耐輻射異常球菌dlp基因缺失突變株構建及其生物學功能研究

劉小利江世杰薛冬劉盈盈吳小麗馮帥韓佳慧汪雨舟平淑珍王勁

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081；3. 四川大學生命科學學院，成都 610065；4. 中國人民大學附屬中學，北京 100080）

耐輻射異常球菌dlp基因缺失突變株構建及其生物學功能研究

劉小利1，2江世杰2，3薛冬2劉盈盈2吳小麗1，2馮帥1，2韓佳慧2汪雨舟4平淑珍2王勁1，2

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081；3. 四川大學生命科學學院，成都 610065；4. 中國人民大學附屬中學，北京 100080）

耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans，DR）因其具有對非生物脅迫超強的抵抗能力而備受關注。旨在了解該菌親水蛋白Dlp在細胞耐受非生物脅迫中的作用，采用融合PCR和基因同源重組技術，獲得了dlp基因缺失突變株Δdlp，對野生型DR及突變株Δdlp進行非生物脅迫。結果表明，dlp的缺失導致DR細胞對高鹽和氧化脅迫敏感。體外檢測氧化脅迫條件下Dlp蛋白對蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的保護，結果顯示，Dlp蛋白的加入能緩解氧化脅迫條件下MDH、LDH酶活性的損失。由此表明，親水蛋白Dlp增強了耐輻射異常球菌對非生物脅迫的抗性，并能以類似分子伴侶的形式保護脅迫條件下酶的活性。

耐輻射異常球菌；基因突變；親水蛋白Dlp；非生物脅迫；酶活性

非生物脅迫，如干旱、高鹽、高滲等都會直接或間接引起細胞水分缺失，導致蛋白聚集、脂質過氧化、DNA損傷，最終對生物體的生物學功能產生造成嚴重影響［1-4］。研究表明親水蛋白是一類甘氨酸含量大于6%，親水指數大于1，廣泛存在于植物、真菌、細菌中的小分子蛋白［5，6］。親水蛋白擁有高比例的親水性氨基酸，能形成無規卷曲結構，更好地結合水分子，也可作為分子伴侶穩定蛋白構象，保護脅迫條件下酶、蛋白的活性［7-12］，LEA蛋白作為親水蛋白的重要成員已成為近年來的研究熱點［5，12-18］。

LEA蛋白是一種逆境響應蛋白，低溫、干旱、鹽漬、ABA等均可誘導其表達。其具有廣泛的生物學功能，如清除活性氧自由基、穩定膜結構、保護酶活性等。Battaglia等［15］根據LEA蛋白的保守結構域及親水系數等將其分為7個家族，其中，LEA3蛋白擁有由11個氨基酸組成的保守結構域（ΦΦΩXΦΨΩΨΦXΩ）［16，17］，可形成親水的α螺旋［14］，能夠避免非生物脅迫引起的細胞內離子損傷［18］，保護酶的活性不受抑制，尤其是新陳代謝過程中蘋果酸脫氫酶（MDH）及乳酸脫氫酶（LDH）的活性［19，20］。目前關于LEA3蛋白功能已有許多報道，如鷹嘴豆PM2基因在大腸桿菌中異源表達能提高大腸桿菌的耐鹽性［21］；TaLEA2基因能改善轉基因酵母在山梨醇脅迫下的生長情況［22］；過表達蛋白TaLEA2與HVA1均可增強酵母對低溫和高滲脅迫的抗性［23］。

Makarova等［24-26］報道耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）基因dlp（dr0105）、dr1172編碼干燥相關蛋白，為具有較高親水性的LEA3蛋白。通過生物信息學分析基因dlp編碼蛋白Dlp氨基酸組成及結構特征發現，此蛋白分子含量小，含有大量α螺旋結構，高度親水，含有與LEA3家族蛋白保守結構域相似的串聯重復基序，推測為LEA3類似蛋白，將其命名為Dlp（Deinococcus radiodurans LEA3 protein）。本研究構建dlp缺失突變株，探索非生物脅迫條件下其對細胞生存的影響，并測定體外氧化脅迫條件下Dlp蛋白對MDH和LDH酶活性的保護作用，旨在進一步研究非生物脅迫條件下Dlp蛋白的抗逆功能及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及培養條件 耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans，DR1.633）購自中國科學院微生物菌種保藏中心；高頻轉化受體菌大腸桿菌Escherichia coli trans 109，BL21（DE3）購自北京全式金生物技術公司；pKatAPH3質粒（攜帶Km抗性基因）、原核表達載體pET32a為本實驗室保存。大腸桿菌用LB培養基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，固體培養基含1.5%瓊脂）在37℃條件下培養；耐輻射異常球菌使用TGY培養基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，0.1% glucose；固體培養基含1.5%瓊脂）于30℃下培養。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、BSA購自New England Biolabs公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，常規質粒提取試劑盒、膠回收純化試劑盒購自Magen公司；PrimeStar HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自Promega公司；MDH（來自豬心臟）、LDH、NADH、草酰乙酸購于Sigma公司；其他生化試劑均為分析純。實驗涉及到的引物合成及測序均由華大生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Dlp蛋白的生物信息學分析 從NCBI中獲取耐輻射異常球菌基因dlp序列及其編碼蛋白Dlp的氨基酸序列信息，利用軟件DNAMAN和MEGA6、Blast檢索GenBank進行多重序列比較及同源性分析，并構建進化樹；利用Protparam（http://web.expasy. org/protparam/）在線預測Dlp蛋白的分子質量、等電點、穩定系數等性質；結合Kyte等［6］總結出的氨基酸疏水指數，利用Protscale（http://web.expasy. org/protscale/）進行Dlp蛋白的親/疏水性分析；利用DNAMAN及GOR Ⅳ程序（https://npsa-prabi.ibcp. fr/）預測Dlp蛋白的二級結構；利用Radar進行蛋白重復基序查詢（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/radar/）。

1.2.2 突變株Δdlp、異源表達菌株E32a-dlp的構建 從NCBI數據庫中獲取dlp基因及其上、下游同源臂片段U、D序列，從質粒pKatAPH3獲得帶有啟動子的卡那抗性基因片段（Km）序列，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件進行PCR引物設計（表1）。通過融合PCR反應：98℃預變性5 min；98℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸3 min，13個循環；72℃終延伸5 min。將從pKatAPH3質粒上擴增的Km反向插入到dlp基因的上、下游U、D之間，獲得三片段融合產物UKD（2 806 bp），將融合產物通過線性轉化至野生型D. radiodurans中，通過50 μg/mL卡那霉素抗性篩選最終獲得缺失突變株Δdlp。使用表1中P3/P4、P7/P8、P9/P10及P1/P6 4對引物對Δdlp進行PCR擴增驗證，并以野生型D. radiodurans為對照，PCR擴增的融合產物全長片段QUKD進行測序進一步驗證實驗結果的正確性。從DR基因組上擴增帶有酶切位點BamH I/ Hind III的片段dlp（B/H），將其與雙酶切后的pET32a載體片段連接獲得重組質粒pET32a-dlp，轉化至E. coli BL21獲得重組菌株E32a-dlp。轉化空質粒pET32a作為對照菌株（E32a）。PCR、BamH I/Hind III雙酶切陽性克隆送至華大生物技術公司測序。

表1 突變株Δdlp與異源表達菌株E32a-dlp構建所用引物

1.2.3 氧化及高鹽脅迫條件下野生型DR與突變株Δdlp表型分析 從劃線培養的平板上挑取活化的野生型DR與突變株Δdlp單菌落，接種至2 mL TGY液體培養基中（突變株Δdlp培養基中含有10 μg/mL Km抗生素），30℃振蕩培養至對數中期，將培養好的種子液以1%的接種量轉接到新鮮的20 mL TGY液體培養基中（突變株培養基中含有10 μg/mL Km抗生素），培養至對數初期（OD600約為0.6-0.8），取1 mL菌液（保證DR、Δdlp菌體量一致）。分別同時向DR、Δdlp加入27% H2O2母液，使其終濃度為60 mmol/L和80 mmol/L，對照組不加H2O2，混勻樣品30℃避光30 min。3 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體重懸于1 mL 4 mol/L和5 mol/L NaCl懸液中，對照菌株重懸于1 mL無菌水中，30℃，200 r/min溫育6 h。處理后的菌懸液使用無菌水進行梯度稀釋混勻，每個稀釋梯度（10-1-10-5）各取10 μL點接于TGY固體培養基上，30℃倒置培養2-3 d，觀察DR和Δdlp在培養基上的生長情況，實驗進行3次獨立重復。

1.2.4 Dlp蛋白的表達與純化 過夜培養的重組大腸桿菌E32a-dlp按1%接種至500 mL含Amp（50 μg/mL）的新鮮LB液體培養基中，37℃培養至OD600≈0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，16℃過夜誘導表達。8 000 r/min離心10 min收集菌體，用1/20體積NTA-0 Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10% Glycerol，pH7.9）重懸菌體，超聲破碎細胞，15 000 r/min、15 min離心收集上清。使用鎳柱親和層析純化Dlp蛋白，使用不同咪唑濃度（10、20、60、80和200 mmol/L）的NTA-0緩沖液梯度洗脫，分別收集各梯度洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化情況，確定最終洗脫濃度，收集純度較高的Dlp融合蛋白，并采用Brandford法測定蛋白濃度，-80℃保存備用。

1.2.5 氧化脅迫下MDH、LDH活性的測定 氧化還原酶MDH能催化“蘋果酸+NAD+草酰乙酸+NADH+H+”反應，LDH能催化“乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+”反應，NADH、NAD+分別在340 nm和260 nm波長處有最大吸收峰。參照Reyes等［1，19］體外檢測MDH、LDH活性的方法，通過檢測A340變化計算MDH、LDH的活性。酶活性測定所用緩沖液如下：MDH酶溶解液（50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.2），LDH酶溶解液（25 mmol/L Tris-H Cl，pH7.2），MDH反應液（0.2 mmol/L草酰乙酸、0.2 mmol/L NADH、150 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.5），LDH反應液（100 mmol/L KCl、2 mmol/L丙酮酸鈉、0.15 mmol/L NADH、25 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）。

參照表2，按照MDH、LDH與蛋白1∶5的摩爾比混合樣品，選用BSA作為正對照，不加實驗蛋白作為空白對照。將MDH、LDH混合樣品用100和200 mmol/L H2O2分別遮光處理1 h、2 h，取處理后的樣品10 μL混勻到1 mL對應反應液中，測定反應體系起始1 min內A340的變化，根據A340吸收值的減少計算MDH、LDH酶活性變化。每個實驗重復3次。

表2 MDH、LDH酶活性測定的樣品混合體系/μL

2 結果

2.1 Dlp蛋白的生物信息學分析

基因dlp位于D. radiodurans Ⅰ號染色體上，全長492 bp，編碼蛋白由163個氨基酸組成。氨基酸序列比對（圖1-A）顯示，耐輻射異常球菌中含有兩個LEA3家族蛋白Dlp（DR0105）和DR1172，其氨基酸序列一致性較低，僅為16.11%；Dlp蛋白與來源于D. gobiensis的DGo_CA1631、Cyberlindnera jadinii的ODV76513序列一致性分別為22.09%和22.94%。系統發育分析結果（圖2-B）顯示，Dlp蛋白與來自Lachancea lanzarotensis的蛋白親緣關系最近，而與同一來源的DR1172蛋白進化關系較遠。通過以上分析，推測Dlp蛋白是耐輻射異常球菌所特有的蛋白。

Dlp蛋白分子量為17.83 kD，理論等電點（pI）為5.25，不穩定系數為30.66（＜40），是一類穩定蛋白。親/疏水性分析（圖2-A）顯示，Dlp蛋白疏水氨基酸含量顯著少于親水性氨基酸，平均疏水指數（GRAVY）為-1.263，屬于親水蛋白。二級結構預測（圖2-B）顯示，Dlp蛋白有90.18%（147個）氨基酸殘基可能形成α螺旋；2.45%（4個）氨基酸殘基可能形成延伸鏈；7.36%（12個）氨基酸殘基可能形成無規卷曲。利用Radar進行蛋白重復基序預測（表3），Dlp蛋白含有5個由16個氨基酸組成的串聯重復，與LEA3家族11個氨基酸組成的串聯重復序列類似。

2.2 dlp基因缺失導致DR對氧化、高鹽脅迫敏感

通過融合PCR方法成功構建dlp基因缺失突變株Δdlp。對Δdlp進行PCR驗證，結果（圖3）顯示，卡那抗性基因成功替換dlp基因整合到DR基因組中，QUKD測序結果進一步驗證結果的正確性。

對DR、Δdlp進行不同濃度H2O2、NaCl脅迫處理，結果（圖4）顯示，正常培養條件下（未加H2O2和NaCl），DR與Δdlp生存能力保持一致；而在60 mmol/L H2O2脅迫處理30 min后，Δdlp對H2O2敏感性高于野生型DR，80 mmol/L H2O2處理30 min后，Δdlp的生存能力急劇下降；同時，在經4 mol/L或5 mol/L NaCl處理 6 h后也表現出與H2O2沖擊相似的結果（圖4）。該結果表明，Dlp蛋白對耐輻射異常球菌抵抗高鹽、氧化脅迫過程中起到了重要作用。

2.3 Dlp蛋白的表達與純化

異源表達菌株E32a-dlp的PCR及酶切驗證結果如圖5-A所示。BamH I / Hind III酶切片段與PCR擴增片段大小一致，測序結果進一步證實重組質粒pET32a-dlp的正確性。對Dlp蛋白進行表達純化，SDS-PAGE電泳分析結果（圖5-B）顯示，以未誘導的E32a為對照，E32a-dlp出現1條與Dlp融合蛋白大小（40.83 kD）吻合的條帶。0.2 mmol/L IPTG誘導下Dlp蛋白能大量表達，用含10 mmol/L咪唑的NTA-0洗脫液洗脫能去除大量雜蛋白，含60 mmol/L咪唑的NTA-0洗脫液洗脫能獲得較高純度的目標融合蛋白Dlp，收集NTA-60洗脫液，用Brandford法測定其濃度為3.3 mg/mL，-80℃保存。

圖1 Dlp蛋白序列比對（A）及系統發育分析（B）

2.4 氧化脅迫條件下Dlp蛋白對MDH、LDH活性的保護

為驗證脅迫條件下Dlp蛋白對MDH與LDH酶活性的保護作用，分別用100和200 mmol/L H2O2對酶混合樣品進行避光處理，測定MDH和LDH酶活性，每個實驗重復3次，將未脅迫樣品的酶活性視為100%，對實驗結果進行數據處理。MDH樣品進行1 h避光處理后其酶活性如圖6-A所示，100 mmol/L H2O2處理后，MDH的酶活性下降為31%，200 mmol/L H2O2處理后，MDH的酶活性下降更為明顯（僅剩9.9%）；而加入Dlp蛋白后，100 mmol/L H2O2處理后MDH酶活性為47.3%，200 mmol/L H2O2處理后MDH的酶活性為14.9%，其保護作用高于蛋白穩定劑BSA。100和200 mmol/L H2O2對LDH樣品進行2 h避光處理后LDH酶活性的變化情況與脅迫條件下MDH酶活性的變化類似（圖6-B）。以上結果表明，在氧化脅迫條件下Dlp蛋白能夠保護MDH、LDH酶活性，且其保護作用強于BSA。

圖2 Dlp蛋白的親/疏水性分析（A）及二級結構預測（B）

表3 Dlp蛋白重復基序

圖3 突變株Δdlp的PCR驗證

3 討論

LEA3蛋白是相對分子質量在10-30 kD的一組小分子親水多肽，其Cys、Trp、Phe、Tyr相對含量低，而Ala、Arg、Glu、Gln、Gly含量較高［14］，包含11個氨基酸組成的保守結構域（ΦΦΩXΦΨΩΨΦXΩ）可形成α螺旋結構，可以使LEA蛋白之間形成二聚體結構［14-17］。本研究對Dlp蛋白進行生物信息學分析發現，Dlp蛋白Cys、Trp、Phe、Tyr總含量為1.2%，而Ala、Arg、Glu、Gln、Gly 總含量56.4%，擁有90.18% α-螺旋結構，為小分子親水蛋白，這與LEA3蛋白的特征相吻合［24-26］；但Dlp蛋白包含16個氨基酸組成的5個串聯重復基序，該序列特征不同于典型的LEA3蛋白保守結構域，故本研究Dlp蛋白為LEA3類似蛋白。

LEA3蛋白高比例的α-螺旋具有高度親水性，這一結構特點能保障其自身具有高度的柔性和流動性，促使分子內氫鍵的形成，無規卷曲結構可使其在各個方向上拉伸、彎曲和伸展，從而起到穩定蛋白和膜結構、束縛無機離子、結合水分子、防止細胞質結晶等作用，進而保護細胞結構［1，27，28］，這預示著非生物脅迫逆境下LEA3蛋白的積累對細胞具有一定的保護作用。高鹽與氧化脅迫均會導致體內活性氧的積累，引發細胞組分破壞、脂質過氧化、蛋白聚集及DNA損傷［19，29］。野生型和突變株的非生物脅迫實驗結果顯示，在高鹽和氧化脅迫條件下野生型和突變株的生存能力顯著弱于正常培養條件下的菌株，且dlp基因的缺失使得細胞對高鹽、強氧化脅迫更為敏感，生存能力下降的更為顯著。表明Dlp蛋白的表達對耐輻射異常球菌耐鹽、抗氧化能力起到了促進作用，其抗氧化功能與華躍進等的研究結果一致［30-32］。

圖4 不同濃度H2O2、NaCl脅迫對DR、Δdlp生存能力的影響

圖5 異源表達菌株E32a-dlp的驗證（A）及Dlp蛋白表達純化（B）

圖6 H2O2脅迫條件下Dlp對MDH（A）及LDH（B）酶活性的保護

研究表明，大多數LEA3蛋白可作為分子伴侶協助蛋白折疊成有活性的結構，防止蛋白聚集，形成天然復合物從而保護蛋白和酶活性［10，30］。氧化脅迫產生大量ROS，它們會攻擊氨基酸側鏈及肽鏈骨架，導致蛋白發生聚集及片段化，蛋白溶解性降低、蛋白功能遭到破壞、蛋白酶失活［33-36］。MDH、LDH均是對脫水敏感的酶，經脅迫處理后結構發生變化，Reyes等［8，19］對MDH、LDH進行反復凍融處理發現它們的酶活性均有不同程度的下降，保護蛋白的加入使其活性下降趨勢得到緩解。在本研究中，H2O2脅迫下MDH、LDH酶活性也迅速下降（分別為31%、42.5%），隨著H2O2濃度的加大，MDH、LDH酶活性會持續下降，Dlp蛋白的添加減緩了MDH、LDH酶活性的下降，表明Dlp蛋白對氧化脅迫條件下MDH、LDH的酶活性具有保護作用，推測Dlp蛋白可能作為分子伴侶對MDH、LDH酶活性發揮保護作用，對于其具體作用機制還需進一步實驗驗證。

4 結論

本研究成功構建了dlp基因缺失突變株Δdlp及其外源表達菌株E32a-dlp。生物信息學分析顯示Dlp蛋白為LEA3類似蛋白，是耐輻射異常球菌特有的小分子親水蛋白，非生物脅迫實驗表明該蛋白在耐輻射異常球菌耐鹽、抗氧化過程中發揮重要作用，體外酶活測定實驗顯示其能夠保護氧化脅迫條件下MDH和LDH的酶活性。

［1］ Goyal K, Walton LJ, Tunnacliffe A. LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress［J］. Biochemical Journal, 2005, 388（1）：151-157.

［2］ Caramelo JJ, Iusem ND. When cells lose water：Lessons from biophysics and molecular biology［J］. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2009, 99（1）：1-6.

［3］ Potts M. Desiccation tolerance：a simple process?［J］. Trends in Microbiology, 2001, 9（11）：553-559.

［4］ Hansen JM, Go YM, Jones DP. Nuclear and mitochondrial compartmentation of oxidative stress and redox signaling［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2006, 46：215-234.

［5］ Garay-Arroyo A, Colmenero-Flores JM, Garciarrubio A, et al. Highly hydrophilic proteins in prokaryotes and eukaryotes are common during conditions of water deficit［J］. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275（8）：5668-5674.

［6］ Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein［J］. Journal of Molecular Biology, 1982, 157（1）：105-132.

［7］ Anchordoquy TJ, Carpenter JF. Polymers protect lactate dehydrogenase during freeze-drying by inhibiting dissociation in the frozen state［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1996, 332（2）：231-238.

［8］ Soulages JL, Kim K, Walters C, et al. Temperature-induced extended helix/random coil transitions in a group 1 late embryogenesisabundant protein from soybean［J］. Plant Physiology, 2002, 128（3）：822-832.

［9］ Reyes JL, Campos F, Wei H, et al. Functional dissection of hydrophilins during in vitro freeze protection［J］. Plant, Cell & Environment, 2008, 31（12）：1781-1790.

［10］ Grelet J, Benamar A, Teyssier E, et al. Identification in pea seed mitochondria of a late-embryogenesis abundant protein able to protect enzymes from drying［J］. Plant Physiology, 2005, 137（1）：157-167.

［11］ Chakrabortee S, Tripathi R, Watson M, et al. Intrinsically disordered proteins as molecular shields［J］. Molecular BioSystems, 2012, 8（1）：210-219.

［12］ Hara M, Terashima S, Fukaya T, et al. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco［J］. Planta, 2003, 217（2）：290-298.

［13］ Li RH, Liu GB, Wang H, et al. Effects of Fe3+and Zn2+on the structural and thermodynamic properties of a soybean ASR protein［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2013, 77（3）：475-481.

［14］ Wu G, Zhang H, Sun J, et al. Diverse LEA（late embryogenesis abundant）and LEA-like genes and their responses to hypersaline stress in post-diapause embryonic development of Artemia franciscana［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology, 2011, 160（1）：32-39.

［15］ Battaglia M, Olvera-Carrillo Y, Garciarrubio A, et al. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins［J］. Plant Physiology, 2008, 148（1）：6-24

［16］ 劉洋, 邢鑫, 李德全. LEA蛋白的分類與功能研究進展［J］.生物技術通報, 2011（8）：36-43.

［17］ Tunnacliffe A, Wise MJ. The continuing conundrum of the LEA proteins［J］. Naturwissenschaften, 2007, 94（10）：791-812.

［18］ Swire-Clark GA, Marcotte Jr WR. The wheat LEA protein Em functions as an osmoprotective molecule in Saccharomyces cerevisiae［J］. Plant Molecular Biology, 1999, 39（1）：117-128.

［19］ Reyes JL, Rodrigo MJ, Colmenero-flores JM, et al. Hydrophilins from distant organisms can protect enzymatic activities from water limitation effects in vitro［J］. Plant, Cell & Environment, 2005, 28（6）：709-718.

［20］ Nakayama K, Okawa K, Kakizaki T, et al. Arabidopsis Cor15am is a chloroplast stromal protein that has cryoprotective activity and forms oligomers［J］. Plant Physiology, 2007, 144（1）：513-523.

［21］ Liu Y, Zheng Y. PM2, a group 3 LEA protein from soybean, andits 22-mer repeating region confer salt tolerance in Escherichia coli［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 331（1）：325-332.

［22］ 俞嘉寧, 張林生, 張勁, 等. 小麥耐逆基因-TaLEA3的克隆及在酵母中的功能分析［J］. 生物工程學報, 2004, 20（6）：832-838.

［23］ Yu JN, Zhang JS, Shan L, et al. Two new group 3 LEA genes of wheat and their functional analysis in yeast［J］. Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47（11）：1372-1381.

［24］ Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, et al. Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative genomics［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001, 65（1）：44-79.

［25］ Omelchenko MV, Wolf YI, Gaidamakova EK, et al. Comparative genomics of Thermus thermophilus and Deinococcus radiodurans：divergent routes of adaptation to thermophily and radiation resistance［J］. BMC Evolutionary Biology, 2005, 5（1）：1.

［26］ Khan F, Singh SP, Mishra BN. Conservation of the LexA repressor binding site in Deinococcus radiodurans［J］. J Integr Bioinform, 2008, 5：86-92.

［27］ Browne J, Tunnacliffe A, Burnell A. Anhydrobiosis：plant desiccation gene found in a nematode［J］. Nature, 2002, 416（6876）：38.

［28］ Park BJ, Liu Z, Kanno A, et al. Genetic improvement of Chinese cabbage for salt and drought tolerance by constitutive expression of a B. napus LEA gene［J］. Plant Science, 2005, 169（3）：553-558.

［29］ Tompa P, Kovacs D. Intrinsically disordered chaperones in plants and animals［J］. Biochemistry and Cell Biology, 2010, 88（2）：167-174.

［30］ Liu Y, Gao ZQ, She Z, et al. The structural basis of the response regulator DrRRA from Deinococcus radiodurans［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 417（4）：1206-1212.

［31］ Wang L, Xu G, Chen H, et al. DrRRA：a novel response regulator essential for the extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans［J］. Molecular Microbiology, 2008, 67（6）：1211-1222.

［32］ Wang L, Hu J, Liu M, et al. Proteomic insights into the functional basis for the response regulator DrRRA of Deinococcus radiodurans［J］. International Journal of Radiation Biology, 2016, 92（5）：273-280.

［33］ Liu F, Pang SJ. Stress tolerance and antioxidant enzymatic activities in the metabolisms of the reactive oxygen species in two intertidal red algae Grateloupia turuturu and Palmaria palmate［J］. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2010, 382（2）：82-87.

［34］ Fredrickson JK, Li SM, Gaidamakova EK, et al. Protein oxidation：key to bacterial desiccation resistance?［J］. The ISME Journal, 2008, 2（4）：393-403.

［35］ Daly MJ, Gaidamakova EK, Matrosova VY, et al. Protein oxidation implicated as the primary determinant of bacterial radioresistance［J］. PLoS Biol, 2007, 5（4）：e92.

［36］ Gebicki S, Gill KH, Dean RT, et al. Action of peroxidases on protein hydroperoxides［J］. Redox Report, 2002, 7（4）：235-242.

（責任編輯 馬鑫）

Construction and Biological Characterization of Gene dlp Deletion Mutant of Deinococcus radiodurans R1

LIU Xiao-li1，2JIANG Shi-jie2，3XUE Dong2LIU Ying-ying2WU Xiao-li1，2FENG Shuai1，2HAN Jia-hui2WANG Yu-zhou4PING Shu-zhen2WANG Jin1，2
（1. College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621000；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065；4. The High School Affiliated to Renmin University of China，Beijing 100080）

Deinococcus radiodurans（DR）has drawn growing attentions for its superior resistance to abiotic stress. To investigate the effect of the hydrophilic protein Dlp in cell tolerance to abiotic stress，the dlp deletion mutant strain（Δdlp）was obtained by fusion PCR and homologous recombination in vivo. The assays of wild strain DR and mutant Δdlp were analyzed under abiotic stress. The results showed that the deletion of dlp gene in D. radiodurans led cells to be more sensitive to high-salt and oxidative stresses. The in vitro protective effect of Dlp protein on the activities of MDH and LDH was measured under oxidative stress condition；and the data demonstrated that the addition of Dlp protein alleviated the loss of activities of MDH and LDH under oxidative stress. Our findings indicated that hydrophilic protein Dlp enhanced the resistance of D. radiodurans to abiotic stresses，and functioned as chaperone-like protein to protect enzyme activity under abiotic stresses.

Deinococcus radiodurans；gene mutant；hydrophilic protein Dlp；abiotic stress；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.023

2016-11-07

國家重點基礎研究發展計劃（“973計劃”）（2013CB733903）

劉小利，女，碩士研究生，研究方向：特殊環境微生物功能基因資源利用；E-mail：lxl615wzy@sina.com

王勁，女，博士，研究員，研究方向：微生物分子遺傳學；E-mail：wjdsz@vip.sina.com