模擬干濕交替對水稻土古菌群落結構的影響*

包麗君賈仲君

（1 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008）

（2 中國科學院大學，北京 100049）

模擬干濕交替對水稻土古菌群落結構的影響*

包麗君1，2賈仲君1?

（1 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008）

（2 中國科學院大學，北京 100049）

干濕交替是自然界普遍存在的現象，但長期以來由于技術的限制，復雜土壤中微生物對水分變化的響應規律仍不清楚。針對我國江蘇常熟湖泊底泥發育的典型水稻土，在室內開展濕潤-風干以及風干-濕潤各三次循環，每次循環中濕潤、風干狀態各維持7d，利用微生物核糖體rRNA的通用引物進行PCR擴增，通過高通量測序分析土壤古菌多樣性變化，同時結合實時熒光定量PCR技術，在DNA和RNA水平研究古菌數量對干濕交替過程的響應規律。結果表明：水稻土濕潤-風干過程中，在DNA水平土壤古菌數量降幅約為149倍～468倍，而在RNA水平降幅最高僅為2.06倍；水稻土風干-濕潤過程中，在DNA水平古菌數量增幅在147倍～360倍之間，而在RNA水平增幅最高僅為2.95倍。表明在干濕交替過程中，DNA水平的古菌16S rRNA基因數量變化遠高于RNA水平。基于高通量測序多樣性的結果表明，在DNA和RNA水平，濕潤土壤3次風干、以及風干土壤3次加水濕潤7d恢復后，土壤古菌群落結構均發生統計顯著性改變。在微生物門、綱、目、科和屬的不同分類水平下，水稻土古菌主要包括3、10、13、14、10種不同的類群，在RNA和DNA水平的結果基本一致。干濕交替導致部分古菌類群發生顯著變化，其中在微生物分類學目水平發生顯著變化的古菌最高達到6種，主要包括產甲烷古菌和氨氧化古菌，如Methanobacteriales、Methanosarcinales、Methanomicrobiales和Nitrososphaerales等。這些研究結果表明，反復的干濕交替并未顯著改變水稻土中古菌的主要類群組成，古菌類群的絕對數量和相對豐度發生了一定程度的變化，但這些變化與微生物生理作用的聯系仍需進一步研究；風干土壤中古菌RNA序列極可能來自于完整的古菌細胞，暗示了這些古菌細胞能夠較好地適應水稻土中水分的劇烈變化，風干狀態的土壤在一定程度也可用于土壤古菌群落組成研究。

高通量測序；水稻土；16S rRNA；16S rRNA基因；干濕交替；古菌

20世紀以來，由于全球氣候變化，包括溫度與降水在內的主要氣候特征值發生了變化，全球范圍內的降水和干旱模式可能持續發生改變［1］。1958年Birch發現干旱的土壤加水培養后，二氧化碳的排放量顯著增加，這一現象隨后被學術界稱為Birch效應或者干土效應［2］。二氧化碳排放量的改變對全球碳循環以及氣候變化有著重要影響。然而，Birch效應的基本原理迄今仍未有明確的結論。傳統的觀點認為Birch效應是一個物理化學過程，當土壤風干后，不同團聚體孔隙中充滿大量的空氣，而土壤經歷降雨后，雨水會逐漸滲入土壤，將閉蓄在土壤中包括CO2等在內的空氣壓出，造成CO2排放量在短時間內迅速增加［3］。然而，近年來也有研究表明微生物在其中發揮了更大的作用。一般認為，干旱脅迫下微生物細胞能 夠自動調節滲透壓，積累并產生高濃度的溶質（例如氨基酸、多元醇等）以防止細胞脫水凋亡［3］。而土壤經加水再濕潤后，水分迅速滲入導致細胞膨脹裂解，部分細胞溶質外流，從而被其他微生物利用［4］，導致風干土壤加水濕潤后，微生物呼吸作用增強，短期內CO2排放量顯著增加。同時也有報道認為，風干土壤加水濕潤時，滯留在團聚體空隙中的空氣，由于大氣壓力差導致土壤團聚體的膨脹裂解，使新的有機質被暴露，從而被微生物利用，土壤呼吸作用增加［5］。微生物種類多、分布廣、代謝強、繁殖快，被認為是土壤生態系統中最活躍的部分，是生態系統碳循環主要驅動者［6］，對外界環境干擾的響應十分敏感。同時，微生物呼吸作為土壤呼吸的重要組成部分，可能會強烈影響大氣二氧化碳濃度，被認為是陸地生態系統光合固定大氣碳的幾乎唯一輸出途徑。因此，外界環境如土壤水分的動態變化，不僅會影響土壤微生物群落結構，也會影響生態系統碳氮循環過程［6-7］。稻麥輪作是我國南方重要的水稻管理方式，水稻生長中期烤田也是一種常見農業耕作制度，由此產生的干濕交替過程極可能對土壤微生物群落結構及其活性產生一定的影響，但長期以來由于技術手段的限制，相關研究報道較少。

20世紀80年代，Woese和Fox［8］根據核糖體rRNA序列的系統發育分析，提出了古菌（Archaea）、細菌（Bacteria）和真核生物（Eukarya）的三域分類系統。然而，長期以來，古菌一直被認為僅存在于極端條件下，如極端高鹽、強堿或者強酸環境。1992年，研究者利用16S rRNA引物擴增海水微生物群落的基因組DNA，首次發現了非極端環境中存在與極端環境古菌高度相似的“泉古菌”，隨后陸地生態系統中也發現存在大量的泉古菌，改變了古菌僅棲息于極端環境的傳統認知。據估算，每克土壤最多可能含有約100 億個微生物細胞，上百萬種不同的微生物物種［9］，而古菌數量占所有微生物的比例最高可達12%～38%［10］，且古菌在土壤元素轉化過程中發揮著重要作用，如氨氧化古菌、產甲烷古菌等。然而，古菌對土壤環境中水分變化的適應策略和響應程度研究報道較少，其環境影響規律及驅動機制仍不清楚［11］。

2007年以來，以高通量測序為代表的分子生態學技術快速發展，為研究土壤古菌對干濕交替的適應規律提供了重要的技術支撐。此外，RNA較DNA水平的靈敏度更高，細胞分泌到環境中的游離RNA降解快，通常以秒計，而DNA相對穩定，游離的DNA也可在土壤中保留較長時間，因此，RNA常被用來評價微生物的活性，而DNA通常被用于微生物多樣性的資源評價。此外，土壤中的DNA來自于完整細胞內和游離于細胞外的兩部分，在一定程度上，DNA分析并不能準確反映細胞水平的微生物種群數量變化，并且土壤DNA提取可能與環境樣品的狀態、胞外游離DNA數量等緊密相關，單一的實時熒光定量PCR技術無法準確反映土壤微生物種群數量的變化。新一代高通量測序技術的數據通量大、并且能同時分析上百個不同樣品，是研究復雜環境中微生物群落結構和物種組成的重要工具［12］。據此，本研究針對江蘇常熟典型水稻土，設置了濕潤-風干、風干-濕潤干濕循環3次，每次持續7d后提取土壤微生物DNA和RNA，通過實時熒光定量PCR和高通量測序多樣性技術，研究水稻土古菌對干濕交替過程的響應規律。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品概況

水稻土采自江蘇常熟湖泊底泥發育的土壤（31°33′N，120°42′E），采樣小區的農業耕種方式為冬小麥-夏水稻的水旱輪作，2014年4月采集0～20cm表層的新鮮土壤，研磨過2mm篩并保存。土壤的基本理化性質如下：pH7.3，有機質36.2 g kg-1，全氮1.9g kg-1，硝態氮0.04g kg-1，銨態氮0.007g kg-1，土壤最大持水量為53.6%。

1.2 水稻土的干濕交替過程

土壤的干濕交替培養過程具體如下：濕潤（F1）-風干（D1）-濕潤（F2）-風干（D2）-濕潤（F3）-風干（D3）-濕潤（F4），其中濕潤-風干過程3次，包括F1-D1、F2-D2和F3-D3，風干-濕潤過程3次，包括D1-F2、D2-F3和D3-F4。每個過程大約持續7 d并開展分子生態學分析。主要流程如下：首先，稱取210g新鮮稻田土壤于無菌托盤置于通風處晾干，將晾干土壤保持7d，隨后，將這些風干土壤加水濕潤并恢復到新鮮狀態保持7d，然后繼續進行風干培養7d，并循環培養。每次濕潤或風干作為一個處理，每次處理設置3個重復。每個重復收集大約10g土，其中3g土壤樣品，加入RNA later （Ambion）后，-20℃保存用于RNA 提取，其余樣品保存于-20℃，用于DNA提取以及后續分析。

1.3 水稻土核酸DNA/RNA的提取

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒（MP Bio）提取土壤總DNA，稱取干重約為0.5 g的土樣，按照試劑盒內說明書的方法操作，提取土壤微生物的總DNA，并溶解于100 μl無菌水后-20℃保存待用。通過微量紫外分光光度計（NanoDrop?ND-1000）測定DNA 濃度和純度（OD260/OD280和OD260/OD230），其中每個樣品濃度均保證30 ng μl-1，大部分DNA樣品OD260/OD280值在1.8～2之間以保證DNA質量。同時，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的完整性和相對濃度。

根據已有文獻報道的方法［13］，提取土壤微生物的總RNA，具體如下：（1）將保存于-20℃冰箱中，裝有等量干重的0.5g土樣并加入了500 μlRNA later的2.0 ml帶螺帽口的裂解管置于冰上解凍后，13722 rmin-1離心2 min棄上清液，去除RNA later；（2）在土壤沉淀物中加入0.5 g 玻璃珠（0.5mm∶0.1mm=3∶2，Sigma）和預冷的700 μl TPM buffer（50 mmolL-1Tris-HCl pH5.0，1.7% polyvinylpyrrolidone，20 mmolL-1MgCl2），使用Fast PrepTMFP120 核酸提取儀以6 m s-1的速度裂解土壤微生物細胞35 s，隨后將裂解混合物在4℃低溫下13722 r min-1離心2 min，上清液轉移至2.0 ml的無菌離心管；（3）向裂解管中的土壤沉淀物加入預冷的700 μlPBL buffer（5 mmol L-1pH 5.0 Tris-HCl，5 mmolL-1pH 8.0 EDTA Na2，0.1% SDS，6%水飽和酚），重復步驟（2），連續2次提取土壤核酸以提高DNA/RNA回收效率［14］；（4）依次利用500 μl的3 種有機試劑清洗（2）（3）步驟合并后的上清液：水飽和酚（p H 4.5），苯酚∶氯仿∶異物醇（25∶24∶1）（pH 4.5），氯仿∶異物醇（24∶1），充分混勻后4℃低溫下13722 r min-1離心2 min 并將上清液轉移至新的2.0ml無菌離心管中；（5）加入2倍體積PEGNaCl（30% PEG-6000，1.6 molL-1NaCl）于上清液中并混勻，室溫下靜置2h 后離心10 min，棄上清液后加入400 μl 70% 乙醇清洗沉淀，并再次13 722 r min-1離心5 min；（6）棄上清液后，離心管置于無菌臺吹干沉淀并加入50 μlDNase /RNasefree H2O 溶解；（7）利用Recombinant DNaseⅠ（TaKaRa）去除總核酸中的DNA，隨后，通過RNeasyMinElute cleanup Kit（QIAGEN）試劑盒純化土壤總RNA，并利用微生物16S rRNA基因的通用引物（515F/907R）擴增土壤總RNA，確保總RNA中不存在DNA污染；（8）利用微量紫外分光光度計（NanoDrop?ND-1000）測定RNA 濃度，采用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara）試劑盒將土壤RNA樣品反轉錄成cDNA，并于-20℃保存待用。

1.4 高通量測序土壤微生物16S rRNA及其基因

針對濕潤-風干、風干-濕潤處理的7個過程，分別提取土壤總RNA和DNA后開展16S rRNA基因和cDNA的多樣性分析。如表1所示，首先利用通用引物515F和907R擴增土壤微生物的16S rRNA基因，盡可能無偏差覆蓋土壤中的所有微生物群落，以便后續從中提取古菌序列。用于焦磷酸測序的通用引物前端含有12個堿基的特異Barcode標簽，用以區分不同的土壤樣品。PCR擴增體系為：25 μl的TaKaRa 2×SYBR?Premix EX TaqTM（dNTP Mixture，Buffer，Mg2+Plus）0.5 μl的引物（20 μmolL-1），加入2.0 μl DNA模板和無菌水至50 μl反應體系，每次PCR反應均設置無菌水的陰性對照。PCR擴增條件為：94℃，5.0 min；30× （94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s）；72℃，10 min。

獲得PCR產物后，利用AgaroseMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒（Takara）切膠純化，并將純化產物溶于30μl DNase-free H2O。通過微量紫外分光光度計（NanoDrop?ND-1000）測定濃度后，采用TruSeq Nano DNA LT Sample Prep Kit試劑盒對樣品進行建庫后，等摩爾數混合，利用Illumina公司MiSeq測序系統上機分析。對測序所得總序列進行去除嵌合體處理，根據不同標簽提取樣品序列，并進行后續分析。

本研究中3次濕潤-風干、風干-濕潤過程中共7個處理土壤樣品的DNA和cDNA進行Miseq高通量測序，利用Qiime對原始序列進行分析，去除低質量序列后，分別獲得1395262和757425條高質量序列，平均每個樣品分別獲得66441和36067條序列［15］。同時利用Qiime進行系統發育分析，在97%置信度下將每個樣品所有的16S rRNA基因序列進行分類，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。以其中一個濕潤土壤的一個重復樣品為例，N為所有高質量序列總和，劃分到某個分類單元的序列數為ni，根據公式Pi=ni/ N，得到各個分類單元的相對豐度開展后續分析。進一步通過R軟件分別對樣品進行群落結構分析。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers used in this study

1.5 土壤總DNA和cDNA的實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR的方法與已有的報道一致［14］。將土壤的總DNA和cDNA樣品，根據NanoDrop測定的結果進行稀釋，使最終濃度保證在1～10 ng μl-1，作為定量PCR的模板。定量PCR的標線利用含有古菌和細菌16S rRNA基因的克隆進行制備。首先利用特定引物進行目的基因的擴增，構建克隆文庫后，將含有目的基因的克隆在LB營養液中過夜培養，提取質粒純化并測定質粒的濃度，根據摩爾常數計算出目的基因的拷貝數，隨后用DNase-free H2O將質粒連續稀釋8個數量級，從而得到各個目的基因的標準曲線。實時熒光定量PCR于CFX96 Optical Real-Time Detection System（Bio-Rad）上完成。定量PCR擴增反應體系為：10μl的SYBR?Premix EX TaqTM（Takara），上、下游引物（10 pmolμl-1）各0.5μl，1.0μl土壤總DNA/cDNA模板，加入8μl滅菌雙蒸水至20 μl反應體系。每次試驗均采用滅菌雙蒸水代替DNA 作為反應模板設置嚴格的陰性對照。

1.6 統計分析

所有數據采用Origin8.1和SPSS16.0進行處理分析，處理之間的平均值差異采用one-way ANOVA單因素方差分析，p＜0.05表示顯著差異。非度量多維尺度 （NMDS，Non-metric multidimensional scaling）圖譜利用R軟件統計繪制。

2 結 果

2.1 水稻土干濕交替過程中古菌數量的變化

利用實時熒光定量PCR技術，分別對水稻土3次濕潤-風干以及3次風干-濕潤過程中古菌數量進行分析。如圖1所示，在風干過程中，古菌數量顯著降低；而在濕潤過程則顯著增加。3次風干過程中，古菌數量在DNA水平降幅149倍至468倍，然而，在RNA水平的下降僅發生在第1次和第3次風干過程，降幅最大僅為2.06倍，而在第2次風干過程，古菌rRNA數量基本不變，在統計上未有顯著性差異。類似的，濕潤過程中，土壤加水濕潤后DNA水平古菌數量顯著增加，增幅147倍～360倍，而在RNA水平古菌數量的顯著增加僅發生在第2次濕潤過程中，增幅2.95倍；第1次和第3次加水濕潤后，古菌rRNA數量甚至出現了下降趨勢。總體而言，風干和濕潤過程中古菌群落的16S rRNA及其基因數量呈相反的趨勢，尤其在DNA水平古菌數量的變化遠遠高于RNA水平。

2.2 水稻土干濕交替過程中古菌群落的變化

如表2所示，3次濕潤-風干、以及風干-濕潤過程中，在DNA和RNA水平分別獲得土壤古菌高質量序列共計38839和17213條。在微生物分類門、綱、目、科和屬的分類水平下，零時刻濕潤土壤F1在DNA水平含有3、9、13、12、8不同的古菌類群，而在RNA水平則包括了3、7、10、9、7種不同的古菌類群。對古菌16S rRNA基因進行非度量多維尺度NMDS分析表明，在DNA和RNA水平下（圖2A，圖2B），古菌微生物的群落結構均發生了顯著性改變（p＜0.05）。這一結果表明，本研究中的新鮮土壤樣品進行3次風干及加水濕潤培養后不僅影響了土壤古菌16S rRNA基因的數量，也對其群落結構有一定的影響。

圖1 干濕交替下土壤古菌16S rRNA基因在DNA（A）和RNA（B）水平下的數量變化規律Fig. 1 Change of archaeal 16S rRNA genes in abundance at DNA（A）and RNA levels（B），respectively，in soils under wet-dry alternation

表2 MiSeq高通量測序樣品描述Table 2 Summary of pyrosequencing results

針對干濕交替過程中顯著增加的古菌類群進行分析，如圖3所示，風干過程中，在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平統計上顯著增加的古菌類群明顯高于DNA水平。同時，在第3次濕潤-風干（FD-3）過程中，在DNA水平未檢測到有顯著增加的古菌，但是在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平均有顯著增加的古菌類群。在風干-濕潤（DF）過程中，DNA水平下，門、綱、目、科和屬水平均有古菌類群發生顯著增加，但是在RNA水平卻未檢測到顯著增加的古菌。以第1次濕潤-風干過程為例，在DNA水平，在目水平有2個古菌類群發生顯著增加，其相對豐度從0.005%，增加了0.023%，增加4.60倍；在RNA水平，目水平有4個古菌類群發生顯著增加，其相對豐度從0.786%增加了1.637%，增加2.08倍。

圖2 干濕交替過程中古菌微生物16S rRNA基因在DNA（A）和RNA（B）水平下的非度量多維尺度分析Fig. 2 NMDS（non-metric multidimensional scaling）analysis of compositional structure of 16S rRNA genes of the soil archaea under wet-dry alternationat DNA level（A）and RNA level（B），respectively

圖3 干濕交替過程中顯著增加的古菌相對豐度變化規律Fig. 3 Rules of the soil archaea varying in relative abundance with processes of dry-wet alternation

圖4 干濕交替過程中顯著減少的古菌類群變化規律Fig. 4 Rules of the soil archaea decreasing during the process of wet-dry alternation

進一步針對干濕交替過程中顯著降低的古菌類群進行分析，如圖4所示，在濕潤-風干過程中，在RNA水平未檢測到顯著減少的古菌，而在DNA水平下，門、綱、目、科和屬均檢測到顯著減少的古菌類群，但DNA水平第2次濕潤-風干過程中也未檢測到有顯著性減少的古菌類群。表明在RNA水平濕潤-風干過程中，門、綱、目、科和屬水平的不同類群古菌均發生明顯增加或未有統計顯著變化。同時，在風干-濕潤過程中，在DNA和RNA水平下均出現了顯著減少的古菌類群，且RNA水平顯著減少的古菌數量以及豐度減少值要明顯高于DNA水平。結合圖3，表明在風干-濕潤過程中，在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平受顯著影響的古菌，相對豐度均是降低。

2.3 水稻土干濕交替過程中古菌主要組成的變化

如圖5所示，干濕交替過程中，水稻土古菌主要包括泉古菌門（Crenarchaeota）和廣古菌門（Euryarchaeota），而前者以氨氧化古菌為主，后者則主要由產甲烷古菌組成。在微生物分類目的水平，水稻土在D N A和R N A水平分別包括了1 4和1 3種主要功能群，主要包括pGrfC26和Nitrososphaerales類群（泉古菌門），Methanosarcinales、Methanobacteriales、YCE6、E2和Methanocellales（廣古菌門），這些功能群占水稻土古菌百分比高達80%以上。此外，在風干處理的DNA樣品中，也檢測到耐鹽古菌Halobacteriales，其相對豐度隨著風干次數的增加而不斷增長，但在RNA水平未能檢測到耐鹽古菌。

圖5 干濕交替過程中土壤古菌在目水平下分類單元的相對豐度。A和B分別是在DNA和RNA水平下的高通量序列分析Fig. 5 Variation of the soil archaea at order level in relative abundance during the processes of dry-wet alternation，and high-throughput sequencing at DNA level（A）and RNA level（B），respectively

在微生物分類目水平下，產甲烷古菌（Methanosarcinales和Methanobacteriales）和泉古菌（pGrfC26和Nitrososphaerales）對土壤風干和加水濕潤的響應模式各有不同。如圖6所示，在濕潤-風干過程中，Methanobacteriales 在DNA水平豐度有增加趨勢，卻無顯著差異，但在R N A水平的豐度顯著增加（圖6 A）。Methanosarcinales在DNA水平豐度顯著減少，而在RNA水平豐度有增加趨勢，卻無顯著差異（圖6B）。Nitrososphaerales和pGrfC26在DNA水平豐度均出現過顯著降低，而在RNA水平正好相反，豐度呈現增加趨勢（圖6C，圖6D）。在風干-濕潤過程中Methanobacteriales、Methanosarcinales、Nitrososphaerales和pGrfC26在DNA和RNA水平豐度的變化與濕潤-風干過程正好相反（圖6E—圖6H）。以Methanobacteriales為例，在DNA水平，濕潤-風干過程中，Methanobacteriales豐度有增加趨勢，卻無顯著差異，而在風干-濕潤過程中正好相反，Methanobacteriales豐度有減少趨勢，卻無顯著差異；在RNA水平，濕潤-風干過程中，Methanobacteriales豐度顯著增加，而在風干-濕潤過程中，Methanobacteriales豐度顯著降低（圖6E）。

3 討 論

干濕交替是土壤中普遍發生的一種自然現象，它對于全球元素循環有著重要的影響［18-19］，且古菌在自然界重要元素的生物地球化學循環過程中發揮著重要作用。故本文就濕潤土壤的風干過程以及風干土壤的加水濕潤過程對古菌的影響展開了相關研究。在濕潤-風干（FD）過程中，古菌數量在DNA水平降幅要高于在RNA水平的降幅；在風干-濕潤（DF）過程中，DNA水平古菌數量增幅要明顯高于RNA水平的增幅，表明水分變化對古菌表達的影響要小于對其數量的影響。高通量測序結果表明，DNA和RNA水平，H2/CO2利用型的產甲烷古菌Methanobacteriales在濕潤-風干過程中，相對豐度有增加趨勢，且在RNA水平顯著增加；在風干-濕潤過程，相對豐度有減少趨勢，且在RNA水平顯著減少，說明Methanobacteriales在土壤水分匱乏時具有一定的耐受性，而當土壤水分恢復時，具有較強緩沖能力。而乙酸利用型產甲烷古菌Methanosarcinales相對豐度在DNA水平顯著減少，在RNA水平無顯著差異，表明在水分脅迫下，Methanosarcinales仍然能夠正常表達。氨氧化古菌Nitrososphaerales在DNA水平相對豐度顯著減少，而在RNA水平顯著增加，表明風干過程對Nitrososphaerales數量有一定影響的減少，但并沒有響應其表達。在濕潤-風干過程，風干土壤中古菌RNA水平明顯增加，表明古菌細胞能夠保持一定的完整性，并在適應水分脅迫的過程中大量表達。此外，我們在水稻土中檢測到了與極端嗜鹽古菌Halobacteria高度類似的16S rRNA序列，而極端嗜鹽古菌Halobacteria主要分布于天然或人工的高鹽環境，如鹽（堿）湖、曬鹽場、鹽礦、人工腌制品等。此外，干濕交替過程中也檢測到與海洋古菌MCG（Miscellaneous Crenarchaea Group）高度相似的序列，MCG通常分布在海洋底泥，可能參與全球范圍內的沉積作用，同時具有較低的呼吸速率［20］。這些結果在一定程度上表明，古菌在地球環境中的分布極為廣泛，并且這些古菌對環境水分的變化具有較強的適應能力。

圖6 干濕交替過程中古菌主要組成的變化規律Fig. 6 Rules of the soil archaea varying in composition during the wet-dry alternation

實時熒光定量PCR的結果表明，風干過程均會使DNA水平的古菌16S rRNA基因拷貝數顯著性降低，而風干土壤加水濕潤培養后，土壤古菌16S rRNA基因的拷貝數均又出現了明顯的增加，這與已有的研究報道保持一致［21-22］。根據16S rRNA基因拷貝數推測，3次風干土壤加水恢復培養后，DNA水平古菌數量變化要遠遠高于RNA水平數量變化。干濕交替過程中古菌RNA豐度變化較小，其原因可能與古菌對極端環境如干旱、強酸、強堿和高鹽等具有較強的適應能力有關［23］。早期有研究顯示，細胞通過植物進行休眠階段的代謝轉換適應干旱［24］。同時，有研究證實，休眠中的細胞仍然有大量核酸的累積，有利于古菌細胞延長生存，快速恢復代謝活性等［25］。這些研究均暗示，土壤風干過程可能導致部分細胞處于休眠狀態，其轉錄豐度變化不明顯。值得注意的是，干濕交替過程中古菌16S rRNA基因數量變化高達468倍，一方面可能是由于古菌迅速增長繁殖，但另一方面也可能是DNA提取中存在一定的實驗誤差。例如，風干土壤加水濕潤土壤DNA提取極可能與其狀態緊密相關，濕潤土壤和風干土壤的DNA提取效率可能有著極大差異，并可能顯著影響后續的實時熒光定量PCR結果。此外，游離DNA的存在會高估土壤中古菌的16S rRNA基因數量，而濕潤土壤和風干土壤中的游離DNA提取效率可能具有極大的差異，導致干濕交替過程古菌16S rRNA基因數量的顯著差異。復雜水稻土中，古菌如何適應水分的劇烈變化過程，在 DNA和RNA水平的響應和適應機制仍然需要進一步研究［26］。

一般認為，產甲烷古菌是嚴格厭氧微生物，但值得注意的是，本實驗在完全好氧條件下進行，產甲烷古菌盡管在數量上可能發生明顯變化，但產甲烷生理過程幾乎不可能進行。因此，產甲烷古菌數量的增加或者減少，極可能與其生理活性關聯度較小。以H2和CO2利用型產甲烷古菌Methanobacteriales為例，濕潤-風干過程中，在RNA水平古菌的相對豐度顯著增加，而產甲烷古菌失水過程中似乎很難具有生理活性，因此，RNA表達量的增加極有可能來自于產甲烷古菌對水分脅迫的響應。此外，RNA降解極快，風干土壤中幾乎不可能以游離狀態存在，因此，風干土壤中RNA極有可能來自于完整的古菌細胞。古菌在RNA水平相對豐度的增加，在一定程度上表明風干土壤中產甲烷古菌的細胞能夠保持一定的完整性，并在適應水分逐漸喪失的脅迫過程中大量表達。相應的，氨氧化古菌也表現出了類似的規律，在濕潤-風干過程中，RNA水平的相對豐度明顯增加，表明風干土壤中可能存在較為完整的氨氧化古菌細胞并能夠較好地適應水分喪失的脅迫過程。隨著單細胞技術的快速發展，結合其他一些先進的物理化學方法，未來將有可能在更精細化的水平準確描述復雜土壤中古菌細胞對干濕交替過程的適應和響應規律。

一般而言，自然環境中土壤微生物群落的形成是一個長期的過程，特定土壤中的微生物群落在組成上也具有相對的穩定性。因此，在短期的干濕交替條件下培養，土壤中不同的微生物物種可能具有不同的生長策略和代謝速率，如在加水恢復培養后個別微生物繁殖較快并能迅速成為優勢種群，但短期培養似乎很難改變絕大部分微生物，如古菌的物種組成。我們推測實驗土壤中的古菌微生物是其長期適應自然環境變化的演化產物。然而，干濕交替過程中，本研究發現DNA和RNA水平下古菌數量變化規律具有極為顯著的差異，相差可能達到上百倍。由此帶來的問題是，風干-濕潤過程中，古菌數量在DNA水平的增幅高達數百倍，這種極顯著的數量變化是否來自于古菌細胞的大量繁殖，抑或是土壤DNA提取效率問題，目前仍不得而知。然而，一般認為DNA片段在土壤中的存留時間較長，甚至可保存幾十年，而RNA降解快，因此RNA極有可能來自于完整的細胞，而DNA也可能來自土壤中游離的DNA，風干-濕潤的加水濕潤過程中促進了土壤DNA提取效率，導致古菌16S rRNA基因的拷貝數增加上百倍。未來仍需開發先進的技術方法，減少土壤中游離DNA的干擾，更加準確地表征土壤微生物多樣性及其對干濕交替等環境干擾的響應和適應機制。

4 結 論

新鮮水稻土經過3次干濕交替處理后，古菌數量變化明顯，同時在微生物分類門、綱、目、科和屬各水平均有不同古菌發生顯著改變，進而可能改變土壤微生物群落結構。本研究表明風干以及加水恢復過程對古菌數量和活性均有一定程度的影響，但未來仍需在細胞水平準確刻畫復雜土壤環境中古菌對水分變化的適應和響應規律。例如，干濕交替過程中古菌絕對數量的劇烈變化，是否來源于古菌適應水分變化的生理生長，抑或是來自于DNA/ RNA提取等分子技術的誤差。此外，干濕交替過程對古菌細胞活性的影響也是未來研究重點之一。

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（責任編輯：盧 萍）

《土壤學報》2015年度優秀論文評選揭曉

《土壤學報》2015年度優秀論文評選活動已于近期結束。經本刊編委推薦和評選，共評出優秀論文獎9篇，涵蓋土壤地理與土壤信息、土壤物理與土壤侵蝕、土壤化學、土壤生物、植物營養、土壤肥力、土壤管理等版塊。現將獲獎名單公布如下（詳見附件），并授予年度優秀論文證書，給予適當獎勵。

附件：

《土壤學報》編輯部

二〇一六年十二月二日

Changes of Archaeal Communities in a Paddy Soil under Drying and Re-wetting Cycles

BAO Lijun1，2JIA Zhongjun1?
（1 Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China）
（2 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

【Objective】Dry-wet alternation is a common phenomenon existing in nature，especially in paddy soil. But it is still unclear about rule of the response of soil microorganisms to such variation of soil moisture in complex soil，because of limitations in technology. This study was aimed to investigate rules of changes inabundance and community of archaea in a typical paddy soil derived frnom lacustrine sediment，in Changshu of Jiangsu，experiencing three cycles of drying and wetting in lab. 【Method】Soil samples of the typical paddy soil from Changshu were subjected to three consective cycles of drying and wetting in lab. Each of the drying or wetting period lasted 7 days. Real-time quantitative polymerase chain reaction（Realtime PCR）and high-throughput sequencing of 16S rRNA genes were performed to analyze how the archaea in the soil samples changed in biodiversity，abundance and community in response to the dry-wet alternations at DNA and RNA levels. 【Result】The Real-time PCR analysis suggests that the abundance of archaeal 16S rRNA genes copy number changed in response to dry-wet alternation，dropping at DNA level by 149～468 times，but only by 2.06 times on RNA level during the process from wet to dry，and rising by 147～360 times at DNA level，but only by 2.95 times at RNA level during the process from dry to wet. These findings indicate that the change of archaea in 16S rRNA genes copy number was far greater at DNA level than at RNA level. Based on the high-throughput sequencing of 16S rRNA genes，it was found that the archaea community changed significantly in structure at both DNA level and RNA level after three consecutive dry-wet cycles and the changes may be described by non-metric multidimensional scaling（NMDS）（p＜0.05）. The archaea in the paddy soil could be sorted into 3，10，13，14 and 10 groups at either DNA or RNA level，when classified at phylum，class，order，family and genus level，respectively. The alternation caused significant changes in the archaeal community，especially the six groups at order level，including mainly Methanogenicarchaea and ammonia-oxidizing archaea，like Methanobacteriales，Methanosarcinales，Methanomicrobiales and Nitrososphaerales. The change varied by 2.1%，from 2.82% to 0.69% in total abundance and by 3.79 times，from 0.54% to 2.60%，in maximum fold. 【Conclusion】The Real-time PCR analysis demonstrates that the abundance of archaeal 16S rRNA genes copy number changed significantly in response to the alternation. The high-throughput sequencing of 16S rRNA genes indicates that the archaeal community in the soil changed significantly in structure with the soil alternating in soil moisture condition from dry to wet and from wet to dry. As in environment free extracellular RNAs decompose rapidly，while free extracellular DNAs may remain intact for quite a long time，it is quite probable that archaeal RNA sequence may come from intact microbial cells，and these archaeal cells are able to adapt to severe moisture changes in paddy soil. As the process of drying or wetting does have some impacts on abundance and composition of archaea communities，it is moreadvisable to unfold studies on changes in soil archaea at DNA and RNA levels simulataneously so as to expose rules of the soil archaea responding to dry-wet alternation of the soil.

High-throughput sequencing；Paddy soil；16S rRNA；16S rRNA gene；Dry-wet alternation；Archaea

《土壤學報》2015年度優秀論文獎獲獎名單（以版塊順序排序）

Q938

A

10.11766/trxb201603140046

* 國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2015CB150501）資助 Supportedbythe National Key Basic Research Programof China（No.2015CB150501）

? 通訊作者Correspondingauthor，E-mail：jia@issas.ac.cn

包麗君（1990—），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事微生物生態研究。E-mail：ljbao@issas.ac.cn

2016-03-14；

2016-07-04；優先數字出版日期（www.cnki.net）：2016-11-08