綜合生物防控煙草青枯病及其對土壤微生物群落結構的影響*

李 想 劉艷霞陸 寧 蔡劉體 袁有波 石俊雄

（貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000）

綜合生物防控煙草青枯病及其對土壤微生物群落結構的影響*

李 想 劉艷霞?陸 寧 蔡劉體 袁有波 石俊雄

（貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000）

利用生物有機肥結合相應的農藝措施進行生物防控是近年來的研究熱點。分別采用常規施肥（T1）、常規施肥+生石灰（T2）、常規施肥+L-25生物有機肥（T3）、常規施肥+生石灰+ L-25生物有機肥（T4）四個處理來探究生物防控煙草青枯病的效果。結果表明：2014年T4處理在煙草全生育期的防控效果顯著高于T2和T3處理，在90d后防控效果分別是T2和T3的6.26倍和1.99倍。經過三年修復，青枯病綜合防控效果高達61.3%。2013年和2014年T4處理產量顯著高于其他各處理。2013年生物有機肥各處理的拮抗菌在70 d之前均顯著高于各自對應的病原菌數量，2014年T4病原菌數量則始終處于106cfu g-1數量級以下，其他處理在煙草移栽90 d后病原菌數量均增長至107cfu g-1以上。T4處理的根際土壤微生物物種豐度水平、運算分類單位（OTU）、香農多樣性指數（Shannonindex）均高于T1處理，主成分與聚類分析表明T3和T4處理的微生物區系結構相似，明顯不同于T1處理。綜合的生物防控措施可以有效防控重病區青枯病，對烤煙產量產值具有明顯的提高作用，并能有效改良土壤微生物區系，具有良好的推廣應用前景。

煙草青枯病；綜合防控；病原菌；拮抗菌；根際微生物平衡

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種以土壤傳播為主的毀滅性細菌性煙草病害，煙草青枯病是影響貴州煙葉生產的最主要的細菌性病害［1］。近年來，隨著科技進步和人們環保意識的加強，生物防控方法逐漸引起了人們的重視，目前對青枯病病原菌的防控都停留在實驗室中拮抗菌對病原菌的平板拮抗作用，直接應用于溫室試驗或田間試驗的防控效果甚微，Anuratha和Gnanamanickam［2］將平板篩選得到的熒光假單胞桿菌直接用于田間試驗，其對番茄青枯病的防控率僅為36%左右。

拮抗菌單獨施入土壤后不易定殖，提高拮抗菌在土壤根際的定殖成為生物防控的研究重點。目前主要采用施用拮抗菌結合有機肥或經過2次發酵制成生物有機肥調節土壤微生態、改善土壤微生物多樣性、抑制病原菌的生長或提高植物自身抗性，從而抑制病害的發生［3-4］。Qiu等［5］利用生物有機肥顯著降低黃瓜枯萎病的發病率并改善土壤的微生物群落結構；Zhao等［6］利用SQR21拮抗菌的生物有機肥降低西瓜枯萎病真菌尖鐮孢菌的數量級進而達到防控效果；Wu等［7］利用解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌制成生物有機肥施用抑制病原菌的生長取得很好的防控效果；Ding等［8］研制的BIO-36和BIO-23生物有機肥防控馬鈴薯青枯病防控效果分別可以達到96%和91%。但由于環境的復雜性及單一防控措施的局限性對病害發病嚴重田塊的防控效果并不理想［9］，比如李紅麗等［10］研制的抑制煙草青枯病生物有機肥在2005年的抑制煙草青枯病效果不顯著。采用綜合防控的方法能夠消除單一措施帶來的短板效應，是實現土傳病害生物防控的有效措施之一［11-12］。

本研究采用綜合防控手段對煙草青枯病發病嚴重的煙田進行三年長期定位修復，并通過研究土壤中病原菌與拮抗菌的消長關系及土壤微生物區系變化特征，探索綜合防控對煙草青枯病的有效防控修復機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草品種采用云煙85，該品種品質好但易感青枯病。拮抗菌采用前期自健康煙草根際土壤分離篩選到的L-25（短短芽孢桿菌，Brevibacillus brevis），L-25經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（CGMCC No.3175）［13］。有機肥載體為菜粕酶解的氨基酸有機肥與牛糞以1∶1（質量比）混合，含有機質338 g kg-1、氨基酸43.0g kg-1、N 42.0g kg-1、P2O522.6g kg-1和K2O 10.8g kg-1。

1.2 抑制煙草青枯病型生物有機肥的制備

將拮抗菌L-25接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，三角瓶裝液量為1/5，30℃、170 r min-1振蕩48 h。將上述發酵液6 000×g離心10 min，收集菌體按5%接種量接種于滅菌后的有機肥載體。調節有機肥含水量為40%，發酵5～6 d，定期翻拋。發酵結束后，通過熒光定量PCR測定L-25生物有機肥有效活菌數及拮抗菌數量，重復3次（表1）［14］。

1.3 田間試驗設計

分別于2012―2014年在貴州省黔南州長順縣廣順鎮石洞村（26.03°N，106.45°E）連續開展三年長期定位修復試驗。所選的長期定位修復試驗點試驗前青枯病發病率達到100%，連續1 0年以上種植烤煙，當年已經決定不再種植煙草。田間試驗共設四個處理：常規施肥（T1）：只施用975 kg hm-2的煙草專用復合肥料（N∶P2O5∶K2O=10∶15∶25）；常規施肥+生石灰（T2）：在T1處理基礎上在移栽前20天施用600 kg hm-2生石灰調節土壤pH；常規施肥+L-25生物有機肥（T3）：在施用817.5 kg hm-2煙草專用復合肥料基礎上加施375 kg hm-2的L-25生物有機肥，磷和鉀不足的部分分別用過磷酸鈣和硫酸鉀補齊；常規施肥+生石灰+ L-25生物有機肥（T4）：在移栽前20天施用600 kg hm-2生石灰調節土壤pH，施肥處理與T3相同。

表1 拮抗菌二次發酵前后微生物數量Table 1 Counts of microbes before and after the secondary fermentation of antagonistic bacteria（cfu g-1）

供試土壤類型為普通黃色濕潤鐵鋁土。pH 5.45，有機質48.6 g kg-1，全氮2.29 g kg-1，堿解氮158 mg kg-1，有效磷48.9 mg kg-1，速效鉀543 mg kg-1。每處理4個重復區組，每區組120株煙株，加保護行等共占地0.05 hm2。田間管理及追肥的施用與當地其他煙田相同。

1.4 田間試驗病害調查及相關性狀測量

分別于煙草移栽后40～90 d，每隔10 d觀測煙草發病情況并測定根際土壤微生物病原菌與拮抗菌數量及群落結構和功能多樣性，煙葉采摘并烘烤后計算各處理產量。

青枯病調查分級標準（以株為單位）：調查病情指數以及防控效果，采用劉艷霞等［14］方法進行測定。病情指數與防控效果的計算如下：

煙草移栽后約60～70 d，葉片開始自下而上逐漸成熟，根據煙葉成熟情況由下至上分次采收并放于烤房中烘烤，烘烤后計算其產值量［15］。

1.5 土壤病原菌與拮抗菌數量的檢測

土壤基因組D N A采用土壤歐米伽D N A提取試劑盒（Soil DNA Isolation Kit，Omega）提取，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測D N A的純度和濃度。以樣品D N A作為擴增模板，分別用病原菌（R. s o l a n a c e a r u m）特異引物（flicF：GAACGCCAACGGTGCGAACT；flicR：GGCGGCCTTCAGGGAGGTC）與拮抗菌（B.b re v i s）的特異性引物（B r e-F：AGACCGGGATAACATAGGGAAACTTAT；Bre-R：GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC）在熒光定量PCR儀（StepOne Plus Real-time PCR System，ABI，美國）上進行擴增反應，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線，記錄每個樣品的Ct值，并將Ct值代入標準曲線方程，計算出樣品模板的初始基因拷貝數，最終換算出每克干土的茄科勞爾氏菌或短短芽孢桿菌的基因拷貝數［12］。

熒光定量PCR結果顯示，茄科勞爾氏菌的擴增效率達到91.0 %，短短芽孢桿菌的擴增效率達到100%，標準曲線R2＞0.99。茄科勞爾氏菌標準曲線方程為Ct=-3.56C0+38.7，短短芽孢桿菌標準曲線方程為：Ct=-3.32C0+37.2。

1.6 根際土壤微生物區系檢測

移栽90 d后采集根際土壤，將煙株慢慢連根拔起，輕輕震蕩掉附著的土塊，將根連同根上震蕩不掉的土壤置于10 ml滅菌水中，超聲波震蕩15 min后得到的土壤即為根際土壤［16-17］。

上述提取的土壤DNA，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng μl-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶標簽序列（Barcode）的特異引物，使用紐英倫生物技術（New England Biolabs）公司的高保真（Phusion? High-Fidelity）含有GC緩沖液的PCR混合液（Master Mix with GC Buffer）。使用高效和高保真的酶進行擴增，確保擴增效率和準確性。引物對應區域：16S V4區引物為515F-806R。PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用賽默科學公司（Thermo Scientific）的凝膠回收試劑盒（GeneJET）回收產物。

使用紐英倫生物技術（New England Biolabs）公司億美達（Illumina）的超DNA文庫制備試劑盒（NEB Next? Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina）進行文庫的構建，構建好的文庫經過量子位（Qubit）定量和文庫檢測，合格后，使用MiSeq進行上機測序。基于個人基因組分析測序平臺（MiSeq Personal Sequencing System，Illumina，美國）［18］，利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構建小片段文庫進行雙末端測序。

測序得到的原始數據，存在一定比例的干擾數據，為了使信息分析的結果更加準確、可靠，首先對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據。然后基于有效數據利用Uparse［19］軟件（Uparse v7.0.1001，美國）對所有樣品的全部有效標簽序列聚類，以95%的一致性（Identity）進行運算分類單位（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果［20］。再對OTUs進行豐度、多樣性指數等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。最后在以上分析的基礎上，可以進行一系列的基于OTUs和物種組成的聚類分析、主成分分析（Principal component analysis，PCA）等［21］。

1.7 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統計軟件（SPSS，IL，Chicago，美國）進行，最小顯著差異法（LSD）或鄧肯（Duncan）新復極差進行多重比較（p＜0.05）。

2 結 果

2.1 煙草青枯病的綜合防控效果

2013年對照T1在生育末期青枯病發病率達到100%，而T4處理發病率遠遠小于對照（圖1）。采用生物防控綜合措施后，2012年移栽53 d后各處理煙株全部暴發青枯病，各處理間的防控效果無顯著差異（表2）。2013年T4處理在煙草全生育期的防控效果顯著高于T2和T3處理，在煙草生育90 d后仍分別較T2和T3高78.1%和18.2%。2014年T4和T3處理的青枯病發生較對照推遲40 d，T4處理在60 d后防控效果顯著高于T3和T2處理，在90 d后防控效果分別為T2和T3的6.26倍和1.99倍。

圖1 煙草青枯病綜合防控田間防效（2013年）Fig. 1 Tobacco bacterial wilt controlling effect of the integrated control measures

表2 綜合防控煙草青枯病防控效果動態變化Table 2 Dynamics of controlling effect of the integrated control measures on tobacco bacterial wilt

2.2 煙草青枯病的綜合防控試驗產值量

由于2012年移栽60 d后各處理煙株全部暴發青枯病，各處理間的產值量均為零（表3）。2013年T4處理產量顯著高于其他各處理，分別為T1、T2和T3處理的3.71倍、1.61倍和1.13倍，T4、T3和T2處理的產值分別為T1的3.44倍、2.62倍和1.87倍。2014年T4處理產量和產值顯著高于其他處理，T1 與T2的產量和產值之間無顯著差異，且均顯著低于T3處理。

表3 綜合防控試驗產值量Table 3 Tobacco yield and output value of different treatments

2.3 土壤病原菌與拮抗菌的消長關系

從圖2中可以看出，修復1年時（2012年）各處理病原菌數量在煙草移栽30 d后居高不下，一直保持在107cfu g-1土以上，而T2、T3和T4處理的拮抗菌數量全生育期基本呈直線下降，最后降為104cfu g-1土；經過2年修復后（2013年），T1處理的病原菌數量在30 d后即達到107cfu g-1土，經過生物有機肥處理的T3和T4處理病原菌數量呈現緩慢上升的趨勢，但生物有機肥各處理的拮抗菌在70 d之前均顯著高于各自對應的病原菌數量，在80 d，T3和T4處理的病原菌數量與拮抗菌數量之間無顯著差異，而T2處理的病原菌數量是拮抗菌的1.49倍，呈顯著差異；2014年T1和其他處理病原菌數量在50 d前呈現緩慢上升趨勢，在50 d 后T1處理病原菌數量迅速上升，T2處理病原菌數量在70 d后才呈現上升趨勢，而T4病原菌數量則始終處于106cfu g-1土數量級以下，在煙草移栽90 d后，各處理除T4外土壤中病原菌數量均增長至107cfu g-1土以上。拮抗菌的數量在全生育期呈現逐漸降低的趨勢，T2處理病原菌與拮抗菌的數量交匯時間在72 d，T3處理的交匯時間為78 d，而T4的拮抗菌數量在90 d后仍然高于病原菌數量，達到1.23×106cfu g-1土，隨著生物修復防控時間的延長，拮抗菌的數量降低速度趨于緩慢。

2.4 根際土壤微生物物種豐度及群落構成主要影響因素

從不同處理土壤微生物物種豐度水平上看（圖3），T1與T4處理的微生物門水平分布差異明顯，T1處理的Planctomyces、Sphingobium、Rhodanobacter、Gemmata、Candidatus_Nitrososphaera和Stenotrophomonas六個門為豐度水平較高的種群，而Chitinophaga、Niastelia、Methylotenera等門相對豐度水平較低；T4處理豐度水平較高的種群只有Nitrospira和Novosphingobium，較低的只有Phenylobacterium門，其他微生物門之間豐度差異較小，分布水平相近，整體微生物群落處于平衡、均勻的狀態。

主成分分析（PCA）是一種從復雜的多維變量數據中提取主要變量，并進行可視化的方法。對β多樣性進行PCA分析后，T3與T4處理土壤微生物多樣性關系較近（圖4），均處在左下半部，T2處理的土壤微生物多樣性在像限的左上部，而T1處理與T2、T3和T4處理之間關系較遠，處于像限的右上部。

3 討 論

圖2 不同年限間土壤中病原菌與拮抗菌的消長關系Fig. 2 Populations of pathogens and antagonistic bacteria in soils in different years

圖3 不同處理物種豐度聚類圖Fig. 3 Species abundance cluster map relative to treatment

圖4 不同處理β多樣性主成分分析Fig. 4 Principal component analysis（PCA）analysis of β diversity relative to treatment

有機肥與功能微生物（生防菌等）相結合制成微生物有機肥后施用，對各種土傳病害的防控體現出很好的效果［22］。在本試驗中，與對照（T1）相比，單施用生石灰處理（T2）對青枯病90d的防控效果分別為40.2%（2013年）和9.8%（2014年），防控效果十分不理想，單施用L-25生物有機肥（T3）對青枯病90 d的防控效果分別為60.6% （2013年）和30.8%（2014年），但綜合防控T4處理的防控效果最高分別達到75.2%（2013年）和61.3%（2014年）。由此可見，在本試驗中單一地采用生石灰或者生物有機肥處理均不能有效防控青枯病的發生，通過生石灰和施用生物有機肥這2項農藝措施結合后可以改良土壤結構，促進煙草根系深扎，進而提高植物抗逆性［23］。生石灰調節土壤pH減少土傳病原菌的數量［11］（圖2），進而達到很好的生物防控效果。此外，通過田間試驗發現施用生物有機肥處理能延緩青枯病的發病時間，2013年與2014年青枯病初發期分別推遲30 d和40 d。這主要由于采用的拮抗微生物均從煙草根際土篩選獲得，在煙草根際具有很強的定殖能力；同時拮抗菌以有機肥為載體，經過二次固體發酵后施入土壤中，在前期對病原菌起到較好的抑制作用［24］，進而推遲煙草植株發病時間。

各處理防控效果隨煙草生育期先增加后降低，這是由于生物有機肥在初期抑制了煙草青枯病的發生，具有延緩發病的功效。而隨時間增加，對照煙株基本已經枯萎死亡，發病率和病情指數均不再變化，后期處理青枯病仍有少量發生，因此防控效果會逐漸下降。相比較而言，T3和T4處理2014年煙草生育前期防控率均高于2013年相應處理，而到后期又低于2013年，這主要是由于2013年移栽30 d后多為高溫（＞30℃）高濕（＞80%）氣候，2013年青枯病在30 d就發生，此時T3和T4處理病原菌數量呈現緩慢上升的趨勢，但其拮抗菌數量在70 d之前均顯著高于病原菌（圖2），在90 d后病原菌數量仍未達到發病濃度107cfu g-1［12］，進而防控效果在60%以上；但在2014年移栽70 d后進入高溫高濕氣候，此時T4和T3的拮抗菌數量減少到與病原菌數量持平或者低于病原菌數量，且病原菌數量達到發病濃度107cfu g-1，進而導致青枯病的發生，因此2014年表現為T3和T4處理前期的防控效果較高，后期有所下降。施用拮抗菌二次發酵的生物有機肥結合農作措施，使根表和根際土中的病原菌數量降低到發病濃度以下，是生物防控的主要機理之一［25］。

在高通量測序中選取樣品中土壤微生物物種相對豐度排名前35進行橫縱向聚類（圖3）［19］，主要展現的是優勢物種相對豐度在各個樣本之間的差別。由于本試驗田處理前為煙草青枯病發病率100%的土壤，故勞爾氏菌屬豐度水平在物種豐度聚類圖中得以體現；而本試驗施用的L-25拮抗菌隨著時間的延長數量逐漸降低，尤其在煙草生育后期的根際土壤中L-25菌屬的相對豐度排在35種微生物物種之外，故在物種豐度聚類圖上未體現，隨著處理時間的延長可能會在高通量測序物種豐度聚類圖中找到該菌屬，而本文選用引物fliCF/ fliCR 和Bre-F/Bre-R建立了勞爾氏菌和短短芽孢桿菌熒光定量PCR 體系進行檢測，與陳巧玲等［26］的結果一致。

綜合防控措施對土壤中青枯病病原菌有較好的抑制作用，主要是因為其有效改善土壤微生物平衡，恢復被破壞的土壤生態系統，從而建立起復雜而健康的土壤微生物體系［27］。拮抗菌在有機肥協助下形成“基質-菌群”生態系統，更有利于調節土壤微生態環境，可改變根際土壤微生物生態特征和物理化學特征，從而起到防病、抑病的作用［28］。本試驗中采用的PCA分析是從多維數據中提取出最主要的元素和結構進行分析，較物種相對豐度的聚類更加說明問題［29］，其結果表明T3和T4處理微生物區系在同一范圍內，說明兩處理土壤微生物結構、功能等多樣性基本處于相同的水平；而T1處理在PCA分析中距離T4處理最遠，因而土壤微生物結構、功能等多樣性最不相同，這一結果與張慧等［30］和Lang等［31］類似。當土壤肥力水平提高、微生態環境得到改善、微生物活性增強時，土壤微生物群落功能多樣性會提高［32］，青枯病生物綜合防控技術能較好地恢復土壤微生物達到健康區系的水平，具有很好的應用前景［33-34］。

4 結 論

施用抑制煙草青枯病型生物有機肥配合生石灰防控措施，可以有效降低青枯病發病率，增加煙葉產量和產值，降低土壤中病原菌濃度，有利于病害土壤生態系統向健康可持續發展的方向轉化，進而達到對重病煙區煙草青枯病良好的防控效果。

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Integrated Bio-control of Tobacco Bacterial Wilt and Its Effect on Soil Microobial Community Structure

LI Xiang LIU Yanxia?LU Ning CAI Liuti YUAN Youbo SHI Junxiong
（Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 550000，China）

【Objective】Tobacco bacterial wilt is one of the most serious soil-borne pests affecting tobacco production in Southwest China. Biocontrol of tobacco bacterial wilt has been a hot research topic in recent years. For control of the pest，a kind of biomanure prepared out of microbes antagonistic to the pest is used together with some proper agronomic measures，so as to achieve sustainable and healthy development of tobacco production.【Method】In this study，a three-year long field experiment was conducted in aseverely wilt infected tobacco field in Guizhou Province to explore effects of the pest control measures. The experiment was designed to have four treatments or measures，that is，T1（Conventional fertilization），T2（Conventional fertilization + liming），T3（Conventional fertilization + L-25 Biomanure）and T4 （Conventional fertilization + liming + L-25 Biomanure）. High-throughput sequencing was done of the microbial genome in the rhizosphere to explore effects of the integrated control measures on soil microflora. 【Result】The experiment indicated thatin 2013 Treatment T4 was significantly（p＜0.05）higher than Treatments T2 and T3 in controlling effect during the entire tobacco growing period，and in 2014，Treatment T4 was significantly higher than Treatments T2 and T3 in controlling effect，60 days after transplanting and 6.26 and 1.99 times as high as Treatments T2 and T3，respectively，90 days after transplanting. At the end of the experiment，the pest controlling effect reached up to 61.30%. In 2013，Treatment T4 was significantly higher than all the other treatments in tobacco yield or 3.71，1.61 and 1.13 times as high as Treatment T1，T2 and T3，respectively. In 2014，Treatment 4 was the highest in tobacco yield and output value and Treatment T3 was significantly higher than the other two，which were more or less the same. In 2013，although the pathogen in the treatments amended with biomanure slowly increased in population，the counts of antagonistic bacteria in the treatments were higher than those of pathogen during the initial 70 days after transplanting，while in 2014，the population of pathogen in Treatment T4 was always kept below the level of 106cfu g-1soil，but the counts of pathogen in all the other treatments grew beyond the level of 107cfu g-1soil，90 days after transplanting and on. Treatment T4 was higher than Treatment T1 in microbial species abundance，operational taxonomic unit（OTU）and Shannon index. Principal component and cluster analysis shows that Treatments T3 and T4 were quite similar，but significantly different from Treatment T1 in microfloral structure. 【Conclusion】The integrated measure，（like Treatment T4）can effectively control tobacco bacterial wilt and significantly improve yield and output value of cured-tobacco，and soil microflora as well，which demonstrates that the measure has a promising application and extension prospect.

Tobacco bacterial wilt；Integrated control measure；Pathogen；Antagonistic bacteria；Rhizosphere microbial balance

S144.1

A

10.11766/trxb201601140582

（責任編輯：陳榮府）

* 國家自然科學基金項目（41461068）、貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2013］2197、2198）和中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201410）共同資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41461068），the Science and Technology Foundation of Guizhou Province（No.［2013］2197 and 2198）and the Science and Technology Foundationof Guizhou Tobacco Monopoly Bureau of China（No. 201410）

? 通信作者Corresponding author，E-mail：iversonlyx@163.com

李 想（1982—），遼寧省鞍山市人，博士，副研究員，主要從事土壤養分管理與循環研究。E-mail：newcool1361214@163.com

2016-01-14；

2016-08-05；優先數字出版日期（www.cnki.net）：2016-09-21