茶多酚對高尿酸血癥小鼠尿酸產生與排泄的影響及機制研究

陳 剛，譚明亮

(重慶市天然藥物研究重點實驗室，重慶工商大學環境與資源學院，重慶 400067)

茶多酚對高尿酸血癥小鼠尿酸產生與排泄的影響及機制研究

陳 剛，譚明亮

(重慶市天然藥物研究重點實驗室，重慶工商大學環境與資源學院，重慶 400067)

目的 觀察茶多酚(green tea polyphenols, GTP)對氧嗪酸鉀(PO)誘導的高尿酸血癥(HUA)小鼠血尿酸水平的影響，并從調節尿酸產生和排泄途徑探討其藥理機制。方法 每天分別灌胃給予PO(250 mg·kg-1)和GTP(150、300、600 mg·kg-1)，連續7 d。磷鎢酸法檢測小鼠血尿酸水平，比色法和Western blot法分別檢測肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)活性與表達，免疫組織化學染色法檢測腎臟中尿酸鹽轉運子1(URAT1)、有機陰離子轉運子(OAT)1和3的表達。結果 GTP明顯降低了氧嗪酸鉀誘導的HUA小鼠血尿酸水平(P<0.05或P<0.01)；同時，GTP明顯降低了HUA小鼠肝臟XOD的活性和表達(P<0.05或P<0.01)；此外，GTP還明顯降低了HUA小鼠腎臟URAT1的表達，增強了OAT1和OAT3的表達(P<0.05或P<0.01)。結論 GTP對PO誘導的HUA小鼠血尿酸水平有明顯降低作用，其機制與減少尿酸產生和增加尿酸排泄密切相關。

茶多酚；尿酸；高尿酸血癥；黃嘌呤氧化酶；尿酸鹽轉運子1；有機陰離子轉運子1；有機陰離子轉運子3

近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)發病率明顯升高，且有年輕化的趨勢[1]。HUA不僅是痛風的生化基礎，還與高血壓、冠心病、代謝綜合征、糖尿病等密切相關[2]，如何防治HUA已成為全世界關注的公共健康問題。尿酸是嘌呤堿代謝產物，其在體內的產生主要受肝臟中的黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)催化調節，而排泄則主要依賴于腎臟中的尿酸轉運子如尿酸鹽陰離子轉運子(urate anion transporter, URAT)1、有機陰離子轉運子(organic anion transporter, OAT)1和3轉運調節，因此，尿酸生成增加和(或)排泄障礙被認為是HUA發病的主要原因[3]。當前臨床治療HUA主要是應用XOD抑制劑如別嘌醇、非布司他，以及促尿酸排泄藥如苯溴馬隆，但存在著藥物品種少、副作用明顯的缺陷[4]，因此，尋找新的療效確切且副作用低的降尿酸藥物意義重大。

茶多酚(green tea polyphenols, GTP)是綠茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、咖啡堿(caffeine, CAF)、表兒茶素(epicatechin, EC)及兒茶素(Catechin, C)等，是綠茶的主要活性部位[5]。已有的研究證實GTP有減肥、降血脂、抗癌、抗骨質疏松等藥理活性[6]，但是GTP對高尿酸血癥的影響如何，至今未見報道。本研究應用氧嗪酸鉀(PO)誘導的小鼠HUA模型，觀察了GTP對HUA小鼠血尿酸水平的影響，并從尿酸產生和排泄途徑探討其作用機制，為明確GTP降尿酸的藥理作用提供科學依據。

1 材料

1.1 試劑 綠茶購自重慶云嶺茶葉科技責任有限公司(產品標準：Q/YLC0002S，生產許可：QS508314010005)；別嘌醇(allopurinol, API)購自重慶青陽藥業有限公司(國藥準字：H50021422，產品批號：120903)；尿酸試劑盒、XOD試劑盒及BCA蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；茶多酚各成分標準品、PO均購自Sigma公司；XOD、URATl、OAT1、OAT3和β-actin抗體均購自Santa Cruz公司；PVDF膜和ECL試劑購自Millipore公司；免疫組織化學染色試劑盒(二步法)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 Infinite M200型全標儀為BioTek公司產品；RC24型高速冷凍離心機為Thermo Scientific Sorvall公司產品；Mill-iQ型純水系統為Millipore公司產品；1100型高效液相色譜儀為Agilent公司產品；ChemiDoc XRS成像系統為Bio-Rad公司產品。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，♂，18 g～22 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心(動物合格證號：SCXK(渝)2002-0001)。所有動物適應性喂養1周后開始實驗。

2 方法

2.1 茶多酚的制備與檢測 依據文獻所述方法[7]制備GTP，提取率為15.6%(W/W)，并用高效液相色譜法檢測GTP中主要成份含量(Fig 1、Tab 1)。

IngredientContent/g·100g-1GTPEGCG42．46±0．73GCG13．48±0．48ECG11．68±0．12EGC8．02±0．07EC4．36±0．04C1．41±0．24CAF4．96±0．16

2.2 模型制備與分組給藥 60只昆明小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為對照組、模型組、API組(陽性藥，5 mg·kg-1)、GTP組(150、300、600 mg·kg-1)。本實驗所用的GTP劑量依據預實驗結果確定。對照組給予生理鹽水，其他組每天上午9點開始給予250 mg·kg-1PO灌胃，10點灌胃給予相應藥物，連續用藥7 d。d 7灌胃給藥1 h后，小鼠麻醉處死、取材。

Fig 1 Chromatogram of GTP using a HPLC system

2.3 尿酸檢測 麻醉小鼠后心臟取血，4℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，尿酸含量檢測依照試劑盒說明書進行。

2.4 XOD活性檢測 取小鼠肝臟組織于冰上按1 ∶9的比例(W/V)加入生理鹽水充分研磨，4℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液[8]，XOD活性與蛋白濃度檢測均依照試劑盒說明書進行。

2.5 XOD表達分析 肝組織總蛋白提取依照文獻進行[9]，取小鼠肝臟組織液氮速凍后，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑充分勻漿，4℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃下與XOD抗體或者β-actin抗體共同孵育過夜，再與相應的二抗在室溫下共同孵育1 h，滴加ECL試劑后，成像系統檢測分析信號。

2.6 尿酸轉運子表達分析 取小鼠腎臟于10%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水，免疫組化檢測按照試劑盒說明書進行，顯微鏡下(400×)分析陽性染色的光密度值，每張切片取5個視野的平均光密度值納入該蛋白表達的統計分析。

3 結果

3.1 GTP對HUA小鼠血尿酸水平的影響 如Tab 2所示，與對照組比較，灌胃PO使模型組小鼠血尿酸水平明顯升高(P<0.01)。給予陽性藥物別嘌醇灌胃后，小鼠血尿酸水平明顯降低，與模型組比較有明顯的統計學意義(P<0.01)。同時，灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后小鼠血尿酸水平也明顯降低，與模型組比較有明顯的統計學意義(P<0.05或P<0.01)；但灌胃150 mg·kg-1GTP后小鼠血尿酸水平與模型組比較無統計學差異。

3.2 GTP對HUA小鼠肝臟XOD活性的影響 如Tab 2所示，灌胃PO后模型組小鼠肝臟XOD活性與對照組相比明顯增高(P<0.01)。使用別嘌醇后小鼠肝臟XOD活性與模型組相比明顯降低(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠肝臟XOD活性與模型組相比也明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且呈現明顯的劑量依賴性。

Tab 2 Effect of GTP on uric acid level in serum and XOD activity in liver of hyperuricemic±s,n=10)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3 GTP對HUA小鼠肝臟XOD表達的影響 與對照組比較，灌胃給予PO誘導模型組小鼠肝臟中XOD表達明顯增加(P<0.01)。給予別嘌醇治療后，小鼠肝臟XOD表達明顯減少，與模型組相比差異有明顯統計學意義(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠肝臟XOD表達與模型組相比也明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且呈現明顯的劑量依賴性。見Fig 2。

Fig 2 Effect of GTP on XOD expression in liver of hyperuricemic mice

XOD protein was analyzed by Western blot assay(A) and semi-quantitative analysis of XOD bands was performed by densitometry(B). Three independent experiments performed in duplicate.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4 GTP對HUA小鼠腎臟URAT1、OAT1、OAT3表達的影響 與對照組比較，灌胃給予PO誘導了模型組小鼠腎臟URAT1表達明顯增加，同時OAT1、OAT3表達明顯降低(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠腎臟URAT1表達明顯減少，同時OAT1、OAT3表達明顯增加(P<0.05，P<0.01)。給予別嘌醇治療后，小鼠腎臟URAT1、OAT1、OAT3的表達與模型組比較差異無統計學意義。見Fig 3、Tab 3。

Fig 3 Effect of GTP on expression of URAT1,OAT1 and OAT3 in kidney of hyperuricemic mice

GroupDose/mg·kg-1URAT1OAT1OAT3Control-0．19±0．040．6±0．110．53±0．1Model-0．55±0．07??0．35±0．07??0．33±0．04??API50．52±0．110．33±0．050．36±0．06GTP1500．55±0．090．32±0．080．36±0．093000．48±0．07#0．44±0．07##0．44±0．09##6000．38±0．05##0．49±0．09##0．45±0．09##

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

本研究應用PO誘導的HUA小鼠模型，發現GTP可降低HUA小鼠血尿酸水平，同時GTP降低了肝臟XOD活性和表達，減少了腎臟中URAT1蛋白的表達，且腎臟中OAT1、OAT3蛋白的表達有所增加。

近年來，HUA發病率在全世界范圍內明顯增高，而且年輕化趨勢明顯，如何控制HUA已成為當今醫藥學界重點關注領域[1]。目前，已有多種動物模型用于HUA基礎研究和藥物研發，其中PO誘導的HUA模型被廣泛應用。PO可抑制嚙齒類動物體內尿酸酶活性，阻斷尿酸代謝成為水溶性更高的尿囊素，從而導致血尿酸水平異常升高[9]。該模型用時短，費用也相對低廉，高尿酸水平能穩定維持，故本實驗選用該模型用于觀察GTP的降尿酸作用及藥理機制研究。我們發現，給予小鼠灌胃250 mg·kg-1PO連續7 d，誘導了小鼠血尿酸水平明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義；同時給予臨床常用的降尿酸藥物API，小鼠血尿酸水平明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義。上述結果表明，GTP有較明顯的降尿酸藥理作用，

尿酸是嘌呤堿代謝終產物，黃嘌呤在XOD作用下代謝為次黃嘌呤，再繼續在XOD作用下代謝成為尿酸[2]。機體內XOD含量最高的器官是肝臟，所以肝臟是人體尿酸產生的主要器官。抑制肝臟XOD活性或者表達勢必明顯減少尿酸的產生，降低血尿酸水平[10]。XOD一直是治療HUA的藥物研發的靶點，且當今臨床常用的XOD抑制劑如別嘌醇及非布司他表現出有效的降尿酸作用，凸顯了調控XOD對維持機體尿酸穩態的重要性[11]。本研究中我們發現，給予PO連續灌胃7 d明顯誘導了小鼠肝臟XOD活性增強，XOD表達也明顯增加，這一結果與其他文獻報道的研究結果相似[12]。給予API用藥后，HUA小鼠肝臟XOD活性和表達均明顯降低。給予GTP治療后，PO誘導升高的小鼠肝臟XOD活性和表達也均明顯降低，與模型組比較有明顯的統計學差異。這些結果表明，GTP對PO誘導的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平有明顯的降低作用，其機制與抑制肝臟XOD活性和表達，從而減少尿酸產生密切相關。

機體的尿酸約70%由腎臟排泄，剩下的30%通過消化道排泄[13]。血液中的尿酸鹽幾乎全部從腎小球過濾，但是90%過濾后的尿酸在腎小管被重吸收[14]。URAT1主要表達于腎小管上皮細胞刷狀緣，是迄今發現的介導尿酸重吸收最強有力的有機陰離子轉運體，在維持血尿酸穩態中的重要作用[15]。OAT1和OAT3大量表達于腎近端小管基底膜，主要功能是將管周隙的有機陰離子包括尿酸鹽通過基底膜轉運到腎近曲小管上皮細胞中，由此排泌到尿液，是公認的人體內介導尿酸分泌入腎小管的關鍵轉運體[16-17]。在本研究中，給予PO連續灌胃7 d誘導了腎臟組織中的URAT1表達明顯增高，同時OAT1和OAT3表達明顯降低，提示PO導致了腎臟尿酸代謝紊亂，即尿酸鹽重吸收增強而分泌減弱，最終使得血尿酸水平升高。給予GTP治療7 d后，PO誘導高表達的URAT1則明顯減少，而PO誘導低表達的OAT1和OAT3則明顯增加，提示GTP通過減少尿酸鹽重吸收和增強尿酸鹽分泌改善了PO導致的腎臟尿酸代謝紊亂，最終使得血尿酸水平降低。

綜上所述，本研究結果發現GTP可降低PO誘導的HUA小鼠血尿酸水平，其機制既與抑制XOD介導的尿酸產生有關，又與調控尿酸轉運子介導的尿酸排泄密切相關。本研究證實了GTP具有降低血尿酸水平的作用，并初步闡明了其藥理機制，為開發利用GTP為新的降尿酸健康產品提供了科學依據。

(致謝:本實驗均在重慶工商大學重慶市天然藥物研究重點實驗室完成。感謝該實驗室孔淑貞博士、馮敏博士給予的技術支持。)

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Effect of green tea polyphenols on uric acid level in potassium oxonate-induced hyperuricemic mice and mechanism

CHEN Gang, TAN Ming-liang

(ChongqingKeyLaboratoryofNatureMedicineResearch,

ChongqingTechnologyandBusinessUniversity,Chongqing400067,China)

Aim To investigate the effect of green tea polyphenols(GTP) on serum level of uric acid in potassium oxonate(PO)-induced hyperuricemic mice, and explore the potential mechanism.Methods PO and GTP were intragastricly administered to mice for seven consecutive days. Uric acid level in serum was examined. Meanwhile, activity and expressions of xanthine oxidase(XOD) in liver were tested. In additon, expressions of urate transporters including urate-anion transporter(URAT) 1, organic anion transporter(OAT) 1 and 3 in kidney were analyzed.Results GTP significantly decreased the serum level of uric acid in PO-induced hyperuricemic mice. At the same time, GTP markedly reduced the activity and expression of XOD in liver of hyperuricemic mice. Finally, GTP markedly reduced the expression of URAT1, OAT1 and OAT3 in kidney of hyperuricemic mice.Conclusion GTP has the effect of lowering uric acid in PO-induced hyperuricemic mice through both decreasing the uric acid production and increasing uric acid excretion.

green tea polyphenols; uric acid; hyperuricemia; xanthine oxidase; urate-anion transporter 1; organic anion transporter 1; organic anion transporter 3

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.030.html

2016-10-22,

2016-11-25

重慶市教委科學技術研究項目(No KJ1400626)；重慶市科委前沿與應用基礎研究項目(No cstc2016jcyja0475)

陳 剛(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：高尿酸血癥與痛風的發病機制與藥物防治，通訊作者，E-mail：licoricech@ctbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.015

A

1001-1978(2017)02-0218-05

R-332；R284.1；R446.11；R589.7