蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在Ⅰ型代謝型谷氨酸受體誘發(fā)痛覺超敏中的作用

薛 曼，楊云惠，索占偉，楊 嫻，胡曉東

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅 蘭州 730000)

◇論 著◇

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在Ⅰ型代謝型谷氨酸受體誘發(fā)痛覺超敏中的作用

薛 曼，楊云惠，索占偉，楊 嫻，胡曉東

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討Ⅰ型代謝型谷氨酸受體 (mGluRs) 的痛覺調(diào)制作用與蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 (Src homology-2 domain-containing phosphatase-2) 的關(guān)系。方法 以免疫共沉淀法，研究小鼠脊髓背角SHP-2與Ⅰ型mGluRs之間的相互作用；通過測定縮足閾值，觀察SHP-2抑制劑NSC-87877或SHP-2的無活性突變體SHP-2(C459S)對Ⅰ型mGluRs激動劑DHPG (50 nmol) 誘發(fā)的痛覺超敏的影響。結(jié)果 抗mGluR5的特異性抗體，能夠從脊髓背角中免疫共沉淀SHP-2，而抗mGluR1 的特異性抗體則無法沉淀出SHP-2；以NSC-87877 (6 nmol)或SHP-2(C459S)抑制SHP-2的活性，可有效緩解DHPG誘發(fā)的痛覺超敏。結(jié)論 SHP-2與mGluR5存在分子間的相互結(jié)合，SHP-2的激活可能參與Ⅰ型mGluRs的痛覺調(diào)制過程。

mGluR1/5；SHP-2；磷酸酶；脊髓背角；DHPG；NSC-87877

蛋白酪氨酸磷酸酶 (protein tyrosine phosphatases,PTPs) 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并參與神經(jīng)突觸發(fā)育、突觸可塑性以及一系列的生理、病理過程。在痛覺調(diào)控的關(guān)鍵部位——脊髓背角，PTPs的活化也是誘發(fā)中樞敏感化的重要機制之一。阻斷PTPs的活性，會有效緩解外周組織損傷誘發(fā)的痛覺超敏[1-2]。然而，PTPs家族的成員眾多，PTPs的脊髓痛覺調(diào)控機制到目前為止尚不清楚。

SHP-2 (Src homology-2 domain-containing phosphatase 2)是一種重要的非受體型酪氨酸磷酸酶。SHP-2包含2個SH2 (Src homology-2) 結(jié)構(gòu)域以及1個酪氨酸磷酸酶的催化域 (PTP區(qū)域)。在靜息狀態(tài)下，N末端的SH2結(jié)構(gòu)域會與PTP區(qū)域相結(jié)合，使SHP-2處于滅活狀態(tài)。一旦SH2結(jié)構(gòu)域與其他的酪氨酸磷酸化蛋白相結(jié)合，就會使PTP區(qū)域充分暴露，導(dǎo)致SHP-2的激活[3-4]。

大量的研究顯示，脊髓背角中的代謝型谷氨酸受體 (mGluRs) 對中樞敏感化的形成至關(guān)重要。mGluRs根據(jù)組成的亞基不同，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受體[5-6]；其中，Ⅰ型代謝型谷氨酸受體 (包括mGluR1和mGluR5，合稱mGluR1/5) 在痛覺信息傳遞中的作用尤為關(guān)鍵[7-8]。激動mGluR1/5，即使在正常動物也會誘發(fā)痛覺超敏；而抑制mGluR1/5，則會阻斷脊髓突觸可塑性的形成。本文首次探討了SHP-2在mGluR1/5介導(dǎo)的痛覺調(diào)制中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 ♂成年昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 材料 3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG; Sigma, USA)；8-hydroxy-7-[(6-sulfo-2-naphthyl)azo]-5-quinolinesulfonic acid disodium salt (NSC-87877; Tocric Bioscience, USA)；抗mGluR1抗體 (Proteintech, USA)；抗mGluR5抗體 (北京博奧森)；抗SHP-2抗體 (武漢博士德)；pIRES2-EGFP-SHP2(C459S) (Addgene)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA)；Von-Frey纖維 (Stoehing, USA)；PVDF膜 (Millipore, USA)。

1.3 方法

1.3.1 鞘內(nèi)給藥 小鼠四肢固定，一根25 μL的微量注射器針頭沿L5-L6節(jié)段棘突間隙插入，以明顯的空洞感及小鼠甩尾作為針頭進入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志，緩慢推注5 μL的化學(xué)藥物；對照組注射5 μL生理鹽水。注射完畢后，輕輕按揉注射部位。采用100 mmol·L-1的polyethylenimine (PEI) 作為轉(zhuǎn)染試劑，將5 μg 的pIRES2-EGFP-SHP2(C459S)與PEI按照DNA中的P與PEI中N的摩爾比值為1 ∶10的比例，輕輕混勻，室溫靜置30 min后，鞘內(nèi)注射；對照組轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP。

1.3.2 縮足閾值的測定 以Up-Down法測定Von Frey纖維誘發(fā)的縮足反應(yīng)，通過以下公式計算50% 縮足閾值 (PWT)：50% PWT=(10[Xf+Kδ])/10 000，其中δ=0.26；Xf代表最后一個使用的Von Frey纖維的力度值；K代表反應(yīng)系數(shù)(可查表獲得)。

1.3.3 免疫共沉淀 腹腔注射戊巴比妥鈉 (60～90 mg·kg-1) 麻醉動物，行椎板切除術(shù)，快速分離脊髓至4 ℃的人工腦脊液[ACSF，成分 (mmol·L-1)：119.0 NaCl、1.3 MgCl2、1.0 NaH2PO4、2.5 KCl、2.5 CaCl2、26.0 NaHCO3、11.0 D-glucose，pH 7.4, bubbled with 95% O2+5% CO2] 中，剝離軟、硬脊膜，分離L4-L5膨大部脊髓背角。在RIPA緩沖液 (50 mmol·L-1Tris·HCl, pH 8.0, 150 mmol·L-1NaCl, 1 mmol·L-1EDTA, 體積分?jǐn)?shù)為0.01的NP-40, 質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的SDS, 質(zhì)量濃度為5.0 g·L-1DOC, 蛋白酶/磷酸酶抑制劑) 中，制備全細(xì)胞勻漿，4 ℃裂解30 min后，14 000×g離心10 min；上清中加入抗mGluR1或mGluR5的特異性抗體，4 ℃孵育過夜，加入Protein A+G Agarose beads，4 ℃孵育3～4 h，1 000×g離心1 min，去掉上清，以RIPA緩沖液清洗3次后，加入樣品緩沖液，95 ℃煮樣5 min，-20 ℃保存。

1.3.4 免疫印跡 20 μg蛋白上樣，8% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并印跡于PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，用相應(yīng)蛋白的特異性抗體4 ℃孵育過夜；洗滌，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h；ECL發(fā)光試劑盒顯像。利用Image J軟件進行圖像統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 mGluR5能夠與SHP-2相結(jié)合 為探討mGluR1和mGluR5是否與SHP-2之間存在相互作用，本實驗以抗mGluR1和mGluR5的特異性抗體，分別從脊髓背角的全細(xì)胞勻漿液中進行免疫共沉淀，通過免疫印跡法檢測沉淀物中的SHP-2。結(jié)果顯示，抗mGluR5的特異性抗體能夠共沉淀SHP-2 (Fig 1A)，但抗mGluR1的特異性抗體卻無法沉淀出SHP-2 (Fig 1B)，提示只有mGluR5能夠與SHP-2相結(jié)合。

Fig 1 mGluR5 selectively interacted with SHP-2 (n=6)

A: Specific antibody against mGluR5 co-immunoprecipitated (Co-IP) SHP-2 from spinal dorsal horn of adult intact mice. Non-specific IgG was utilized as negative control; B: No SHP-2 was Co-IP by anti-mGluR1 antibody. IB: immunoblotting

2.2 SHP-2抑制劑NSC-87877對DHPG誘發(fā)的痛覺超敏的影響 資料顯示，激動脊髓背角的代謝型谷氨酸受體，會在正常動物中誘發(fā)明顯的痛覺超敏。既然mGluR5能夠與SHP-2相互作用，我們探討了mGluR5是否通過SHP-2而起效。為此，我們將動物分為3 組進行實驗，F(xiàn)ig 2結(jié)果顯示：① 對照組：鞘內(nèi)注射5 μL的生理鹽水，動物的縮足閾值 (PWT) 不會發(fā)生明顯改變；30 min后鞘內(nèi)再次給予5 μL的生理鹽水，也不會對PWT值產(chǎn)生明顯影響；② DHPG組：鞘內(nèi)注射DHPG (50 nmol) 之后15 min，可見動物的PWT值明顯降低，并在第30 min時PWT值降至最低，提示痛覺超敏的形成[PWT值由(1.68±0.15) g降低至(0.26±0.04) g，P<0.05]；此時，鞘內(nèi)給予5 μL的生理鹽水，不會對痛覺超敏產(chǎn)生任何影響；③ NSC-87877組：鞘內(nèi)注射DHPG (50 nmol) 后30 min，再次給予NSC-87877 (6 nmol)，發(fā)現(xiàn)NSC-87877作用10min和25min后，動物的PWT值會明顯升高[PWT值由(0.40±0.06) g升高至(1.58±0.19) g和(1.68±0.20) g，P<0.05]，提示抑制SHP-2的活性，能夠緩解DHPG誘發(fā)的痛覺超敏。

Fig 2 SHP-2 inhibitor NSC-87877 attenuated the allodynia induced by DHPG in mice(n=6)

The paw withdrawal thresholds of intact mice were measured for successive two days, followed by intrathecal injection (i.t.) of saline or DHPG (upward arrow indicated the time point of injection). Thereafter, NSC-87877 or saline was spinally superimposed (as indicated by the downward arrow) to observe the changes of pain thresholds.*P<0.05vssaline/saline-injected control mice;#P<0.05vsDHPG/saline-injected mice.

2.3 SHP-2無活性突變體SHP-2(C459S)對DHPG誘發(fā)的痛覺超敏的影響 NSC-87877除了抑制SHP-2外，還可抑制SHP-1等酪氨酸磷酸酶。為特異性探討SHP-2的作用，本研究將動物分為3 組進行實驗，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示：① 對照組：脊髓轉(zhuǎn)染GFP對照蛋白，對動物的PWT值不會產(chǎn)生明顯的影響；轉(zhuǎn)染3 d后，鞘內(nèi)給予生理鹽水，也不會明顯改變PWT值；② DHPG組：脊髓轉(zhuǎn)染GFP對照蛋白后3 d，鞘內(nèi)給予DHPG (50 nmol)，會快速降低PWT值，且這一作用可維持至少45 min[PWT值由(1.87±0.13) g降低至(0.45±0.05) g，P<0.05]；③ SHP-2(C459S)組：脊髓轉(zhuǎn)染SHP-2的無活性突變體SHP-2(C459S)以選擇性抑制SHP-2，發(fā)現(xiàn)SHP-2(C459S)本身不會對基礎(chǔ)PWT值產(chǎn)生明顯影響[PWT值由(1.93±0.04) g轉(zhuǎn)變至(1.96±0.04) g，P>0.05]，但卻能夠完全阻斷DHPG (50 nmol) 誘發(fā)的PWT值的降低，提示激活SHP-2可能是DHPG誘發(fā)痛覺超敏的重要機制。

Fig 3 The catalytically inactive SHP-2(C459S) mutant ameliorated the allodynia induced by DHPG in mice (n=6)

The paw withdrawal thresholds (PWT) of intact mice were measured for successive two days, followed by i.t. of pIRES2-EGFP vectors encoding GFP or GFP-tagged SHP-2(C459S) (downward arrow indicated the time point of injection). Three days later, DHPG (50 nmol) or saline was spinally superimposed (as indicated by the upward arrow) to observe the changes of pain thresholds.*P<0.05vsGFP/saline-injected control mice;#P<0.05vsGFP/DHPG-injected mice.

3 討論

SHP-2是表達(dá)在胞質(zhì)中的蛋白酪氨酸磷酸酶，廣泛參與細(xì)胞凋亡、白血病等病理、生理過程。NSC-87877能夠與SHP-2的磷酸酶區(qū)域 (PTP domain) 相結(jié)合，抑制SHP-2的活性[9]。我們的前期研究顯示，鞘內(nèi)注射NSC-87877能夠明顯緩解完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA) 誘發(fā)的炎性痛覺超敏[1]，提示外周損傷能夠激活脊髓背角中的SHP-2，使之參與中樞敏感化的形成。但脊髓背角SHP-2的激活機制，到目前為止尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，mGluR5可能是SHP-2的上游激活受體，因為不僅NSC-87877能夠緩解DHPG誘發(fā)的正常小鼠的痛覺超敏，而且SHP-2的非活性突變體也能夠產(chǎn)生相似的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，提示mGluR5/SHP-2信號通路可能在脊髓痛覺調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

SHP-2包含2個SH2結(jié)構(gòu)域，1個位于N-末端(N-SH2)，1個位于C-末端 (C-SH2)；N-SH2會與PTP domain相結(jié)合，抑制SHP-2的催化活性。除了這種分子內(nèi)的自身結(jié)合，SH2還能夠與其他酪氨酸磷酸化的膜受體或胞內(nèi)蛋白發(fā)生分子間的結(jié)合；這種結(jié)合，會打斷N-SH2與PTP domain的自身結(jié)合，導(dǎo)致SHP-2的構(gòu)象發(fā)生改變，進而明顯增強SHP-2的活性。資料顯示，mGluR5是一種Gq蛋白偶聯(lián)受體，包含7個跨膜區(qū)域、3個胞內(nèi)大環(huán)(intracellular loop)以及1個胞內(nèi)C末端序列。其中，胞內(nèi)C末端能夠與許多蛋白發(fā)生相互作用。以抗酪氨酸磷酸化的抗體或mGluR5的抗體進行檢查，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)C末端的多個酪氨酸殘基能夠被催化磷酸化[10-12]，而mGluR1的胞內(nèi)C末端卻不能夠發(fā)生酪氨酸磷酸化。本研究結(jié)果顯示，抗mGluR5的特異性抗體能夠選擇性地沉淀SHP-2，但抗mGluR1的抗體卻不能夠沉淀SHP-2，提示mGluR5與SHP-2之間存在密切的功能聯(lián)系。但其具體的相互作用機制及其對下游信號分子的調(diào)控，尚有待于進一步的深入研究。

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Role of protein tyrosine phosphatase SHP-2 in group I metabotropic glutamate receptors-induced allodynia

XUE Man, YANG Yun-hui, SUO Zhan-wei, YANG Xian, HU Xiao-dong

(DeptofMolecularPharmacology,SchoolofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Aim To investigate whether the pain modification by group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) required the involvement of Src homology-2 domain-containing phosphatase-2(SHP-2). Methods Co-immunoprecipitation was performed to examine the possible interaction between SHP-2 and group I mGluRs in spinal cord dorsal horn of mice. By measuring the paw withdrawal thresholds, the effects of SHP-2 inhibitor NSC-87877 or its catalytically inactive SHP-2(C459S) mutant on allodynia induced by group I mGluRs agonist DHPG (50 nmol) were observed. Results Anti-mGluR5 antibody was able to co-immunoprecipitate SHP-2 from spinal dorsal horn of mice, while no SHP-2 was precipitated by anti-mGluR1 antibody. Inactivation of SHP-2 by NSC-87877 (6 nmol) or SHP-2(C459S) effectively attenuated allodynia caused by DHPG. Conclusion SHP-2 can physically interact with mGluR5. The activation of SHP-2 may be necessary for group I mGluRs to process the nociceptive information.

mGluR1/5; SHP-2; phosphatase; spinal cord dorsal horn; DHPG; NSC-87877

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.012.html

2016-11-19，

2016-12-26

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31471060)

薛 曼(1992-)，女，碩士生，研究方向：慢性疼痛的中樞發(fā)生機制，E-mail：xueman488919@163.com； 胡曉東(1972-)，男，博士，教授，研究方向：慢性疼痛的中樞發(fā)生機制，通訊作者，Tel：0931-8620265，E-mail: huxxiaodong@lzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.006

A

1001-1978(2017)02-0171-04

R-332；R322.81；R392.11；R441.1；R977.3