黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細胞氧糖剝奪/復糖復氧后自噬性損傷相互作用的研究

丁 煌，李靜嫻，唐 標，劉曉丹，李 玲，唐映紅，鄧常清，黃小平

(湖南中醫藥大學分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208)

黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細胞氧糖剝奪/復糖復氧后自噬性損傷相互作用的研究

丁 煌，李靜嫻，唐 標，劉曉丹，李 玲，唐映紅，鄧常清，黃小平

(湖南中醫藥大學分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208)

目的 探討黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對PC12細胞氧糖剝奪后再復糖復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)誘導的細胞自噬性損傷的影響及其相互作用。方法 以PC12細胞建立OGD/R自噬性損傷模型，分別設立黃芪甲苷和人參皂苷Rg1不同劑量，藥物干預細胞后，以激光共聚焦顯微鏡檢測自噬體評價藥物對細胞自噬性損傷的作用，并計算藥物的半數抑制濃度(median inhibitory concentration, IC50)。以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50為1個劑量單位，按Isobologram法分別設立黃芪甲苷與人參皂苷Rg1不同比例(1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1)的配伍，研究藥物對細胞自噬的影響，計算各比例配伍的IC50，采用Isobologram及95%可信區間和相互作用指數γ分析黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抑制自噬的相互作用性質。在此基礎上，以黃芪甲苷與人參皂苷Rg1的IC50劑量進行1 ∶1配伍，以細胞存活率、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出率、自噬體數量及p62蛋白表達評價藥物配伍對細胞損傷和細胞自噬的影響。結果 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1抑制自噬的IC50及其95%可信區間分別為(27.22±0.614)mg·L-1[25.96, 29.03]、(13.68±1.334)mg·L-1[10.27, 16.95]。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在1 ∶1配伍時呈現協同增效作用，而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在1 ∶2和2 ∶1配伍時，呈拮抗作用。以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50劑量進行1 ∶1配伍驗證，結果顯示單用黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以及配伍均能增強細胞存活率，減輕LDH漏出，減少自噬體數量和LC3-Ⅱ蛋白數量，增加p62蛋白表達，且配伍組效應強于黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用組。析因設計實驗分析表明，以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50劑量進行1 ∶1配伍時，對細胞存活、LDH漏出及自噬體形成均存在交互作用。結論 在缺糖缺氧2h再復糖復氧24 h，細胞出現過度自噬和細胞損傷，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以IC50劑量進行1 ∶1配伍時，對細胞自噬性損傷具有協同抑制作用。

黃芪甲苷；人參皂苷Rg1；配伍；PC12細胞；細胞自噬；Isobologram分析；相互作用

細胞自噬(autophagy)是細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器更新的過程[1]。自噬既可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器、代謝產物，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞，同時它作為一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡[2-3]。已有研究表明，在神經細胞氧糖剝奪后再復糖復氧模擬的腦缺血/再灌注模型中，缺糖缺氧可誘發自噬[4-5]。近期研究也表明，PC12細胞在缺糖缺氧2 h/復糖復氧不同時間均可出現不同程度的損傷，在復糖復氧6～12 h，自噬可減輕神經細胞的損傷，而在復糖復氧24～36 h后，過度的自噬可加重神經細胞損傷，提示過度自噬是腦缺血/再灌注損傷的重要原因。

前期研究表明，中藥黃芪的有效成分和三七的有效成分具有抗缺血性腦損傷的作用，二者聯合應用可增強其抗缺血性腦損傷的作用，進一步的研究表明，其作用可能來自于其主要有效成分黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的相互作用[6]。但其對腦缺血/再灌注后神經細胞自噬性損傷有何影響還不清楚，二者配伍具有怎樣的相互作用也未闡明。因此，本研究采用PC12細胞氧糖剝奪后再復糖復氧誘導的細胞自噬性損傷模型，研究了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對細胞自噬性損傷的影響及其相互作用，為其臨床合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胰蛋白酶(中國Solarbio，批號：T1350-100)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone，批號：NZM1290)；無糖Earle′s(中國Biotopped，批號：Top0063)；胎牛血清(美國Hyclone，批號：NWK0489)；神經生長因子(nerve growth factor, NGF)(美國Sigma，批號：N2513)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國MP Biomedicals，批號：196055)；噻唑藍[(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT](中國Solarbio公司，批號：M8181)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(中國南京建成生物有限公司，批號：20140327)；兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3, LC3)一抗(日本MBL，批號：PM036)；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(fluorescein four methyl isocyanate Luo Danming, TRITC)標記羊抗兔二抗(中國Boster，批號：BA1090)；兔抗大鼠sequesto-some-1(SQSTM1/p62)一抗(美國Proteintech，批號18420-1-AP)；小鼠抗大鼠β-actin一抗(美國Proteintech，批號60008-1-lg)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(美國Proteintech，批號SA00001-1、SA00001-2)；ECL化學發光劑(Tamper Evident seal，批號203-14401)；曲拉通X-100(上海國藥集團，批號：T20100705)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(美國Sigma，批號：A1933-100G)；Hoechst 33258(中國Solarbio，批號：COO20-10)；鏈霉素青霉素(10 kU·mL-1青霉素、10 g·L-1鏈霉素)混合溶液、0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)購自美國Gibco公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenin, 3-MA)(美國Selleck，批號S2767)，自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)(美國Gene Operation，批號53123-88-9)。

1.1.2 細胞株 PC12細胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，高分化，永生性，在美國模式培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)中的編號CRL-1721，購自武漢大學中國典型培養物保存中心。

1.1.3 受試藥物 黃芪甲苷(批號：A0070)、人參皂苷Rg1(批號：A0237)，購自中國成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。黃芪甲苷以含0.1% DMSO-PBS溶解，人參皂苷Rg1以PBS溶解。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞的培養及氧糖剝奪后再復氧復糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)自噬性損傷模型的建立 根據以往的研究，PC12細胞在缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h，細胞產生自噬性損傷，且損傷程度達高峰。因此，在本研究中，采用缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h制作細胞自噬性損傷模型。細胞以DMEM高糖培養基(含葡萄糖4.5 g·L-1、10%胎牛血清和1%青鏈霉素)于37℃、20% O2、75% N2、5% CO2及飽和濕度下培養，2 d換液1次，待細胞生長融合后傳代培養。細胞以1×107·L-1接種于12孔或96孔培養板中，培養24 h，待細胞貼壁后再加終濃度50 μg·L-1的NGF誘導分化48 h后[7]，棄原培養液，加入無血清培養基培養24 h，使細胞同步化于G0期。然后進行如下處理：細胞加無糖Earle′s培養液，置于三氣培養箱中(5% CO2、1% O2、94% N2)模擬缺糖缺氧培養2 h后，換成DMEM高糖培養液常規培養進行復糖復氧24 h，造成OGD/R模型。

假設入侵者依次攻擊單條入侵路徑上的n個脆弱性的過程中，相鄰兩次攻擊之間無時間間隔，且完成對任意一個脆弱性攻擊所需要的時間周期均為τ，則突破單條路徑上的n個脆弱性所需的總時間周期為nτ.將入侵者在T內通過具有n個脆弱性的單條入侵路徑實施入侵的次數記為k，則

1.2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1抗自噬性損傷的相互作用

1.2.2.1 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用對細胞自噬的抑制作用 細胞接種于24孔板中，制作細胞爬片。實驗分為正常對照組、OGD/R模型組和藥物干預組。細胞常規培養后進行如下處理：正常對照組換DMEM高糖培養液同上常規培養。模型組同前造模。藥物組于缺糖缺氧前30 min加入黃芪甲苷0、9.81、19.63、39.25、78.5 mg·L-1，人參皂苷Rg1 0、10、20、40、80 mg·L-1[8]。復糖復氧24 h后吸去上清，PBS洗滌后加4%多聚甲醛固定，以PBS洗3次，加0.5%曲拉通后，PBS洗3次，再以1%牛血清白蛋白封閉液封閉，加兔抗大鼠LC3一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜，PBS洗3次，加TRITC標記的羊抗兔熒光二抗(1 ∶100)室溫孵育，PBS洗3次后，加Hoechst 33258(1 ∶200)，PBS洗滌后，甘油封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察斑片狀熒光體。斑片狀熒光體為LC3-Ⅱ，斑片的數量可作為自噬體的相對定量，也可在一定程度上反映細胞自噬活性。然后，隨機選取5個不同的視野，用Image Pro-Plug6.0圖像分析軟件測定細胞面積及斑片狀熒光體個數，計算單位面積的斑片狀熒光體個數，以(模型組自噬體數量-藥物組自噬體數量)/模型組自噬體數量×100%計算藥物對自噬的抑制率。以藥物濃度為自變量，抑制率為因變量進行曲線回歸分析(即以藥物濃度的自然對數為自變量，抑制率為因變量)，并計算藥物的半數抑制濃度(median inhibitory concentration, IC50)和95%可信區間。

1.2.2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1不同比例配伍對自噬的抑制作用 以上述黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單獨作用的IC50為1個劑量單位，選擇黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 3個不同比例的劑量單位(2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2)進行相互作用實驗。同上進行自噬抑制實驗，測定兩藥配伍后的自噬抑制率，計算黃芪甲苷和人參皂苷Rg1不同劑量單位配伍的IC50及其95%可信區間。

1.2.2.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗自噬性損傷的相互作用分析 Isobologram[9-10]分析法可用于判斷藥物的相互作用性質。在Isobolograph圖中，橫軸為一個藥物單用的IC50(或ED50)和標準差，縱軸為另一個藥物單用的IC50(或ED50)和標準差。將兩個藥物的IC50(或ED50)均值用直線連接后即為相加線。如果兩藥合用后測得的IC50(或ED50)落在相加線上則相互作用為相加，落在左下方則為協同，落在右上方則為拮抗。按Isobologram分析法分析黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以不同比例配伍后的相互作用。該方法常結合95%可信區間進行分析，分析兩個藥物配伍時IC50的95%可信區間與其分別單用時IC50的95%可信區間是否互相重疊，若無重疊，則差異存在顯著性，否則無顯著性差異。此外，相互作用指數γ也可判斷相互作用的性質，若γ<1則相互作用為協同，γ>1則相互作用為拮抗，γ=1則相互作用為相加。

式中，IC50總A與IC50總B分別為配伍時A、B兩藥的IC50，IC50A與IC50B分別為A、B兩藥單獨作用時的IC50值。

1.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細胞OGD/R后自噬性損傷的驗證 由于自噬在腦缺血后發揮了雙刃劍的作用[11-12]，抑制自噬不一定就表明對抗了OGD/R后細胞的損傷。因此，為了了解黃芪甲苷與人參皂苷Rg1協同作用配伍下對OGD/R后細胞損傷是否具有抑制作用，對兩藥具有抗OGD/R后細胞自噬協同作用的劑量單位為1 ∶1配伍時是否具有協同抗細胞損傷的作用進行了進一步驗證。根據“1.2.2.2”實驗，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 劑量單位為1 ∶1配伍時IC50的劑量分別為：黃芪甲苷IC503.45 mg·L-1，人參皂苷Rg1 IC501.71 mg·L-1。將兩藥的IC50劑量作為1個劑量單位進行1 ∶1配伍，將細胞分為正常對照組、OGD/R模型組、3-MA(25 mmol·L-1)組、雷帕霉素(200 nmol·L-1)組、黃芪甲苷(3.45 mg·L-1)單用組、人參皂苷Rg1(1.71 mg·L-1)單用組、配伍(3.45 mg·L-1黃芪甲苷+1.71 mg·L-1人參皂苷Rg1)組及不同藥物+3-MA或雷帕霉素組。實驗方法同前。處理結束后進行以下檢測：

自噬體的電鏡檢測：吸去上清，細胞以PBS洗滌后，加入2.5%戊二醛固定液固定過夜，再1%鋨酸后固定2 h，依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色后，以透射電子顯微鏡(美國FEI，型號Tecnai G2 spirit)觀察細胞自噬體形態，檢測細胞單位面積(μm2)自噬體的數量。每個樣本隨機選取5個不同的視野進行計數，計算自噬體數量的平均值。

細胞活力測定(MTT法)：分別取上述各組細胞，加入20 μL的MTT(5 g·L-1)繼續培養4 h后，棄上清，加200 μL DMSO，震蕩10 min，于490 nm處檢測光密度值(OD)。OD值越大，則細胞存活越多。

細胞LC3Ⅱ定位及相對定量檢測：同前用激光共聚焦顯微鏡測定單位面積的LC3Ⅱ陽性斑片熒光體數量(10-1個/μm2)。

細胞p62蛋白定量檢測：以Western blot法測定。細胞培養及處理同前，吸去上清，PBS洗滌，刮下細胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清，加入100 μL的蛋白裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑，冰上充分混勻后靜置20 min后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定總蛋白含量。取30 μg蛋白100℃水浴10 min變性后，120 V恒壓電泳70 min，200 mA轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與兔抗大鼠p62一抗(1 ∶500)和小鼠抗大鼠β-actin一抗(1 ∶1 000)溶液混合，4℃靜置過夜，TBS洗3次后，TBST洗1次；然后分別加羊抗兔二抗(1 ∶2 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000)，37℃孵育1 h，TBS洗3次后，TBST洗1次，暗室下加ECL化學發光劑顯影。Image Pro-Plug6.0圖像分析軟件測定目的條帶的累積光密度值(IOD)，以目的條帶的IOD與β-actin條帶的IOD的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對OGD/R細胞自噬的抑制作用 不同濃度的黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用對OGD/R后細胞自噬具有抑制作用，且呈劑量效應關系，見Fig 1。根據各藥物對自噬的抑制率計算其IC50及95%可信區間，見Tab 1。

Fig 1 Inhibition of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 alone of different concentrations

**P<0.01vsmodel

Tab 1 IC50and 95% confidence interval of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 alone restraining PC12 cell autophagy(n=3)

2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抑制OGD/R后細胞自噬的相互作用分析 以黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用的IC50為1個劑量單位(分別為27.22、13.68 mg·L-1)，分別設定黃芪甲苷、人參皂苷Rg1 3個不同劑量單位(2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2)配伍，測定不同配伍對自噬的抑制率，并計算配伍時各藥的IC50和95%可信區間，見Tab 2、3。

Tab 2 Inhibitory effects of different ratio combinations of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 on autophagy following OGD/R(n=3)

**P<0.01vsmodel

Tab 3 IC50and 95% confidence interval of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 combinations restraining PC12 cell autophagy(n=3)

采用Isobologram分析法分析兩藥配伍后相互作用的性質。根據藥物單獨作用時的IC50值及95%可信區間繪制Isobologram曲線。將黃芪甲苷的IC50及95%可信區間繪制在X軸上，人參皂苷Rg1的IC50及95%可信區間繪制在Y軸上，將兩IC50值相連后構成相加線，并作出相加線的95%可信區間(Fig 2)。由Fig 2可知，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時的IC50落在相加線的左下方，且兩個藥物配伍時IC50的95%可信區間與其分別單用時IC50的95%可信區間無重疊，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時具有協同抗細胞自噬的相互作用，各自的IC50劑量分別為黃芪甲苷(3.45±0.573)mg·L-1、人參皂苷Rg1(1.71±0.284)mg·L-1。而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為2 ∶1和1 ∶2配伍時IC50及95%可信區間均落在相加線的右上方，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以2 ∶1及1 ∶2配伍時對細胞自噬的作用呈現拮抗的相互作用。

Fig 2 Isobologram analysis of different ratio combinations of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1

( )represents the lower limit and upper limit of 95% confidence interval of each drug IC50

不同比例配伍的相互作用指數γ見Tab 4。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為2 ∶1和1 ∶2配伍時γ值均大于1，而1 ∶1配伍時則小于1。提示黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時具有協同抗細胞自噬的相互作用，與Isobologram的分析結果一致。

Tab 4 Interaction index of different ratio combinations between Astragaloside IV and Ginsenoside Rg1(γ)

2.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1劑量單位為1 ∶1配伍下對OGD/R后細胞存活和LDH漏出的影響 見Tab 5,細胞活性實驗(MTT法)結果表明，與正常組比較，模型組細胞存活減少、LDH漏出率增加(P<0.01)。與模型組比較，3-MA組細胞存活均增加、LDH漏出率減少(P<0.01)，雷帕霉素組則作用相反(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組及配伍組細胞存活增加、LDH漏出率減少(P<0.01)，且配伍組細胞存活的增加和LDH漏出率的減少高于黃芪甲苷單用和人參皂苷Rg1單用(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷+3-MA、人參皂苷Rg1+3-MA和配伍+3-MA組細胞存活進一步增加、LDH漏出率進一步降低(P<0.01)，且黃芪甲苷+3-MA、人參皂苷Rg1+3-MA和配伍+3-MA組增加細胞存活、降低LDH漏出率的效應分別強于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1和配伍組(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷+雷帕霉素、人參皂苷Rg1+雷帕霉素和配伍+雷帕霉素組細胞存活增加、LDH漏出率降低(P<0.01)，但黃芪甲苷+雷帕霉素、人參皂苷Rg1+雷帕霉素和配伍+雷帕霉素組增加細胞存活、減少LDH漏出率的效應低于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1及配伍組(P<0.01)。

GroupMTT/ODLDHleakagerate/%Normal0．683±0．03414．370±2．553Model0．218±0．023▲▲58．790±3．258▲▲AstragalosideⅣ0．530±0．022△△★★28．950±1．779△△★★GinsenosideRg10．506±0．021△△★★30．670±2．517△△★★Combination0．628±0．023△△23．120±3．101△△AstragalosideⅣ+3?MA0．668±0．027△△☆☆●●17．490±2．367△△☆☆●GinsenosideRg1+3?MA0．664±0．027△△##●●17．670±2．517△△##●Combination+3?MA0．703±0．024△△★★●●13．270±1．804△△★★●●AstragalosideⅣ+Rapamycin0．348±0．025△△☆☆〇〇36．960±2．669△△☆☆〇〇GinsenosideRg1+Rapamycin0．342±0．025△△##〇〇37．000±2．000△△##〇〇Combination+Rapamycin0．420±0．026△△★★〇〇32．670±2．517△△★★〇〇3?MA0．620±0．029△△22．570±2．629△△Rapamycin0．178±0．023△△65．110±2．437△△

▲▲P<0.01vsnormal;△△P<0.01vsmodel;☆☆P<0.01vsAstragaloside Ⅳ;##P<0.01vsGinsenoside Rg1;★★P<0.01vscombination;●P<0.05,●●P<0.01vs3-MA;〇〇P<0.01 Rapamycin

2.4 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1劑量單位為1 ∶1配伍下對OGD/R后細胞自噬的影響 電鏡顯示(Fig 3、Tab 6)：正常對照組未見明顯自噬體形成。OGD/R后，細胞內可見大量自噬體形成，大部分呈完整的雙膜或單膜結構，少部分被溶酶體溶解。與正常對照組比較，模型組自噬體數量增加(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組自噬體數目增加(P<0.01)，3-MA組自噬體數量減少(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組自噬體數量均減少(P<0.01)，且配伍組低于黃芪甲苷單用和人參皂苷Rg1單用組(P<0.05或P<0.01)。析因設計實驗的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后抑制自噬體形成的交互作用差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Ultrastructure of autophagosome in PC12 cells of each group(×15 000,bar=2 μm)

A:Normal;B:Model;C:Astragaloside Ⅳ;D:Ginsenoside Rg1;E:Combination;F:3-MA;G:Rapamycin. Arrows indicate autophagosome

Fig 4 Localization detection of LC3 Ⅱ(×600,bar=20 μm)

A:Normal;B:Nodel;C:Astragaloside Ⅳ;D:Ginsenoside Rg1;E:Combination;F:3-MA;G:Rapamycin.Arrows indicate LC3 Ⅱ positive puncta

Tab 6 Comparisons of the numbers of autophagosome and LC3 Ⅱ positive puncta as well as expression of p62 protein among each±s,n=3)

▲▲P<0.01vsnormal;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel;★P<0.05,★★P<0.01vscombination

激光共聚焦結果顯示(Fig 4、Tab 6)：正常對照組細胞胞質內可見均勻分布的紅色熒光點，無斑片狀熒光體形成。OGD/R后，胞質內可見斑片狀熒光體聚集。與正常組比較，模型組細胞內LC3Ⅱ陽性斑片狀熒光體數目增多(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組斑片狀熒光體數目增加(P<0.01)，3-MA組斑片狀熒光體數目均減少(P<0.01)；黃芪甲苷單用組、人參皂苷Rg1單用組、配伍組斑片狀熒光體數目均減少(P<0.01)，且配伍組斑片狀熒光體數目低于黃芪甲苷和人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)。析因設計實驗的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后降低斑片狀熒光體數目的交互作用具有顯著性意義(P<0.01)。

p62蛋白檢測表明(Fig 5、Tab 6)：OGD/R后，p62蛋白表達下降(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組p62蛋白表達降低(P<0.05)，3-MA組p62蛋白表達增加(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組p62蛋白表達增加(P<0.01)，且配伍的效應大于各藥物單用(P<0.05)。析因設計實驗的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后增加p62蛋白表達的交互作用具有顯著性意義(P<0.01)。

Fig 5 Western blot pattern of p62 protein expression among each group

1:Normal;2:Model;3:Astragaloside Ⅳ;4:Ginsenoside Rg1;5:combination;6:3-MA;7:Rapamycin

3 討論

中醫學常將具有不同功效的中藥進行配伍，使不同藥物成分作用于不同的靶點，從而對疾病發揮綜合治療的作用。因此，中藥配伍主要是通過藥物的相互作用而實現的，這種相互作用常表現為協同、相加和拮抗3種形式。Isobologram分析法[9-10]是國際上常用于判斷藥物相互作用性質的一種方法，常被稱為評價藥物相互作用的黃金標準。在運用Isobologram分析法評價藥物相互作用的性質時，常結合其95%可信區間和相互作用指數γ，來進一步判斷藥物相互作用的性質，這些方法相互佐證，可以更加客觀地評價藥物的相互作用。因此，本研究采用Isobologram分析法并結合相互作用指數，研究黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的相互作用。

本實驗根據前期實驗結果，在建立PC12細胞OGD/R后細胞自噬性損傷模型的基礎上，利用激光共聚焦顯微鏡檢測自噬標志物LC3，以判斷藥物對自噬的影響。細胞內存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C 端即被Atg4 蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內膜和外膜，并始終穩定地保留在自噬體膜上參與自噬體的形成直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標記物[1,14]。正常情況下LC3蛋白主要以LC3-Ⅰ形式散在分布于胞質中，激光共聚焦顯微鏡檢測LC3蛋白可見胞質中出現彌散狀熒光。若細胞出現自噬則表現為LC3-Ⅱ的形成和在胞質的聚集，激光共聚焦顯微鏡檢測LC3蛋白可見胞質中出現斑片狀熒光體，這種斑片狀熒光體的多少可在一定程度上反映自噬體的數量或自噬的強度[15-16]。

本研究結果表明，在缺糖缺氧2 h復糖復氧24 h，細胞內出現LC3-Ⅱ形成及胞質中含量增加，自噬體形成增加，且細胞存活減少、LDH漏出率增加。給予自噬抑制劑3-MA干預后，可使細胞存活增加、LDH漏出減少，減輕了OGD/R引起的細胞損傷；而自噬誘導劑則使細胞存活進一步減少、LDH漏出率增加，細胞損傷加重。表明OGD/R后，細胞出現過度自噬，參與了OGD/R誘導的細胞損傷，細胞損傷可能與細胞自噬被過度激活有關。黃芪甲苷和人參皂苷Rg1對OGD/R誘導的細胞自噬具有抑制作用，且作用呈量效關系。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在劑量單位為1 ∶1配伍時呈現協同增效作用，其協同作用的IC50分別是黃芪甲苷(3.45±0.573)mg·L-1、人參皂苷Rg1(1.71±0.284)mg·L-1。而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在劑量單位為1 ∶2和2 ∶1配伍時，則呈拮抗作用。因此，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1合理的配伍對抗神經細胞缺血性損傷是有益的。

為進一步驗證黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍抗OGD/R后細胞自噬的協同作用，研究了兩藥在IC50劑量配伍下對細胞損傷、自噬體數量和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、p62表達的影響。p62可與LC3-Ⅱ結合，參與了自噬形成過程的選擇性自噬，從而靶向自噬體并促進泛素化蛋白的清除和自身的特異性降解，其蛋白水平與自噬活性在一定范圍內呈負相關[17]，與LC3-Ⅱ共同用于自噬活性的判斷。研究發現，因LC3缺陷引起的自噬途徑阻滯，p62及其連接的泛素化蛋白會出現明顯的堆積[18]。

本研究結果表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1可抑制OGD/R后細胞活性的降低和LDH漏出。析因設計實驗分析表明，二者在IC50劑量下配伍時具有協同增效作用。自噬激動劑雷帕霉素可部分抵消藥物抗細胞損傷的作用，而自噬抑制劑3-MA與藥物合用可進一步減輕細胞的損傷。提示黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時對細胞損傷具有協同抑制作用，其作用與抑制OGD/R誘導的細胞自噬性損傷有關。自噬體數目和p62蛋白表達結果也表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1可抑制OGD/R后細胞自噬體形成，增加p62蛋白表達。析因設計實驗分析也表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時對OGD/R誘導的細胞自噬具有協同抑制作用。這也進一步驗證了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時抗細胞損傷與其協同抑制細胞自噬有關。

綜上所述，在缺糖缺氧2 h時再復糖復氧24 h，細胞出現過度自噬和細胞損傷，提示過度自噬參與了細胞損傷。黃芪甲苷和人參皂苷Rg1 在IC50劑量配伍時，對細胞過度自噬和細胞損傷具有抑制作用。相互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時對細胞自噬的抑制呈協同作用。這表明在臨床應用黃芪和三七或其有效成分防治缺血性腦血管病時，合理的配伍將起到協同增效作用。

[1] Xu F, Gu J H, Qin Z H. Neuronal autophagy in cerebral ischemia[J].NeurosciBull, 2012, 28(5): 658-66.

[2] Qin H D, Tan W G, Zhang Z, et al. 15d-prostaglandin J2 protects cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury:involvement of inhibiting autophagy through upregulation of Bcl-2[J].CellMolNeurobiol, 2015, 35(3): 303-12.

[3] Roy S, Debnath J. Autophagy and tumorigenesis[J].SeminImmunopathol, 2010, 32(4): 383-96.

[4] Kuma A, Hatano M, Matsui M, et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period[J].Nature,2004,432(7020):1032-6.

[5] Zhu C, Wang X, Xu F, et al. The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J].CellDeathDiffer, 2005, 12(2): 162-76.

[6] 黃小平, 鄧常清, 邱詠園, 等. 黃芪甲苷和三七的三種有效成分配伍對小鼠腦缺血再灌注后氧化應激和Nrf2/HO-1 途徑的影響[J].中國藥理學通報,2013,29(11):1596-601.

[6] Huang X P, Deng C Q, Qiu Y Y, et al. Effects of the combinations between AstragalosideⅣ and three active components in notoginseng on oxidative stress and Nrf2/HO-1 pathway after cerebral ischemic reperfusion in mice[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11):1596-601.

[7] Li H, Pinto A R, Duan W, et al. Telomerase down-regulation does not mediate PC12 pheochromocytoma cell differentiation induced by NGF, but requires MAP kinase signaling[J].JNeurochem, 2005, 95(3): 891-901.

[8] 劉曉丹, 鄧常清. 黃芪甲苷和三七總皂苷中主要有效成分抗PC12細胞氧化損傷的配伍研究[J]. 湖南中醫藥大學學報,2012,32(1): 8-12.

[8] Liu X D, Deng C Q. Compatibility study of main effective components in PNS and AST on oxidative damage of PCI2[J].JTCMUnivHunan,2012, 32(1): 8-12.

[9] Tallarida R J. An overview of drug combination analysis with isobolograms[J].JPharmacolExpTher, 2006, 319(1): 1-7.

[10]Won H K, Hyun J A, Jie A K. Interactions of propofol and remifentanil on bispectral index under 66% N2O:analysis by dose-effect curve,isobologram, and combination index[J].KoreanJAnesthesiol, 2010, 59(6): 371-6.

[11]Wei K, Wang P, Miao C Y. A double-edged sword with therapeutic potential: an updated role of autophagy in ischemic cerebral injury[J].CNSNeurosciTher, 2012, 18(11): 879-86.

[12]丁 煌, 唐映紅, 黃小平. 自噬在腦缺血性損傷中的作用[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(8): 1048-52.

[12]Ding H, Tang Y H, Huang X P. Effects of authophagy in cerebral ischemic injury[J].ChinPharmacolBull,2015,31(8): 1048-52.

[13]Sheng R, Liu X Q, Zhang L S, et al. Autophagy regulates endoplasmic reticulum stress in ischemic preconditioning[J].Autophagy, 2012, 8(3):310-25.

[14]Barth S, Glick D, Macleod K F. Autophagy: assays and artifacts[J].JPathol, 2010, 221(2): 117-24.

[15]Tanida I, Ueno T, Kominami E. LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J].IntJBiochemCellBiol,2004,36(12): 2503-18.

[16]Kimura S, Fujita N, Noda T, et al. Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3[J].MethodsEnzymol, 2009, 452: 1-12.

[17]Xiong J, Xia M, Xu M. Autophagy maturation associated with CD38-mediated regulation of lysosome function in mouse glomerular podocytes[J].JCellMolMed,2013,17(12): 1598-607.

[18]Maruyama Y, Sou Y S, Kageyama S. LC3B is indispensable for selective autophagy of p62 but not basal auphagy[J].BiochemBiophysResCommun, 2014, 446(1): 309-15.

Interaction of Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 against autophagy injury of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation

DING Huang, LI Jing-xian, TANG Biao, LIU Xiao-dan, LI Ling, TANG Ying-hong, DENG Chang-qing,HUANG Xiao-ping

(MolecularPathologyLaboratory,KeyLaboratoryofHunanProvinceforPreventionandTreatmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonCardio-CerebralDiseases,KeyLaboratoryofHunanUniversitiesforCellBiologyandMolecularTechniques,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,Hunan)

Aim To probe the effect and the interaction of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 on autophagy injury of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R).Methods Autophagy injury model of PC12 cells induced by OGD/R was established, Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 were divided into different dosages to interfere PC12 cells, the autophagosome was detected to assess the effect of drugs on autophagy injury with confocal microsopy, and median inhibitory concentration(IC50) of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 was calculated. Taking IC50of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 as 1 unit, the combinations of different ratios of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1(1 ∶2, 1 ∶1, 2 ∶1) were set up according to Isobologram method, the effect of the drugs against cells autophagy injury was determined and IC50of different ratio combinations was acquired, then the nature of interaction was analysed that Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 inhibited autophagy through Isobologram analysis, 95% confidence and interaction index γ. On this basis, using the combination of IC50that Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 exerting synergy effect to assess the effect on cell injury and autophagy via cell survival rate, lactate dehydrogenase(LDH) leakage rate, the number of autophagosome and the expressionof p62 protein. Results IC50and 95% confidence that Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 inhibited autophagy was (27.22±0.614) mg·L-1[25.96, 29.03], (13.68±1.334) mg·L-1[10.27,16.95], respectively. Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 obtained a synergitic effect under 1 ∶1 ratio while presented the antagonism under 1 ∶2 or 2 ∶1. The verification results showed that Astragaloside Ⅳ, Ginsenoside Rg1 and the combination could enhance cell survival rate, relieve LDH leakage, reduce the numbers of autophagosome and LC3-Ⅱ, and increase the expression of p62; the effects of the combination were better than those of drugs alone. Furthermore, factorial analysis manifested that Astragalus IC50combined Ginsenoside Rg1 IC50with 1 ∶1 ratio presented the interactions on cell survival, LDH leakage and autophagosome formation.Conclusions After OGD 2 h followed by reoxygenation 24 h, PC12 cells suffer excessive autophagy and damage, which are prevented by Astragaloside Ⅳ combined Ginsenoside Rg1 with 1 ∶1 ratio. Moreover, the combination plays the synergitic inhibition on autophagy injury.

Astragaloside Ⅳ; Ginsenoside Rg1; combination; PC12 cells; autophagy; Isobologram analysis; interaction

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.036.html

2016-10-04,

2016-11-08

國家自然科學基金資助項目(No 81573875，81503385)；湖南省高校創新平臺開放基金資助項目(No 14K068)；湖南省科技廳資助項目(No 2014SK3001)；湖南省研究生科研創新項目(No CX2016B372)；湖南省教育廳資助項目(No 14C0844)；湖南省中醫藥管理局重點項目(No 201301，201508)；中醫內科重大疾病防治及成果轉化省部共建教育部重點實驗室開放課題(No ZYNK201405)；“中西醫結合防治心腦血管疾病的相關基礎研究”湖南省高校科技創新團隊；“中醫藥防治心腦血管疾病基礎研究”湖南省自然科學創新群體基金

丁 煌(1990-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管疾病的防治，E-mail: 287351273@qq.com； 鄧常清(1963-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心腦血管疾病的防治，通訊作者，E-mail: dchangq@sohu.com； 黃小平(1974-)，女，碩士，副教授，碩士生導師，研究方向：心腦血管疾病的防治，通訊作者，E-mail: jialeliu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.018

A

1001-1978(2017)02-0235-09

R284.1；R289.1；R329.24；R845.22