人寡肽轉運體1轉染MDCK細胞與轉染HeLa細胞的比較研究

羅 敏，傅曉鐘,肖 濤，張文政，李 靜，陳 雅，劉 亭

(貴州醫科大學 1.藥學院、2.貴州省藥物制劑重點實驗室、3.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004;4.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004)

◇實驗方法學◇

人寡肽轉運體1轉染MDCK細胞與轉染HeLa細胞的比較研究

羅 敏1,3,4，傅曉鐘1,3,肖 濤1,3，張文政1,3，李 靜1,3，陳 雅1,3,4，劉 亭1,2

(貴州醫科大學 1.藥學院、2.貴州省藥物制劑重點實驗室、3.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004;4.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004)

目的 篩選出更適宜的轉染受體細胞，提高構建人寡肽轉運體1(human peptide transporter 1，hPepT1)高表達細胞系的效率。方法 利用LipofectamineTM2000轉染試劑將pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒分別轉染進MDCK細胞與HeLa細胞，并進行單克隆細胞的挑選和擴大培養。通過qRT-PCR與Western blot技術來檢測兩種受體細胞中hPepT1 mRNA與蛋白的表達水平，并利用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對兩種單克隆轉染細胞的hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)攝取能力進行考察。 結果 MDCK細胞與HeLa細胞轉染后，hPepT1 mRNA與蛋白表達水平以及Glysar的攝取能力均明顯高于其野生型細胞(P<0.05)；雖然Glysar在HeLa細胞中的攝取量高于MDCK細胞，但MDCK-hPepT1細胞中hPepT1 mRNA與蛋白表達水平以及Glysar的攝取能力卻高于HeLa-hPepT1細胞。結論 在hPepT1穩定高表達轉染細胞模型的構建中，為提高hPepT1的轉染效率，從而獲得更高效的轉染細胞模型，以MDCK細胞作為轉染的受體細胞可能是更為適宜的選擇。

馬丁-達比犬腎上皮細胞；子宮頸癌細胞；人寡肽轉運蛋白1；穩定轉染；qRT-PCR；Western blot；Glysar攝取

人寡肽轉運體1(human peptide transporter 1，hPepT1)是一種主要表達于哺乳動物小腸上皮刷狀緣膜基頂側[1]的腸肽轉運體，能夠介導二肽、三肽化合物以及擬肽類藥物的轉運吸收[2]，其對藥物在腸道的吸收和分布過程中發揮著重要作用。在很多新藥研發中，利用hPepT1為靶點進行合理藥物設計以改善藥物細胞膜透過性，從而提高藥物的生物利用度成為研究的熱點。此外，hPepT1在一些中藥單體的透腸吸收篩選中也具有重要意義。因此，如何高效快速地構建一個hPepT1穩定高表達的有效體外細胞模型，對以hPepT1為靶點的新藥合成研究以及某些中藥單體的篩選和吸收機制研究提供良好工具具有重要意義。目前，研究hPepT1介導的藥物吸收機制常用的體外細胞模型有hPepT1高表達的轉染細胞模型以及瘦素誘導的 Caco-2 細胞模型。而MDCK細胞與HeLa細胞在hPepT1高表達轉染細胞模型的構建中成為應用最為廣泛的兩種受體細胞。MDCK-hPepT1細胞系與HeLa-hPepT1細胞系被廣泛用于hPepTl底物的研究[3-6]。但是，對于轉染受體細胞的選擇，究竟MDCK細胞與HeLa細胞，哪一種細胞作為hPepT1轉染的受體細胞更為適宜，更有利于hPepT1轉染細胞模型的建立以及應用，未見有相關文獻報導。因此，本實驗分別構建了MDCK-hPepT1穩定轉染細胞系與HeLa-hPepT1穩定轉染細胞系，并對兩種穩定轉染細胞系中hPepT1的表達水平、hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)的攝取能力進行了驗證比較，旨在找到更為適宜的轉染受體細胞，從而提高hPepT1細胞模型的構建效率穩定性，也為今后以hPepT1為靶點的新藥合成研究中藥物的篩選和吸收機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒由京博邁德基因技術有限公司構建；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit(批號0811北4KA1)購于AxyGen公司；TRIzol試劑(批號15596026)、LipofectamineTM2000轉染試劑(批號1657828)購自Invitrogen公司； EastepTM總RNA提取試劑盒(批號7020001018)購于上海普洛麥格生物產品有限公司；TOP10感受態細胞、RIPA裂解液(批號20151020)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號20150413)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號20160118)、ECL超敏發光液(批號20151020)均購于Solarbio公司；PrimeScript RT試劑盒(批號AK5402)購于TaKaRa公司；一抗rabbit IgG(批號L7342)購于Santa Cruz Biotechnology公司；二抗goat anti rabbit IgG(H+L)(批號GR231489-3)購于Abcam公司；β-actin引物上游5′-CCCCTGAATCCCAAAGCC-3′，引物下游5′-GATGTCACGCACGATCTCCC-3′；hPepT1引物上游5′-GCTCTTATCGCCGACTCGTG-3′，引物下游5′-GGGTTTGATTCCTCCAGTCC-3′由Invitrogen公司設計合成；DMEM高糖培養基(批號8114031)、胎牛血清(FBS，批號1227694)、胰蛋白酶(批號J130049)、G418(批號G8160)均購于Gibco公司；LB肉湯購于青島高科園海博生物技術有限公司；肌肽、甘氨酰肌氨酸購于美國Sigma公司，質量分數均大于98%；異煙肼購于中國生物制品檢定所。

CO2細胞培養箱、Heraeus Fresco17冷凍高速離心機、Biomate3S蛋白核酸分析儀購于Thermo Scientific公司；Modle680酶標儀、PowerPac Basic電泳儀、Trans-Blot Turbo蛋白快速轉印儀、CFX96實時熒光定量PCR儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀均購于Bio Rad公司；Acugity-TDQ型超高效液相色譜-串聯質譜購于Waters公司。

1.2 pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒的轉化擴增、提取純化 質粒pcDNA3.1(+)-hPepT1作為表達載體，用TOP10感受態細胞擴增質粒。在無菌環境下，取100 μL TOP10感受態細胞置于1.5 mL無菌離心管中，向感受態細胞懸液中加入5 μL pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒，輕輕混勻后冰浴放置30 min，將離心管置于42 ℃水浴中60～90 s，然后快速轉移到冰浴中放置2～3 min。向離心管中加入500 μL無菌無抗的LB培養基，37 ℃、180 r·min-1震蕩培養1 h，使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。然后取100 μL已轉化的TOP10感受態細胞涂布于含Ampicillin抗生素(100 mg·L-1)LB平板，37 ℃倒置培養12 h后，挑取單克隆菌體接種于含Ampicillin抗生素(100 mg·L-1)的無菌LB液體培養基中，37 ℃、200 r·min-1震蕩培養12 h。參照AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit試劑盒說明書提取純化pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒。

1.3 MDCK細胞與HeLa細胞培養 MDCK細胞(購于ATCC細胞庫)與HeLa細胞(購于中國科學院細胞庫)所用培養液均為含10%胎牛血清，不含抗生素的高糖DMEM，于37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞貼壁生長，生長至80%～90%融合度時，用0.25%胰酶消化傳代培養。

1.4 G418最佳篩選濃度的確定及MDCK細胞轉染 分別將MDCK細胞與HeLa細胞以2×105個每孔種于24孔板，生長24 h后，加入G418濃度分別為400、500、600、700、800、 900 mg·L-1的DMEM培養基進行篩選，以14 d細胞全部死亡的濃度為最佳篩選濃度,最終確定最佳篩選濃度為800 mg·L-1。

分別將MDCK細胞與HeLa細胞以3×105個每孔種于6孔板，待細胞生長至85%左右融合度時，將LipofectamineTM2000轉染試劑與pcDNA3.1(+)-hPepT1質粒按2 ∶1的體積質量比轉染進MDCK細胞與HeLa細胞，轉染48 h后加入含800 mg·L-1G418的完全培養基進行篩選培養，以800 mg·L-1的濃度培養14 d。

1.5 挑選單克隆細胞 將G418篩選14 d的轉染的MDCK細胞與HeLa細胞，用胰酶消化后離心，培養基重懸后計數。采用有限稀釋法，利用96孔板挑選出單克隆細胞并擴大培養。

1.6 qRT-PCR檢測細胞中hPepT1 mRNA的表達 使用TRIzol與EastepTM總RNA提取試劑盒分別提取MDCK-hPepT1單克隆細胞(DH-m細胞)與HeLa-hPepT1(DH-h細胞)單克隆細胞中總RNA，測定RNA濃度后，分別取適量RNA與逆轉錄試劑在37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s條件下逆轉錄合成cDNA。將獲得的cDNA及合成的引物進行qRT-PCR，PCR反應體系如下：

SYBR Premix Ex TaqⅡ 10.0 μL

hPepT1上游引物 0.8 μL

hPepT1下游引物 0.8 μL

cDNA模板 2.0 μL

ddH2O 6.4 μL

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，然后進行40個循環的反應(94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s)，以β-actin作為內參。

1.7 Western blot檢測分析hPepT1的表達 分別對DH-m細胞與DH-h細胞及其野生型細胞中的蛋白進行Western blot檢測分析。收集細胞，用PBS洗滌3次，以適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)吹打混勻，在冰上放置30 min(每隔10 min渦旋1次)，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清(總蛋白)，-80 ℃保存。SDS-PAGE 凝膠電泳用10%分離膠，5%濃縮膠，BCA法測定蛋白濃度，每孔總蛋白上樣量為50 μg，90 V電泳15 min，120 V電泳60 min。PVDF膜在1 A條件下轉膜20 min，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，5% BSA室溫封閉1～2 h，一抗4 ℃孵育過夜(一抗是兔抗人的hPepT1多克隆抗體IgG 1 ∶500 稀釋)，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，二抗[山羊抗兔IgG(H+L)]1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，最后用ECL超敏化學發光試劑A液、B 液按1 ∶1混勻，取適量滴加在PVDF膜上后，利用ChemiDoc XRS+凝膠成像系統進行掃描曝光。

1.8 BCA法測定細胞蛋白濃度 參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，測定細胞裂解中蛋白濃度。測定步驟如下：根據所要測定的樣品數量，取適量的BCA試劑與Cu試劑按50 ∶1的體積比配制成BCA工作液，混勻后室溫放置。工作曲線制備：取適量BSA蛋白標準液，用PBS稀釋液稀釋至濃度為0.5 g·L-1。分別取0、1、2、4、8、12、16、20 μL標準液至96孔板，加PBS稀釋液補足至20 μL。待測樣品的制備：將提取的總蛋白用PBS稀釋液稀釋至初始濃度的0.1，取稀釋后的待測樣品20 μL至96孔板中。待測樣品與標準蛋白液各加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min后，酶標儀測定各孔吸光度值A570，根據標準曲線計算待測樣品蛋白濃度。曲線方程為Y=0.056 3X+0.075 35(R2=0.997 1)。計算樣品中蛋白質量濃度時，取吸光度值在標準曲線范圍的稀釋樣品，曲線方程法計算樣品質量濃度。

1.9 Glysar的攝取研究

1.9.1 Glysar在DH-m、DH-h細胞及野生型細胞中的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞以密度2×105個每孔種于6孔板，生長48 h后，進行攝取實驗：細胞用37 ℃ HBSS (pH 7.4)洗3遍，37 ℃預孵育15 min后除去孵育液，對照組(野生型細胞)和模型組(轉染細胞)分別加入含0.2 mmol·L-1Glysar的HBSS(pH 6.0)2 mL。37 ℃孵育30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，用RIPA裂解后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取100 μL上清液，加入適量的異煙肼溶液(內標)和100 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液用HPLC-MS對Glysar進行含量測定。利用內標法制備標準曲線方程為：Y=2.308 8X+0.031 9 (R2=0.999 4)。用BCA法測定每孔細胞總蛋白濃度，攝取結果用蛋白總量進行校正。

1.9.2 不同濃度Glysar在DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞中的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞以密度2×105個每孔種于6孔板，生長48 h后，進行攝取實驗：細胞用37 ℃ HBSS(pH 7.4)洗3遍，37 ℃預孵育15 min后除去孵育液，將Glysar用HBSS(pH 6.0)配制成濃度為0.2、1.0、5.0 mmol·L-1的溶液，將不同濃度的Glysar分別加入上述細胞，37 ℃孵育30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，按“1.9.1”項下的“樣品處理”依法操作后，用UPLC-MS/MS對Glysar進行含量測定。

1.9.3 Glysar在DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞中不同時間的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞以密度2×105個每孔種于6孔板，生長48 h后，進行攝取實驗：細胞用37 ℃ HBSS (pH 7.4)洗3遍，37 ℃預孵育15 min后除去孵育液，在上述細胞中分別加入含0.2 mmol·L-1Glysar的HBSS (pH 6.0)2 mL，37 ℃分別孵育5、10、15、20、30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，按“1.9.1”項下的“樣品處理”依法操作后，用UPLC-MS/MS對Glysar進行含量測定。

1.10 Glysar的HPLC-MS檢測條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，17 μm)柱，保護柱：Waters Van Guard C18(2.1 mm×50 mm，17 μm)；流動相：A: 0.1%甲酸乙腈(V/V)，B: 0.1%甲酸水(V/V)，全梯度洗脫；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進樣體積：2 μL；質譜采用選擇離子監測(SIR)掃描模式，以電噴霧離子源(ESI)在正離子電離模式下進行測定。離子源溫度120 ℃；錐孔電壓分別為16 V、30 V；碰撞電壓分別為10 V、15 V；監測離子對147.1(Glysar)，137.8(內標異煙肼)。

2 結果

2.1 hPepT1 mRNA在不同細胞中的表達 分別提取DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞中總RNA，經實時熒光定量RT-PCR檢測hPepT1 mRNA的表達。Tab 1顯示，DH-m與DH-h細胞中hPepT1 mRNA的表達量均明顯高于其野生型細胞。對于不同的兩種受體細胞之間，從表中可以看出，雖然MDCK細胞中hPepT1 mRNA的表達量低于HeLa細胞，但是DH-m 細胞中hPepT1 mRNA的表達量明顯高于DH-h細胞。

2.2 hPepT1在不同細胞中的表達 分別提取DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞的總蛋白，通過Western blot技術檢測上述細胞中hPepT1的表達情況(Fig 1)。結果顯示，野生型HeLa細胞中同樣產生了1條相對于DH-h細胞較弱但也很明顯的目的蛋白條帶，而在MDCK細胞中只有幾乎看不見的1條極微弱的條帶。與其野生型細胞比較，DH-h與DH-m細胞均有明顯的目的蛋白條帶。說明兩種受體細胞經轉染后，hPepT1的表達均明顯升高。

CellhPepT1mRNAMDCK(0．02±0．0016)×10-3DH?m1．44±0．12?HeLa(1．97±0．53)×10-2DH?h1．05±0．05#

*P<0.05vsMDCK cells；#P<0.05vsHeLa cells

Fig 1 Expression of hPepT in DH-m, DH-h cells and their wild type cells

2.3 Glysar的攝取研究

2.3.1 Glysar在不同細胞中的攝取 對Glysar在DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞中的攝取情況進行考察。以進入細胞的Glysar濃度與每孔細胞的總蛋白濃度比值表示Glysar的攝取量。結果顯示(Fig 2)，與其野生型細胞相比較，Glysar在DH-m與DH-h細胞中的攝取量明顯增加。Glysar在DH-h細胞中的攝取量低于DH-m細胞，而在HeLa細胞中的攝取量卻高于MDCK細胞，這可能與受體細胞中存在的內源性目的蛋白有關。

2.3.2 不同濃度Glysar在不同細胞中的攝取 不同濃度的Glysar在DH-m、DH-h細胞及其野生型細胞中的攝取結果顯示(Tab 2)，在野生型細胞中，HeLa細胞對Glysar的攝取高于MDCK細胞，且一定程度上也呈濃度依賴性增加，而MDCK細胞對Glysar的攝取變化卻很小。DH-m與DH-h細胞對Glysar的攝取均呈濃度依賴性增加，但DH-m細胞對Glysar的攝取高于DH-h細胞。

2.3.3 Glysar在不同細胞中不同時間的攝取 對DH-m細胞、DH-h細胞及其野生型細胞在不同時間對Glysar的攝取進行考察，結果顯示(Fig 3)，在野生型細胞中，MDCK細胞在不同時間對Glysar的攝取幾乎沒有什么變化，而HeLa細胞對Glysar的攝取不僅高于MDCK細胞，而且對Glysar的攝取在一定攝取時間內有明顯增加趨勢。而隨著時間的增加，DH-m與DH-h細胞對Glysar的攝取量均逐漸增加，但DH-m細胞對Glysar的攝取高于DH-h細胞。

Tab 2 Uptake of various concentrations of Glysar in DH-m cells,DH-h cells and their wild type±s,n=3)

*P<0.05vsMDCK cells；#P<0.05vsHeLa cells

Fig 2 Uptake of Glysar in DH-m cells,DH-h cells

*P<0.05vsMDCK cells;#P<0.05vsHeLa cells

Fig 3 Uptake of Glysar in MDCK cells, DH-m cells,HeLa

3 討論

人腸道寡肽轉運體hPepT1作為一種研究比較深入的跨膜轉運蛋白，被廣泛用于hPepT1底物的篩選和吸收機制的研究。通過將帶有編碼目的蛋白基因的質粒轉染細胞，使目的蛋白在細胞中高表達的轉染細胞系的構建成為研究者的選擇[7]。在前期研究中，作者參考已報道的文獻[8-9]，采用了瘦素誘導hPepT1在Caco-2 細胞中高表達的方法來構建相關細胞模型，但結果并不理想。實驗發現，瘦素誘導的Caco-2細胞不能有效表達hPepT1。且研究表明，Caco-2 細胞中存在的多種轉運通路對特定載體蛋白的研究也存在影響[10-11]。因此，構建hPepT1高表達的轉染細胞系，或許能夠為hPepT1底物的篩選和評價研究提供一個更好、更有效的體外細胞模型。在hPepT1高表達轉染細胞系的構建中，已有多種細胞作為hPepT1轉染的受體細胞被選擇。本實驗針對其中被應用最多的MDCK與HeLa兩種細胞，旨在篩選出轉染效率更高，內在因素影響更小的細胞作為hPepT1轉染的受體細胞，從而提高構建的hPepT1高表達的轉染細胞模型的有效性。

研究表明[12]，雖然mRNA和蛋白水平是一個相偶聯的過程，但是兩者沒有必然的一致的趨勢，因此，mRNA水平升高并不意味著蛋白表達量就一定會提高。而構建hPepT1轉染細胞模型的目的是從蛋白水平對藥物進行評價研究，所以不僅在基因水平要有變化，還要在蛋白水平有變化才有意義。所以本實驗通過qRT-PCR與Western blot析技術聯合應用，分別從基因水平和蛋白水平對轉染后的兩種受體細胞進行檢測比較分析，同時通過攝取實驗對兩種轉染受體細胞中目的蛋白的活性功能進行驗證比較分析。結果表明，在相同處理條件下，MDCK作為受體細胞經轉染后，其mRNA、蛋白表達水平以及蛋白活性功能均優于轉染的HeLa細胞。而從野生型細胞中蛋白表達和對Glysar的攝取結果來看，HeLa細胞有明顯的目的蛋白條帶，其對Glysar的攝取不僅高于MDCK細胞，而且在一定程度上呈增加趨勢，這可能與HeLa細胞中內源性高表達hPepT1有關。研究表明[13]，轉染過程將對內源性目的蛋白的表達產生影響，使得在利用野生型細胞對研究結果進行校正分析的過程中產生較大的偏差。因此，選擇內源性目的蛋白表達少或是不表達的細胞作為轉染的受體細胞，更有利于轉染細胞模型的構建和應用。實驗結果表明，與HeLa細胞相比較，MDCK細胞轉染效率高，內源性目的蛋白表達少甚至不表達，其作為hPepT1轉染的受體細胞將是更好的選擇。

實驗發現，雖然MDCK細胞作為hPepT1轉染的受體細胞優于HeLa細胞，但其不僅需要消化的時間比較長，而且不容易吹散成單個細胞，即使獲得單個細胞，由于吹打時間長，吹打力度較大，細胞受損，獲得的單個細胞很難貼壁生長增殖，這給單克隆細胞的挑選工作帶來了極大的困難。因此，本實驗在多次實驗中摸索出了同1 d間隔8 h連續2 次胰酶消化法，不僅改善了MDCK細胞在胰酶消化時不易分散的問題，而且在消化過程中減少了細胞的吹打時間，降低了吹打力度，在獲得單個細胞的同時也保證了細胞的完整性，從而提高了挑選單克隆細胞的效率。綜上所述，本實驗篩選出了對hPepT1轉染來說更為適宜的受體細胞，在為今后建立hPepT1高表達轉染細胞系提供基礎保障的同時，也為今后建立其他轉染細胞模型的受體細胞的選擇提供參考。

[1] Brandsch M, Knutter I, Bosse-Doenecke E. Pharmaceutical and pharmacological importance of peptide transporters[J].JPharmPharmacol, 2008,60(5): 543-85.

[2] Fei Y J, Sugawara M, Liu J C, et al. cDNA structure, genomic organization, and promoter analysis of the mouse intestinal peptide transporter PEPT1[J].BiochimBiophysActa, 2000, 1492(1):145-54.

[3] Guo X, Meng Q, Liu Q, et al. Construction, identification and application of HeLa cells stably transfected with human PEPT1 and PEPT2[J].Peptides, 2012, 34(2): 395-403.

[4] Huo X K, Liu Q, Wang C Y, et al. Inhibitory effect of valsartan on the intestinal absorption and renal excretion of bestatin in rats[J].JPharmSci, 2014,103(2):719-29.

[5] Herrera-Ruiz D, Faria T N, Bhardwaj R K, et al. A novel hPepTl stably transfected cell line; Establishing a correlation between expression and function[J].MolPharm, 2004,1(2): 136-44.

[6] Omkvist D H, Brodin B, Nielsen C U. Ibuprofen is a non-competitive inhibitor of the peptide transporter hPEPTl (SLC15A1): possible interactions between hPEPTI substrates and Ibuprofen[J].BrJPharmacol, 2010, 161(8): 1793-805.

[7] 吳佳俊, 江宇峰, 伍 超, 等. Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A 3種質粒穩轉HepG2細胞株的建立與功能研究[J].中國藥理學通報， 2016, 32(6):825-31.

[7] Wu J J, Jiang Y F, Wu C, et al. Construction and functional study of three plasmids including Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A stably transfected HepG2 cell lines[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(6): 825-31.

[8] Nduati V, Yan Y, Dalmasso G, et al. Leptin transcriptionally enhances peptide transporter (hPepT1) expression and activity via the cAMP-response element-binding protein and Cdx2 transcription factors [J].JBiolChem, 2007, 282(2): 1359-73.

[9] Yan Z T, Sun J, Chang Y N, et al. Bifunctional peptidomimetic prodrugs of didanosine for improved intestinal permeability and enhanced acidic stability: synthesis, transepithelial transport, chemical stability and pharmacokinetics[J].MolPharm, 2011, 8(2): 319-29.

[10]Balimane P V, Chong S, Patel K, et al. Peptide transporter substrate identification during permeability screening in drug discovery: comparison of transfected MDCK-hPepTl cells to Caco-2 cells[J].ArchPharmRes, 2007, 30(4): 507-18.

[11]Bhardwaj R K, Herrera-Ruiz D, Sinko P, et al. Delineation of human peptide transporter 1 (hPepT1)-mediated uptake and transport of substrates with varying transporter affinities utilizing stably transfected hPepT 1/Madin-Darby canine kidney clones and caco-2 cells[J].JPharmacolExpTher, 2005, 314(3): 1093-100.

[12]Michael B Mathews, Nahum Sonenberg, John W B Hershey. Translational control in biology and medicine[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007.

[13]Kuteykin-Teplyakov K, Luna-Tortós C, Ambroziak K, et al. Differences in the expression of endogenous efflux transporters in versus wildtype cell lines affect P-glycoprotein mediated drug transport[J].BrJPharmacol, 2010, 160(6): 1453-63.

Comparison of hPepT1 transfected MDCK cells to hPepT1 transfected HeLa cells

LUO Min1,3,4,FU Xiao-zhong1,3,XIAO Tao1,3,ZHANG Wen-zheng1,3,LI Jing1,3,CHEN Ya1,3,4,LIU Ting1,2

[1.SchoolofPharmacy, 2.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics, 3.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao’sMedicines,Guiyang550004，China]

Aim To screen a more suitable transfection receptor, and improve the efficiency of constructing cell lines highly expressing human peptide transporters 1 (hPepT1). Methods The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-hPepT1 was transfected into MDCK cells and HeLa cells by LipofectamineTM2000 transfection reagent，respectively. The monoclonal cells were selected and cultured. Expression of hPepT1 mRNA and protein were determined by qRT-PCR and Western blot, respectively. The uptake capacity of Glysar in transfected cells was examined. Results Compared with wild type cells, the expression of hPepT1 and the uptake of Glysar in transfected MDCK cells and HeLa cells significantly increased (P<0.05). Although the uptake of Glysar in HeLa cells was higher than that of MDCK cells, on the contrary, the expression of hPepT1 and the uptake of Glysar in MDCK-hPepT1 cells was higher than that of HeLa-hPepT1 cells. Conclusion MDCK cells may serve as a more suitable transfected receptor for the construction of a cellular model with high expression of hPepT1, which would make the construction of a cell model highly expressing hPepT1 more efficient.

MDCK cells; HeLa cells; human peptide transporter 1; stable transfection; real time fluorescent quantitative RT-PCR; Western blot; Glysar uptake

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.050.html

2016-10-22,

2016-11-20

國家自然科學基金資助項目(No 81260473，81460523 );貴州省優秀青年科技人才培養對象專項基金(2013-45號) ；貴州省社會發展攻關計劃項目(2013-3031號)；貴州省科學技術基金計劃(黔科合基礎[2016]1127)；貴州省高等學校創新團隊靶向藥物研究與開發創新團隊(黔教合人才團隊字[2015]57)

羅 敏(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物化學及藥理學，E-mail: 1532833403@qq.com； 傅曉鐘(1972-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：藥物化學，通訊作者，Tel:0851-6908568，E-mail:xiaozhong_fu@sina.com； 劉 亭(1981-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail: 1586740@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.025

A

1001-1978(2017)02-0280-05

R322.61；R329.24；R341；R394.2；R737.33；R977.6