缺氧預處理對大鼠鈍性心肌挫傷保護作用的研究

摘要：目的 觀察缺氧預處理(HPC)對大鼠鈍性心肌挫傷的保護作用，并進一步探討其機制。方法 Wistar大鼠建立鈍性心臟挫傷模型，并用常規HE染色、免疫組織化學技術(SP法)，結合計算機彩色圖像分析技術觀察大鼠實驗性心臟挫傷及缺氧預處理后Bcl-2、肌鈣蛋白T(cTnT)的染色變化。結果 免疫組織化學染色①心臟挫傷2h可見大晟心肌cTnT明顯脫失，隨著時間延長挫傷組cTnT脫失逐漸加重，與單純挫傷組相比缺氧預處理組cTnT的脫失顯著減輕(P＜0.05)，對照組心肌未見明顯脫失；②對照組有少量Bcl-2表達，單純挫傷組隨時間延長Bcl-2表達逐漸增多，與單純挫傷組相比缺氧預處理組BCl-2表達明顯增強(p＜0，05)。結論 Bcl-2的表達說明其參與了心臟挫傷后心肌損傷的形成。缺氧預處理對大鼠鈍性心肌挫傷有保護作用，表現為HPC能減輕心肌細胞cTnT的脫失及促進Bcl-2的表達。

關鍵詞：缺氧預處理；心肌挫傷；肌鈣蛋白T；Bcl-2；大鼠

中圖分類號：R542.2 R256.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1210-03

心臟鈍性挫傷(myocardial contusion，MC)最常見于交通事故，由于胸腔受方向盤直接撞擊引起，導致心臟在胸骨和脊椎之間受壓。其他原因還有高處墜落、爆炸傷、運動創傷、上腹部擠壓等。缺氧預處理(hypoxic preconditioning，HPC)是指預先反復短暫缺氧，可使組織或細胞對后續嚴重的氧化應激損傷產生抵抗或耐受的一種生物學效應。HPC的方法簡便易行，可以廣泛應用于臨床和實驗室研究。實驗證明HPC對缺血，再灌注(ischmfia/reperfusion，Z/R)及缺氧／復氧損傷有顯著的保護作用，但缺氧預處理是否對心臟挫傷有保護作用尚未見報道。本試驗應用健康成年大鼠建立鈍性心臟挫傷模型，并用常規HE染色、免疫組織化學技術(SP法)，結合計算機彩色圖像分析技術觀察大鼠實驗性心臟挫傷及缺氧預處理后Bcl-2、肌鈣蛋白T(cTnT)的染色變化，探討HPC是否對鈍性心臟挫傷產生保護作用并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料 自制生物撞擊裝置及大鼠缺氧預處理裝置，MIAS-2000圖像分析系統(四川川大智勝軟件股份有限公司)，TKR-200C小動物呼吸機(江西特力麻醉呼吸設備有限公司)，BL-410生物機能試驗系統(成都泰盟科技有限公司)，健康成年Wistar大鼠(山西醫科大學實驗動物中心)，免疫組化SP試劑盒、cTnT單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 大鼠缺氧預處理模型的制備 參照Sasaki等方法，以挫傷前以氧(10％)和氮(90％)的混合氣體進行全身缺氧3h，常氧正常飼養24h復制缺氧預處理模型。

1．2．2 大鼠閉合性心臟挫傷模型的建立 預處理組和單純挫傷組大鼠各24只，大鼠稱重后用20％的烏拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉，固定于實驗臺，放置肢體導連監測心電圖，并將心電信號接人計算機觸發系統。頸部備皮，縱行切口，分離肌肉，暴露氣管，于甲狀軟骨下約1cm開-T型切口，氣管插管與小動物呼吸機相連，在心臟舒張期末，使用自制生物撞擊機以相同速率打擊大鼠心前區造成心臟挫傷。分別于打擊后相應時間段頸椎脫臼處死大鼠，立即取出大鼠心臟在中性甲醛固定。于損傷區和交界區取材，常規脫水，包埋。對照組大鼠只進行氣管插管，不進行預處理，不打擊。

1．2．3 常規HE染色 心臟標本經中性甲醛溶液固定(固定時間24h～36h)，常規脫水包埋，連續切片，常規HE染色，光鏡下觀察形態學改變。

1．1．4 免疫組織化學染色 取各組損傷區心肌組織制作蠟塊標本，切成4μm石蠟切片，常規脫蠟至水后，PBS沖洗3min×3次。將切片放人盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，至微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在(92～98)℃(10～15)min進行原修復，取出置室溫冷卻。PBS沖洗，按免疫組織化學試劑盒說明書SP法分別進行Bd－2，cTnT染色。以廠家提供對照切片做陽性對照，以PBS替代第一抗體作為空白對照。

1．3 圖像分析 各組切片均應用MIAS--2000圖像分析系統對Bcl-2，cTnT免疫組織化學染色的陽性反應物進行定量分析，具體操作為：①每張切片在心臟挫傷區周圍隨機選取5個高倍視野(放大倍數×100，觀察窗面積165203μm²)，測定一定面積內Eel-2陽性目標平均灰度、視場平均灰度和面積密度(陽性目標面積與視場面積的比值)，計算陽性單位(PU)，PU=|G₀-G_V|/(1-A_AR)×G_max·100(G₀為目標平均灰度、C_v為視場平均灰度、A_AR為面積密度、G_max為最大灰度255)；②于100倍光鏡下，每張切片隨機取5個測量視野，測量cTnT在心肌細胞內缺失的面積，取其平均值。

1．4 統計學處理 應用SPSS 10.0軟件包，析因方差分析方法進行處理，數據以均數±標準差(x±s)表示。

2 結 果

2．1 大體觀察 挫傷心臟的心外膜下見少許點狀出血，心內膜下見散在或片狀出血，未受創區無明顯異常，無心臟破裂。

2．2 常規HE染色 對照組心肌細胞染色清晰，橫紋清楚，細胞核致密。實驗組發現心臟挫傷灶周圍心肌充血、細胞腫脹，嗜酸性染色明顯增加，橫紋消失，可見廣泛心肌間質出血，紅細胞散在或形成灶性分布于心肌纖維間，局部有中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，部分可見心肌纖維斷裂。

2．3 免疫組織化學染色與圖像分析(見表1、表2)

3 討 論

3．1 cTnT在鈍性心臟挫傷中的變化及意義 肌鈣蛋白由3種亞型組成：肌鈣蛋白C(cTn C)、肌鈣蛋白I(cTn I)和cTn T。cTn C不能作為心臟特異性標志物，因為在骨骼肌和心臟的肌肉組織中，他們的氨基酸序列是完全相同的。在成人中，cTh I和cTn I在心肌和骨骼肌上的氨基酸序列是不同的，編碼心肌cTn T的基因只在胚胎期骨骼肌中有短暫表達，成人后二者在結構上和免疫方面有很大的區別。其抗血清的交叉反應率只有1％～2％，不易受骨骼肌的影響。且cTn I較cTn I更早釋放人血，更易被檢測到，血中濃度更高，對心肌損傷價值也更高。本實驗中免疫組織化學染色鏡下可見正常對照組的心肌細胞，縱切與橫切的肌纖維中的cTn I，均呈棕褐色陽性反應，未見明顯脫失；在單純挫傷組cTn I呈大片狀缺染，可波及心肌全層，與周圍非損傷區陽性著色的心肌分界清晰，并隨時間的延長脫失逐漸加重；與單純挫傷組相比，缺氧預處理組在各個時間段cTn I的脫失明顯減輕(P＜0.05)。

3．2 HPC的心臟保護作用 預先反復短暫缺血可減輕后續缺血，再灌注所致組織損傷的現象，被稱為缺血預處理(ischemicpreconditioning，IPC)。IPC的保護作用亦可被模擬IPC的缺氧預處理所誘導，具有良好的臨床應用前景。大量研究顯示，缺氧預處理不僅可對經典的缺血、缺氧、缺血，再灌注、缺氧，復氧等損傷產生耐受。對氧化應激、熱應激、血清或鉀離子等營養成分剝奪、紫外線、化學藥物等引起的傷害也產生抵抗作用。

Bcl-2主要位于線粒體、細胞核及內質網的膜上，它能抑制線粒體通透性轉變，抑制線粒體凋亡誘導因子(apoptosis-factor，AIF)和細胞色素C的釋放。Chert等報道攜帶有人Ecl-2轉基因的鼠在經歷I/R損傷時，與對照組相比，心功能恢復明顯要快，乳酸脫氫酶值低3倍，心肌梗死面積縮小52.4％，TUNEL陽性細胞明顯減少，DNA Ladder變弱。研究發現H/R可引起顯著的心肌細胞凋亡，而HC則可明顯降低H/R引起的細胞凋亡。并且HP℃亦可減輕I/R所致的細胞凋亡，說明HPC的心肌保護作用與其對心肌細胞凋亡的抑制作用密切相關。本實驗中大鼠鈍性心肌挫傷模型發現，對照組可有Bcl-2少量表達，與單純挫傷組相比HPC組心肌細胞Bcl-2的表達明顯增強，隨著時間的延長，細胞免疫反應性逐漸增強，細胞表達的部位也由細胞周邊逐漸向細胞中央延伸。并可在心肌挫傷灶對側的心肌發現少數Bd-2染色較弱的細胞。由此可見Bcl-2蛋白主要表達在遭受心肌挫傷后還能存活的心肌細胞中，說明心肌挫傷中沒有受到致命損傷的細胞可誘導Bcl-2表達，并且l~l-2的表達在決定缺血心肌細胞存活方面具有重要作用。免疫組化顯示Bcl-2主要表達在挫傷灶周圍，可能與該區存活的心肌細胞由于挫傷存在缺氧。本實驗證實了Bcl-2參與心臟挫傷后的心肌亡，但HPC如何引起Bcl-2的變化，對其下游凋亡執行酶如何影響，目前尚未闡明。

Bcl-2的表達說明其參與了心臟挫傷后心肌損傷的形成。HPC對大鼠鈍性心肌挫傷有保護作用，表現為HPC能減輕心肌細胞cTnT的脫失及促進Bd-2的表達。HPC的心肌保護作用是通過上調Bd-2的表達從而抑制心肌細胞凋亡來實現的，但其具體機制有待進一步研究。

作者簡介：任劍波(1977—)，男，畢業于山西醫科大學，現為山西醫科大學第一醫院在讀碩士研究生(郵編：030001)；張玲，工作于山西醫科大學第一醫院；孫俊紅、王英元，工作于山西醫科大學法醫學院。

(本文編輯 郭懷印)