正確的Bio3-ppsbA-TetR在60 μg/mL的Amp LB固體培養基上培養，同時設置不同四環素濃度梯度，分別為0、1、2.5、5、10、15和20 μg/mL，檢測不同Tc濃度下菌體的生長情況，用于篩選誘導大腸桿菌GFP正常生長、表達四環素濃度。

1.2.6 四環素調控下的葉綠體啟動子活性檢測 將構建好的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表達載體的菌株在60 μg/mL的Amp培養基平板上劃單線。一個平板未加入Tc，另一平板加入5 μg/mL的Tc，培養觀察兩平板中菌株的生長情況。

圖2 prrnO1O2啟動子序列結構

2 結果

2.1 prrnO1O2啟動子序列結構分析

第一個灰色底紋部分為操縱子O1，位于TATA-box（粗下劃線）的上游第2個堿基處；第一個灰色底紋部分為操縱子O2，位于prrn啟動子轉錄起始位點A（雙下劃線）下游第3個堿基處［17，18］。

2.2 煙草葉綠體ppsbA啟動子的克隆及活性鑒定

本研究中所構建的載體（圖1-C）含有兩個表達盒，故選用不同的啟動子來啟動不同的表達盒。以本氏煙草DNA為模板，擴增得到煙草葉綠體ppsbA啟動子，測序結果（圖3）表明大小為214 bp，含有原核啟動子的-35區（TTGACA）和-10區（TATACT），與煙草基因序列（GenBank：Z00044.2）的相似度為100%。構建Bio3-ppsbA-GFP載體，經過PCR和雙酶切鑒定正確（圖4泳道2）后，轉化大腸桿菌，在加入60 μg/mL的Amp LB固體培養基上，可以明顯的觀察到菌體呈現綠色（圖5-A），ppsbA啟動子啟動了下游GFP基因的表達，表明ppsbA啟動子在大腸桿菌中具有啟動活性。

圖3 煙草葉綠體啟動子ppsbA序列

2.3 三種表達載體的構建

如圖4所示，將構建四環素誘導下的GFP基因的表達載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP使用Hind III單酶切，獲得大小約為1 100 bp的ppsbA+TetR+ psbA表達盒；將Bio3-prrnO1O2-GFP表達載體用Hind III/Xba I雙酶切，得到約為250 bp的prrnO1O2啟動子；將Bio3-ppsbA-TetR使用Sal I/Kpn I雙酶切得到約為700 bp的TetR基因。綜上，構建的3個表達載體構建成功。

圖4 三種表達載體的酶切檢測

2.4 四環素誘導基因表達的濃度篩選

將構建Bio3-ppsbA-TetR在60 μg/mL的Amp LB固體培養基上，同時設置四環素濃度梯度，結果（表2）顯示，在四環素的濃度為5 μg/mL時大腸桿菌菌體正常生長，而10 μg/mL時大腸桿菌沒有生長，更高濃度時也沒有生長，說明四環素的使用最高濃度為5 μg/mL。

表2 不同濃度四環素對菌落生長的篩選

2.5 prrnO1O2啟動子活性在大腸桿菌中檢測

將構建好的表達載體Bio3-prrnO1O2-GFP轉化大腸桿菌Transetta（DE3）中，在含60 μg/mL的Amp LB固體培養基上，菌株大量生長，且GFP表達，菌體呈明亮的綠色（圖5-B）。表明新合成的葉綠體啟動子prrnO1O2能夠在大腸桿菌中啟動下游基因的表達。

2.6 四環素調控下的葉綠體啟動子活性檢測

構建四環素誘導下的GFP基因表達載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP。在60 μg/mL的Amp培養基上（未添加Tc），含有該表達質粒的大腸桿菌能夠正常生長，但是GFP基因沒有表達出綠色熒光蛋白（圖5-C），說明TetR蛋白表達后結合到prrnO1O2啟動子的核心操縱區上，抑制了prrnO1O2啟動子的功能；而后加入5 μg/mL的Tc，大腸桿菌能夠正常生長，GFP蛋白表達，顯示出綠色的菌體（圖5-D）。可以說明，ppsbA+TetR+psbA表達盒表達出的TetR蛋白抑制了prrnO1O2啟動子，在四環素存在的情況下重新釋放prrnO1O2啟動子活性，啟動下游基因表達。

3 討論

葉綠體基因在進化歷程中有許多轉移到核基因組中，遺留在葉綠體中的基因是功能必需的基因，且它們都具有原核性的遺傳表達體系。外源基因定點插入整合到葉綠體基因組，具有原核生物基因的特點［19］，所以在原核細胞中對葉綠體啟動子進行檢測，可以說明葉綠體啟動子的活性。現在對四環素的TetR-tetO的作用分子機理已經明確：TetR結合大腸桿菌轉座子Tn10的兩個核心操縱子tetO序列（圖1）DNA，行使轉錄遏制作用，四環素阻止TetR結合tetO序列，使TetR解除轉錄抑制作用。O1、O2操縱子均有19 bp，一個核心堿基以及兩個反向互補的區域。TetR氨基酸N端的螺旋-轉角-螺旋基序與每個區域直接作用，且特異性極高［17，18］。因此本研究參考該分子機理，將tet兩個核心操縱區嵌入prrn啟動子中，并連接到GFP基因的上游，在大腸桿菌中表達出綠色熒光蛋白，說明新合成的啟動子能夠啟動下游基因的表達。

圖5 prrnO1O2啟動子及四環素誘導下的GFP在大腸桿菌中表達情況

植物葉綠體psbA啟動子是葉綠體基因工程中常用的啟動子，對于該啟動子的研究早有報道。Elhai［20］證明啟動子psbA是魚腥藻7120的內源強啟動子，成為魚腥藻穿梭表達載體最常用的啟動子之一。張偉等［21］成功地從萊茵衣藻基因組中克隆出葉綠體psbA啟動子片段，獲得了氨芐青霉素和壯觀霉素抗性菌落，驗證了啟動子活性；晁岳恩等［22］對水稻、小麥、玉米、高粱、大豆、番茄和馬鈴薯等11種植物的葉綠體psbA 基因進行了分析，結果表明，11種植物psbA基因的ENC（effective number condon）值都小于40，顯示出了明顯的密碼子偏好性。由于本研究中的Bio-GFP中的prrn啟動子與新合成的prrnO1O2序列基本相同，不便于表達載體的構建與檢測，故本研究從煙草基因組中擴增得到葉綠體啟動子psbA，并構建了該啟動子下的Bio3-ppsbA-GFP驗證該啟動子的活性，并表明該啟動子能夠啟動GFP基因的表達。

已有報道水培中含有1 mg/L的Tc對植株沒有生理影響［23-26］。對四環素誘導的轉基因煙草進行了Tc誘導濃度的篩選，結果表明低濃度的Tc（0.1、0.2 mg/L）的誘導效果最好。當用0.2 mg/L的Tc處理TetR轉基因煙草時，葉綠素含量達到最高。四環素作為誘導劑的通常使用濃度為200 mg/L，但在大腸桿菌中Tet調控的濃度不同［27］。LoVullo等［28］將Tet操縱子序列克隆到土拉熱桿菌ESL啟動子中，并帶有可表達的TetR，CDABE位于雜合四環素調控啟動子的下游，加入無水四環素后轉錄起始，誘導濃度在達到500 mg/L時細菌無法生長。本研究中適用的E. coli（DE3）誘導表達的最高濃度為5 μg/mL，高于上述的土拉桿菌最高使用濃度相同。構建的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表達載體在無Tc誘導時，表達出來的TetR蛋白結合到prrnO1O2啟動子的核心操縱子區域，使該合成的啟動子無法驅動下游GFP基因的表達；而在加入5 μg/mL的Tc時，prrnO1O2啟動子重新驅動下游GFP基因的表達，使菌落呈現出綠色，表達量降低，可能是由于aadA抗性基因被切除，影響了GFP的表達，具體原因仍需進一步驗證。

4 結論

帶有四環素核心操縱區的prrnO1O2啟動子和葉綠體ppsbA啟動子均在大腸桿菌中具有啟動活性，在四環素調控下葉綠體prrnO1O2啟動子能夠啟動下游GFP基因的表達，在大腸桿菌中表現出綠色菌體。

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（責任編輯 狄艷紅）

Activity Detection of Chloroplast Promoter Based on Tetracycline Regulatory System in Escherichia coli

YU Xiao-jun CAO Shao-yu DONG Yu-mei BI Bao-liang ZHANG Ying-hua XU Jun-qiang
（Dian-Tai Engineering Research Center for Characteristic Agriculture Industrialization of Yunnan Province/Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

In order to study tetracycline regulatory system regulating the activity of promoter in chloroplast genetic engineering，having the tetracycline（Tet）gene and the core regulatory area of TetR（Tet repressor）specific recognition sequences as the basis，the promoter prrnO1O2 with tetracycline core regulatory area was synthetized，then ligated to expression vector Bio3-GFP，and the activity of the promoter was validated in Escherichia coli. The expression of the GFP gene driven by the promoter led colonies to be bright green. The expression vector Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP for GFP gene induced by Tet was constructed，and screening experiment confirmed that the highest concentration of tetracycline for the proper growth of E. coli was 5 μg/mL. Finally，GFP expression vector based on tetracycline regulatory system was constructed，the function of prrnO1O2 promoter was suppressed while without adding tetracycline. GFP gene expressed to be green fluorescent protein after adding tetracycline. These results indicated that tetracycline regulatory system controlled the activity of chloroplasts promoter prrnO1O2 in E. coli，thus avoiding the regulation interference of nuclear genome to plastid genome，and which provides effective ways and methods to plastid genetic engineering breeding further.

tetracycline regulatory system；chloroplast；promoter；prrnO1O2；Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.022

2016-04-25

國家自然科學基金項目（31560560，30972012），云南省應用基礎研究計劃項目（2015FD019）

于曉俊，男，碩士研究生，研究方向：園藝蔬菜育種；E-mail：1564810854@qq.com

張應華，男，教授，碩士生導師，研究方向：蔬菜育種與生物技術；E-mail：zhangyh9519@163.com許俊強，男，講師，研究方向：蔬菜分子生物學；E-mail：xujunqiang101@163.com