FBXW7在結直腸癌中的表達及其與結直腸癌相關性的研究

姜樹中　花佳佳　張玲燕　肖明兵

【摘要】 目的：闡明FBXW7的表達及與結直腸癌發生、發展及預后之間的關系。方法：收集結直腸癌及癌旁組織新鮮標本16例，利用實時定量PCR測定FBXW7的表達，并與各臨床病理參數進行單因素分析及多因素Cox 比例風險回歸模型分析，明確其與結直腸癌患者生存期關系。結果：RT-PCR法顯示FBXW7在癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）；免疫組化結果顯示FBXW7主要表達于細胞核，且其在癌旁組織中表達陽性率（79.7%）明顯高于結直腸癌組織（54.2%）；結直腸癌患者生存期關系的單因素分析結果顯示，腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移、腫瘤浸潤深度、Dukes分期及FBXW7的表達與結直腸癌患者生存期長短有相關性（P<0.05），而結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤的直徑、腫瘤大體分型與結直腸癌患者生存期長短均無相關性（P>0.05）。FBXW7陽性為影響結直腸癌患者生存期的獨立因子，風險度為2.42，差異有統計學意義（P=0.015<0.05）。結論：FBXW7在癌組織中不表達或低表達而在癌旁組織高表達；FBXW7可能是影響結直腸癌患者生存期的獨立因子且其表達與結直腸癌發生發展及預后之間有一定關系。

【關鍵詞】 FBXW7； 結直腸癌； 獨立因子； 研究

Expression of FBXW7 and Its Correlation with Colorectal Cancer/JIANG Shu-zhong，HUA Jia-jia，ZHANG Ling-yan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：008-012

【Abstract】 Objective：To elucidate the expression of FBXW7 and its effect on the occurrence，development and prognosis in colorectal cacer.Method：A total of 16 cases of fresh colorectal cacer and adjacent tissues were collected and detected FBXW7 expression by real-time PCR，then analyzed by univariate analysis and multivariate Cox proportional hazards regression model analysis with various clinicopathological parameters to clarify its relationship with the survival of patients with colorectal cancer.Result：RT-PCR showed that the expression of FBXW7 was lower than that of adjacent tissue（P<0.05）.Immunohistochemistry results showed that FBXW7 mainly expressed in the nucleus and its expression in the pericarcinous tissue（79.7%） was significantly higher than that of colorectal cancer tissue（54.2%）.According to the results of single factor analysis of the surial in patients with colorectal cancer，the degree of tumor differentiation，having or not lymph node metastasis，with or without distant metastasis，tumor infiltrated depth，Dukes staging and the expression of FBXW7 were correlated with the the survival of colorectal cancer patients（P<0.05），but there were no correlation between sex，age，tumor site，tumor diameter，tumor general classification with the survival of colorectal cancer patients（P>0.05）.FBXW7 was the independent factor of the survival of colorectal cancer patients and the risk degree was 2.42，P=0.015<0.05.Conclusion：FBXW7 expresses in pericarcinous tissue and with low or no expression in colorectal cacer.FBXW7 might be the independent factor of the survival of colorectal cancer patients and its expression correlated with the the occurrence，development and prognosis in colorectal cacer.

【Key words】 FBXW7； Colorectal cancer； Independent factor； Study

First-authors address：The Sixth Peoples Hospital of Nantong，Nantong 226011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.003

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，在全世界范圍內的發病率位居第三位，僅次于肺癌和胃癌，嚴重威脅著人類的健康。近二十幾年來結直腸癌的5年總體生存率在50%～60%，目前治療結腸癌的首選治療方法依舊是手術切除配合化療或放療等[1]。在一樣的治療干預下，早期結腸癌5年生存率90%以上，而晚期低于10%，預后很差[2]。所以早期發現、早期診斷和早期治療，是提高結腸癌患者存活率的關鍵[3]。可是因為早期結腸癌患者臨床癥狀較輕或者沒有顯著的臨床表現，造成早期發現和診斷相對困難，一旦發現大多處于晚期，預后很差。FBXW7作為抑癌因子和腫瘤轉移抑制因子已被證實[4]，但其在結直腸癌發生發展中的具體作用機制以及對預后的判斷等還不完全明確[5]。本研究將建立合適的實驗模型、擴大樣本量，采取更多的實驗方法來盡可能明確其在結直腸癌關鍵作用，以期為結直腸癌的早期診斷、判斷預后及靶向治療提供一個新的途徑，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 標本來源 RT-PCR組織標本：收集來自于南通大學附屬醫院及南通市第六人民醫院住院手術治療的結直腸癌及配對的癌旁組織新鮮標本16例，新鮮組織離體后去除出血、壞死及電灼組織，用生理鹽水洗去血污，30 min內置于-70 ℃冰箱內保存，用作RNA提取。免疫組化研究對象及標本：結直腸癌及癌旁石蠟組織標本來源于2004年4月-2015年2月南通大學附屬醫院住院手術患者，入選結直腸癌及癌旁組織標本共59對。其中男36例，女23例；年齡<69歲29例、≥69歲30例；腫瘤部位在右半結腸33例，左半結腸及直腸26例；腫瘤直徑≤5 cm 32例，>5 cm 27例；大體分型為腫塊型27例，潰瘍型32例；病理類型均為腺癌；分化程度為高分化10例，中分化42例，低分化7例。病理分級采用常用國際Dukes分期法，A期15例，B期26例，C期14例，D期4例；術后中位生存期為50個月。結直腸癌診斷及分期根據國際抗癌聯盟（UICC）制定的標準。

1.1.2 實驗試劑 TRIZOL RNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司，免疫組化染色試劑盒（PV-9003）和DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，抗FBXW7抗體及二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗流程與方法

1.2.1 RNA抽提、逆轉錄和RT-PCR 取出高溫高壓消毒后研缽，切取50～100 mg冰凍組織置于研缽內，倒入液氮，研碎，直至看不見組織和細胞碎片，加入1 mL的TRIZOL后將勻漿標本轉移到1.5 mL的EP管中，室溫放置5 min；加入0.2 mL的氯仿，加蓋搖晃15 s，在15～30 ℃放置2～3 min，離心12 000 r/min，15 min，離心后分成三層，將上層水相轉移到另一干凈的EP管中， 加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，離心12 000 r/min，10 min，去上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7500 r/min，5 min，去上清，置真空或空氣中5～10 min，干燥RNA沉淀；用無RNase水重懸RNA沉淀，用槍頭反復吹打幾次，55～60 ℃靜置10 min，測濃度后-20 ℃保存。

在20 μL體系中，加入1 μg總RNA，1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×DNA Eraser Buffer和RNase-Free水至10 μL。混勻后于42 ℃保溫2 min，4 ℃置于冰上。向反應體系中先后加入5 uL RNase-Free水，

2 μL 5 × PrimeScript Buffer 2，1 μL RT Primer Mix，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix 1，37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，進行逆轉錄反應；在冰上加入12.5 μL SYBR PremixEX TapTM Ⅱ（2×），1 μL PCR Forward Primer，1 μL PCR Reverse Primer，2 μL cDNA模板，8.5 μL ddH2O進行Real time PCR反應，設置程序：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 15 s；58 ℃ 30 s，95 ℃15 s。以2-?CT法（CT代表循環閾值）計算基因的相對表達量。

1.2.2 免疫組織化學法檢測組織中FBXW7表達 所需腫瘤組織經由4%福爾馬林固定，自動脫水機脫水，透明，浸蠟處理，包埋成蠟塊，切成厚度為4～5 μm的薄片，載玻片要防止脫片。PBS沖洗，抗原修復用檸檬酸鹽緩沖液，微波中火10min，流水自然冷卻，每張切片加50 μL 3%H2O2，室溫下孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加50 μL 1∶60稀釋的FBXW7鼠抗人單克隆抗體，在室溫條件下孵育

1 h，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加50 μL聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗；除去PBS每張切片加50 μL抗鼠聚合物（poly-HRP anti- rat IgG），室溫下孵育30 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加50 μL新鮮配制的DAB，室溫條件下顯色5 min，蒸餾水沖洗。蘇木素復染，0.1% HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。以出現淡黃色至棕褐色顆粒且染色強度高于背景特異性著色者為陽性細胞。光鏡下半定量結果判斷，綜合考慮染色強度和陽性細胞數。染色強度分數標準：棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色1分；無著色0分。同樣物鏡下計數陽性細胞數：一個視野內著色細胞>75% 4分；51%～75% 3分；11%～50% 2分；≤10% 1分；陰性0分。兩項得分相乘：0～3分為陰性表達“-”；滿3分為“+”；4分為“++”；5分以上為“+++”。“+～+++”為陽性表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件對結果進行統計分析。實時定量PCR分析結直腸癌及其癌旁組織中FBXW7 mRNA表達結果（RQ值）呈偏態分布，故以中位數（檢測范圍）表示，軼和檢驗分析癌與癌旁組織中mRNA表達水平的差異；免疫組化結果中FBXW7蛋白在結直腸癌組織與癌旁組織間表達的比較及FBXW7蛋白表達與各臨床病理參數間關系的分析均采用軼和檢驗；單個臨床病理參數與結直腸癌患者生存期的分析采用Logrank單因素生存分析；FBXW7表達與結直腸癌患者生存期關系分析采用Kaplan-Meier生存分析；差異有統計學意義的各臨床病理參數間的多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FBXW7在結直腸癌中低表達而在癌旁組織中高表達 以實時定量PCR測定FBXW7在結直腸癌患者癌及癌旁組織中表達結果。結果顯示：FBXW7在癌組織中表達的RQ值為0.693 （0.013～1.914），而在癌旁組織中的結果為1.458 （0.038～2.293），經軼和檢驗分析，差異有統計學意義（Z=2.374，P=0.0176），說明FBXW7在結直腸癌中低表達而在癌旁組織中高表達，其RQ值箱體圖，見圖1。免疫組化檢測結果顯示FBXW7蛋白主要表達于細胞核，隨表達強度不同著色可依次表現為淡黃、棕黃至棕褐色不等。59例結直腸癌組織中FBXW7表達陽性率為54.2%（32/59），明顯低于癌旁組織79.7%（47/59），且強陽性（++、+++）主要集中在癌旁組織，而結直腸癌組織多為陰性（-、+）表達（Z=5.740，P<0.01），表1和圖2。

2.2 結直腸癌組織中FBXW7的表達與臨床病理學參數的關系 應用單因素分析結直腸癌組織中FBXW7與臨床各病理參數之間的關系。結果顯示，腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移、腫瘤浸潤深度、Dukes分期及FBXW7陽性與否與結直腸癌患者生存期間長短有相關性（P<0.05）。而結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤的直徑、腫瘤大體分型分別與結直腸癌患者生存期間長短均無相關性（P>0.05）。見表2。

2.3 FBXW7及各臨床病理參數與結直腸癌患者生存期Logrank單因素分析及多因素分析 將單因素分析差異有統計學意義的各參數采用多因素Cox 比例風險回歸模型進行分析。結果顯示：所有因素中FBXW7陽性為影響結直腸癌患者生存期的獨立因子，風險度為2.42，P=0.015<0.05，見表3和圖3。

3 討論

泛素蛋白酶體系統（ubiquitin proteasome system，UPS）在調控細胞周期蛋白、細胞的生長和增殖方面起重要作用[6]。泛素化的異常與細胞增殖失調和細胞異常分化有關，被認為是多種人類惡性腫瘤發生的基礎[7]。而泛素化作用主要有三種酶組成：泛素激活酶、泛素載體蛋白酶和泛素連接酶，泛素化底物則被26S蛋白酶體選擇性識別和降解。SCF類E3復合體作為泛素連接酶（E3）中的一類，由環指蛋白（Rbx1，也稱Roc1和Hrt1）、支架蛋白、銜接蛋白（Skp1）和一個F-box蛋白組成，而F-box蛋白類決定了底物特異性[8]。

FBXW7是F-box蛋白家族的一員，作為LIN-12介導（Notch介導）信號通路的負調節因子首次被發現在遺傳分析漂亮新小桿線蟲中[9]。FBXW7在哺乳動物細胞中也與Notch家族蛋白類相互作用，促進其泛素依賴的更新[10]。而且FBXW7靶向降解數個控制哺乳動物細胞周期進程的蛋白，包括CyclinE、c-Myc和c-Jun等雖不直接參與細胞周期調控的蛋白但也通過FBXW7靶向降解[11]。CyclinE、c-Myc、c-Jun等均是原癌基因的產物，FBXW7能促進降解這些癌蛋白，表明FBXW7作為SCF類泛素連接酶E3復合體中特異性識別底物的一個關鍵因子，即是一種廣泛的腫瘤抑制因子[12]。

已有相關研究表明FBXW7在膽管癌、白血病、宮頸癌等多種人類腫瘤中發生突變[13]。其中在急性T細胞型淋巴細胞白血病、肝癌、食管鱗狀細胞癌、肺癌、結直腸癌、胃癌[14]的研究中均已發現FBXW7的表達缺失。FBXW7作為抑癌因子和腫瘤轉移抑制因子已被證實，但其在結直腸癌發生發展中的具體作用機制以及對預后的判斷等仍未完全明確[15]。

總之，本研究表明FBXW7癌組織中不表達或低表達，癌旁組織高表達，表明FBXW7的表達與結直腸癌發生及發展之間有一定關系；FBXW7陽性為影響結直腸癌患者生存期的獨立因子，與結直腸癌的預后有直接關系。下一步可通過研究FBXW7過表達和干擾后對結直腸癌細胞增殖、凋亡、細胞周期和遷徙的影響以期明確其在結直腸癌關鍵作用，為結直腸癌的早期診斷、判斷預后及靶向治療提供一個新的途徑。

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（收稿日期：2016-10-24） （本文編輯：程旭然）