醋制降低京大戟對正常小鼠胃腸道氧化損傷的初步研究

曹雨誕，張楷承，張 麗，丁安偉

(南京中醫藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023)

醋制降低京大戟對正常小鼠胃腸道氧化損傷的初步研究

曹雨誕，張楷承，張 麗，丁安偉

(南京中醫藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023)

Vinegar processing attenuates gastrointestinal oxidative injury in mice caused by Euphorbia Pekinensis Radix

CAO Yu-dan, ZHANG Kai-cheng, ZHANG Li, DING An-wei

(JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae,JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

京大戟；醋制；小鼠；胃腸道；氧化損傷；減毒

Euphorbia Pekinensis Radix; vinegar processing; mice; gastrointestinal tract; oxidative injury; detoxication

京大戟(Euphorbia Pekinensis Radix)為大戟科(Euphorbiaceace)植物大戟(EuphorbiapekinensisRupr.)的干燥根[1]，性苦、寒，有毒，始載于《神農本草經》，列為下品。近年研究發現京大戟具有雙重生理活性，既具有瀉下、抗腫瘤、抗病毒、抗白血病等藥理活性，同時對皮膚、口腔及胃腸道黏膜有強烈的刺激性，以及細胞毒作用[2-6]，所以中醫臨床多用醋制降低其毒性和刺激性。本課題組前期已證實醋制能降低京大戟的肝毒性[7-8]和腸細胞毒性[9]，而對于京大戟胃腸道整體毒性研究卻鮮有報道。因此，本研究擬從整體動物初步探討醋制降低京大戟胃腸道毒性可能的作用機制，為研究京大戟醋制減毒的作用機制提供一定的依據。

1 儀器與材料

1.1 動物 ICR小鼠70只，♀♂各半，體質量18～22 g，購自浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK(滬)2013-0006。

1.2 藥物與試劑 京大戟各部位提取物提取方法見已發表文章[8]，京大戟、醋京大戟石油醚部位浸膏(得率分別為6.33%和5.26%)，乙酸乙酯部位浸膏(得率為7.53%和6.48%)。臨用前，用0.5%的CMC-Na溶液和食用油(9 ∶1)分別配成所需濃度的藥液。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 TP1020自動脫水機、RM2135型石蠟切片機、DM1000光學顯微鏡(均為德國LEICA公司)，CS-VI型攤片烤片機(湖北孝感宏業醫用儀器有限公司)，Powerwave X340全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司)，AY220電子分析天平(日本島津)，MX-S混勻儀(北京大龍)，JJ-2高速組織勻漿機(江蘇省金壇市友聯儀器研究所)。

2 方法

2.1 動物分組 將70只ICR小鼠置于室溫、通風的清潔級動物室中，自由攝食飲水，適應3 d后，按體質量、性別隨機分為7組，每組10只，即空白對照組，京大戟石油醚-乙酸乙酯部位高、中、低劑量組(簡稱京大戟高、中、低劑量組)，醋京大戟石油醚-乙酸乙酯部位高、中、低劑量組(簡稱醋京大戟高、中、低劑量組)。

2.2 劑量設計 按照人臨床用量的6、4、2倍，并結合本課題組前期預試結果，本實驗京大戟和醋京大戟高、中、低劑量組分別灌胃給予60、40、20 mg·g-1，空白對照組灌胃等體積的0.5% CMC-Na溶液和食用油(9 ∶1)，每日2次，連續灌胃6 d。d 6灌胃1 h后，脫頸椎處死小鼠，取胃、腸組織用4%中性多聚甲醛固定，常規HE染色，光鏡下觀察其組織形態學變化。取胃、腸組織分別制成10%組織勻漿，以3 500 r·min-1離心15 min后，取上清液-20 ℃凍存，待測各指標。

2.3 胃、腸組織氧化損傷指標測定 取1%胃、1%腸勻漿，按考馬斯亮藍蛋白試劑盒方法測定胃、腸組織中蛋白含量。取各組小鼠的2%胃、2%腸勻漿，按SOD試劑盒方法測定胃、腸組織中SOD活性；取10%胃、10%腸勻漿，按MDA、GSH試劑盒方法測定胃、腸組織中MDA含量和GSH含量。

3 結果

3.1 京大戟對胃、腸組織HE染色結果的影響 空白對照組小鼠胃黏膜上皮結構完整，京大戟高劑量組胃黏膜表面上皮細胞壞死破碎，結構完全破壞；空白對照組小腸黏膜結構正常，京大戟高劑量組腸黏膜層組織破裂，黏膜表面覆蓋大量分泌物。京大戟中、低劑量組胃、腸組織變化不明顯。

Tab 1 Effects ofEuphorbiapekinensisbefore and after processing with vinegar on levels of SOD,GSH and MDA in gastric- intestinal±s，n=10)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscrude group

3.2 京大戟對胃、腸組織氧化損傷指標的影響 與空白對照組相比，京大戟各劑量組小鼠胃、腸組織中MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD活力、GSH含量明顯降低(P<0.01)。與京大戟組相比，醋京大戟各劑量組小鼠胃、腸組織中MDA含量明顯降低，SOD活力、GSH含量明顯增高(P<0.01)，提示醋制能降低京大戟對胃、腸組織的氧化損傷。見Tab 1。

4 討論

現代研究發現，京大戟對皮膚、口腔及胃腸道黏膜有強烈的刺激性和致炎、促發致癌等毒性作用，其毒性部位主要集中在石油醚、乙酸乙酯部位，醋制后毒性作用降低[10-11]。京大戟產生毒性的原因主要是其對胃腸道的損傷，其中較常見的是氧自由基損傷。氧自由基所致的細胞損害是很多病理過程中組織損傷所共同的方式，胃腸黏膜在藥物作用等情況下，可產生大量的氧自由基。氧自由基損傷引起的主要變化為MDA含量升高、GSH和SOD含量下降[12]。

本研究結果表明，與空白對照組比較，京大戟各劑量組對小鼠胃腸道具有明顯的氧化損傷作用；與京大戟各劑量組比較，醋京大戟各劑量組能明顯降低對胃腸道的氧化損傷作用。其中SOD變化最大，SOD作為生物體內重要的抗氧化酶，它在生物體內的水平高低意味著自身抗氧化能力高低。在本研究中，空白對照組SOD最高，京大戟各劑量組SOD最低，說明經過京大戟作用后提高了自由基在機體內的積存，使線粒體氧化磷酸化功能損傷加重，而醋制后氧化損傷程度則有所降低。上述結果顯示，京大戟對胃腸道有較強的毒性作用，不僅嚴重制約著臨床的用藥安全，也為新藥創制帶來了困難。醋制后，其胃腸道毒性部位石油醚-乙酸乙酯部位可明顯降低對小鼠胃腸道的氧化損傷，為后續從細胞、分子水平闡述京大戟醋制減毒的作用機制提供了一定的依據。

(致謝：本文實驗在南京中醫藥大學藥學院國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室以及江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心完成，在此致謝。)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S] .北京:中國醫藥科技出版社, 2015版,一部:225.

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People′s Republic of China[S]. Beijing: China Medical Science Press,2015,VolumeⅠ：225.

[2] Kong L Y, Li Y, Wu X L, et al. Cytotoxic diterpenoids fromEuphorbiapekinensis[J].PlantaMed, 2002, 68(3):249-52.

[3] Liang Q L, Dai C C, Jiang J H, et al. A new cytotoxic casbane diterpene fromEuphorbiapekinensis[J].Fitoterapia, 2009, 80: 514-6.

[4] Shao F G, Bu R, Zhang C, et al. Two new casbane diterpenoids from the roots ofEuphorbiapekinensis[J].JAsianNatProdRes, 2011, 13(9), 805-10.

[5] Hou P Y, Zeng Y, Ma B J, et al. A new cytotoxic casbane diterpene fromEuphorbiapekinensis[J].Fitoterapia, 2013, 90:10-3.

[6] Tao W W, Duan J A, Tang Y P, et al. Casbane diterpenoids from the roots ofEuphorbiapekinensis[J].Phytochemistry,2013, 94:249-53.

[7] 陳海鷹，曹雨誕，顏曉靜，等. 醋制降低京大戟對人正常肝細胞L02的毒性及機制研究[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(6):866-70.

[7] Chen H Y, Cao Y D, Yan X J, et al. Study on detoxication and mechanism of vinegar-processedEuphorbiapekinensison normal liver cells L02[J].ChinJChinMatMed, 2013, 38(6):866-70.

[8] 曹雨誕，陳海鷹，張 麗，等. 醋制降低京大戟細胞毒性部位對小鼠肝臟氧化損傷機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(2):295-6.

[8] Cao Y D, Chen H Y, Zhang L, et al. Vinegar processing attenuation the oxidative injury in mice livers caused by cytotoxic fraction of Euphorbia Pekinensis Radix[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2):295-6.

[9] 曹雨誕，顏曉靜，張 麗，等. 醋制降低京大戟對大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6毒性研究[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(5):29-34.

[9] Cao Y D, Yan X J, Zhang L, et al. Study on detoxication of vinegar-processed Euphorbia Pekinensis Radix processed with vinegar on rat small intestinal crypt epithelial cells IEC-6[J].ChinJChinMatMed, 2014, 39(5):29-34.

[10]張樂林，葛秀允，孫立立，等. 醋制對京大戟毒性和藥效的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(19): 276-9.

[10]Zhang L L, Ge X Y, Sun L L, et al. Impact of vinegar processing on toxic and pharmacological actions ofEuphorbiapekinensis[J].ChinJExpTraitMedFor, 2013, 19(19): 276-9.

[11]葛秀允，孫立立，張樂林. 醋制對京大戟刺激性毒性作用的影響[J]. 中國醫院藥學雜志, 2015, 35(5): 380-5.

[11]Ge X Y, Sun L L, Zhang L L. Effects of vinegar processing on irritant toxicity ofEuphorbiapekinensis[J].ChinJHospPharm, 2015, 35(5): 380-5.

[12]楊惠玲. 高級病理生理學[M]. 北京:科學出版社,1998:24.

[12]Yang H L.Advancedpathophysiology[M].Beijing:Science Press, 1998: 24.

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.056.html

2016-11-01,

2016-11-28

國家自然科學基金青年基金項目(No 81503250)；江蘇省中醫藥局科技項目(No LZ13021)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(No ysxk-2014)

曹雨誕(1977-)，女，博士生，講師，研究方向:中藥炮制與質量控制,E-mail：raindc@163.com； 丁安偉(1950-)，男，教授，博士生導師,研究方向：中藥炮制，通訊作者,E-mail:awding105@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.028

A

1001-1978(2017)02-0291-03

R-332;R282.711；R322.44；R322.45；R349.1；R573.02；R574.02