植物中miRNA響應非生物脅迫研究進展

劉玉鳳王 孝陳海銀劉 琨劉 陽齊明芳寧曉峰李天來*

（1沈陽農業(yè)大學園藝學院，設施園藝省部共建教育部重點實驗室，環(huán)渤海灣地區(qū)設施蔬菜優(yōu)質高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110866；2沈陽農業(yè)大學工程學院，遼寧沈陽 110866）

植物中miRNA響應非生物脅迫研究進展

劉玉鳳1王 孝1陳海銀1劉 琨1劉 陽1齊明芳1寧曉峰2李天來1*

（1沈陽農業(yè)大學園藝學院，設施園藝省部共建教育部重點實驗室，環(huán)渤海灣地區(qū)設施蔬菜優(yōu)質高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110866；2沈陽農業(yè)大學工程學院，遼寧沈陽 110866）

MicroRNA（miRNA）是一類長度為20～24 nt的非編碼RNA，在植物遭受非生物脅迫時，通過介導靶基因mRNA發(fā)揮著非常重要的作用。本文就低溫、外源ABA和干旱等非生物脅迫對miRNA的調控機制進行綜述，進一步闡明miRNA響應非生物脅迫的機理。

miRNA；低溫；外源ABA；干旱；綜述

植物非生物脅迫是指對植物施加不利的環(huán)境因子，包括低溫、植物激素脫落酸（ABA）、干旱、高鹽、紫外線輻射等脅迫，對植物的生長、發(fā)育和結實產(chǎn)生嚴重的不良影響，特別是導致重要農作物減產(chǎn)（Wani et al.，2016）。由于非生物脅迫普遍存在于自然界中，且對植物生長、產(chǎn)量和品質產(chǎn)生影響，現(xiàn)已成為生產(chǎn)中亟待解決的問題（Shriram et al.，2016）。

研究發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫下各種轉錄因子能夠激活miRNAs等一些下游基因（Devi et al.，2013）。miRNA作為一種新型的調控基因表達的小分子RNA，在植物生長發(fā)育、抗逆境脅迫（低溫、干旱、鹽脅迫）、維持基因組完整性等生理過程中發(fā)揮著重要作用（Zhang，2015）。本文從miRNA的角度探究植物通過介導ABA信號途徑在非生物脅迫條件下的作用機制，為闡明植物抗逆性機理和提高植物耐脅迫能力提供理論依據(jù)。

1 植物miRNA的發(fā)現(xiàn)、合成與作用機制

1.1miRNA的發(fā)現(xiàn)和合成

Ambros和Reinhart先后從秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7兩種具有調控功能的小分子RNA（Lee et al.，1993；Denli et al.，2004）。 2001年，美國、德國等國家的3個研究小組通過大規(guī)?？寺≡囼灒沂玖松矬w中這些小分子RNA的調控作用，并將其命名為MicroRNA（miRNA）（Lagosquintnana et al.，2003）。

miRNA的核心結構由Ⅱ型聚合酶啟動子、轉錄區(qū)域和終止子構成（Tang，2010）。合成過程如圖1所示（Basel et al.，2012）：首先，在PolⅡ酶作用下，miRNA基因被轉錄成1條長約幾百個堿基的含有莖環(huán)結構的初始轉錄本（pri-miRNA）。隨后，在Dicer-like1（DCL1）酶作用下，此莖環(huán)結構被剪切成含有發(fā)卡結構的較短前體miRNA（premiRNA）；pre-miRNA進一步被剪切釋放出miRNA/ miRNA*雙鏈，然后由HASTY轉運至細胞質中形成成熟的單鏈miRNA。最終，成熟的miRNA進入核糖核蛋白復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）中發(fā)揮作用（Hofmann，2010）。

1.2miRNA的作用機制

圖2 miRNA的作用機制（Reis，2016）

在逆境脅迫下，植物miRNA本身并不具備核酸酶的功能，而是通過多種機制對基因進行轉錄后的表達調控（Li & Zhang，2015）。由圖2所示 （Reis，2016），許多植物miRNA可以與靶基因的轉錄產(chǎn)物完全配對，介導RISC的AGO（ARGO-NAUTE）蛋白識別并切割靶基因的mRNA，然后被核糖核酸外切酶所降解；當miRNA與靶基因不完全配對時，miRNA通過抑制mRNA的翻譯來調控蛋白質的表達（Li & Zhang，2015；Fu et al.，2016）。

2 植物miRNA與非生物脅迫

2.1低溫脅迫

為了更深刻、系統(tǒng)地了解植物響應低溫脅迫的機制，可將miRNAs與響應低溫脅迫的基因網(wǎng)絡相結合（Cao et al.，2014）。植物中miRNA可通過生長素、脫落酸（ABA）等信號途徑來響應低溫脅迫（Cheng et al.，2016）。

根據(jù)靶基因的不同作用方式，將響應低溫脅迫的miRNAs分為3類（Liu et al.，2008）。第一類：其靶基因可以直接響應脅迫和外部刺激，包括 miR160、miR167、miR168、miR393、miR394、miR395。miR160的靶基因是生長素響應因子ARF。在低溫脅迫下，抗miR160降解（mARF）的轉基因種子對ABA過敏（吳濤，2012），而低夜溫野生型（RR）番茄中的miR160表達水平上調（周迎春，2015），表明存在ABA-AUXIN關聯(lián)，共同參與低溫脅迫。前人通過對擬南芥幼苗進行脫水、高鹽、低溫和ABA脅迫處理后構建了小分子RNA文庫，如miR393受到低溫、脫水、高鹽和ABA的正調控比較顯著。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，E3（泛素連接酶）水解其靶蛋白受到抑制，進而使擬南芥miR393表達上調（Sunkar & Zhu，2004）。第二類：其靶基因間接響應脅迫，這些靶基因調控一些在脅迫應答中起作用的蛋白轉錄因子，包括 miR156、miR165、miR169、miR171、miR172、miR319、miR396。王冰等（2013）對小麥進行低溫處理后，采用qRT-PCR對miR156家族成員進行分析，發(fā)現(xiàn)miR156d的表達顯著下調，miR156a的表達表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，說明它們參與低溫脅迫調控網(wǎng)絡；Bernal和Kramer（2012）研究表明，miR156靶基因SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein）含有ABA響應元件，推測其可能通過ABA信號途徑響應低溫脅迫。第三類：可響應多種脅迫，其靶基因是水解酶或氧化還原酶的編碼基因，包括miR397、miR408。Sun等（2015）研究表明，葡萄在低溫脅迫下，miR156、miR397的表達量下調；擬南芥miR397b通過介導靶基因Laccase（漆酶蛋白）控制種子產(chǎn)量和木質素的合成（Wang et al.，2014），過表達該基因，植株耐寒性和耐凍性增強，說明miR397響應冷害脅迫（Dong & Pei，2014）；王麗麗等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，毛竹經(jīng)過GA3和ABA處理后，誘導phe-miR397的表達，降低對干旱、高溫、低溫等脅迫的抑制作用，推測其可能通過ABA信號途徑響應低溫。

植物遭受低溫脅迫后，誘導COR（coldresponse）相關基因表達。包括CBF（C-repeat/ dehydration-responsive element binding factor）、bLHL（basic helix-loop-helix）、miR166的靶基因ZIP（basic leucine zipper）、miR159的靶基因MYC/MYB等都是與抗逆相關的轉錄因子，它們依賴ABA在植物低溫信號轉導過程中起著非常重要的作用（計淑霞 等，2010）。當暴露在低溫脅迫條件下，植物體內的ABA含量有一個短暫的上升，這與抗寒性的啟動有關（Heidarvand & Amiri，2010）。同時也會誘導與低溫響應的基因表達，這些基因的啟動子區(qū)域含有脫落酸響應元件ABREs（ABA response elements）。bZIP類轉錄因子、ABFS（ABRE binding proteins），可以結合到ABRE以激活ABA依賴基因的表達。

2.2外源ABA脅迫

ABA是植物的“脅迫激素”，通常被認為是抑制型植物激素，與植株衰老和器官（葉、蕾、莖）脫落有密切聯(lián)系（Cheng et al.，2016）。種子成熟、萌發(fā)，植株氣孔關閉等生理過程都受ABA調控（Kang，2015）。ABA是保衛(wèi)細胞信號轉導的關鍵信號因子，不僅參與生物脅迫，而且在植物低溫以及干旱、高鹽等非生物脅迫條件下也起重要作用。

前人在研究擬南芥的脫落酸受體時發(fā)現(xiàn)，ABA是由PYR/PYL/RCARs、蛋白磷酸酶2C（PP2Cs）以及SNF1相關蛋白激酶2s（SnRK2s）這3個蛋白家族組成的核心信號產(chǎn)生的（Agawal & Jha，2010）。其中ABA的受體是PYR/PYL/RCARs，PP2Cs為ABA信號通路的負調控者（Hubbard et al.，2010），SnRK2s為ABA下游信號通路的正調控者。當ABA缺失時，PP2Cs的活性增強，SnRK2的活性受抑制，下游信號轉導被阻斷。而當ABA大量合成時，PYR/RCARs與PP2Cs產(chǎn)生互作，蛋白磷酸酶活性被抑制，但SnRK2活性不受影響，SnRK2s會與ABRE相結合，誘導ABA依賴型的相關基因的表達，最終引起一系列的生理生化反應。信號分子ABA是植物逆境脅迫下miRNA的作用靶標之一，miRNA通過表達量的變化調控基因表達，參與依賴ABA調控的氣孔運動。ABA缺失情況下植株長勢較弱，株型矮小且易染病（楊洪強和接玉玲，2001）。

ABRE是依賴于ABA信號傳導的重要順式作用元件，屬于bZIP轉錄因子。Choi等（2000）運用酵母單雜交方法分離了ABRE結合蛋白AREB或ABFs。當植物受到ABA、干旱和高鹽脅迫時，AREB1/ABF2、AREB2/ABF4和ABF3的表達上調（Uno et al.，2000）。研究表明，活化的SnPK2蛋白激酶能夠作用于AREB/ABF類因子的保守結構域，并使其磷酸化（Furihata et al.，2006）。miR166的靶基因屬于bZIP類轉錄因子，參與ABA信號轉錄過程（Ouellet et al.，1998）。

與擬南芥相同，大豆中GmbZIP基因結合在ABRE元件上，結合后傳給下游的識別位點MYBRS/MYCRS（位于rd22啟動子MYB/MYC），而后進行mRNA的轉錄（Phang et al.，2008）。Mei等（2013）研究表明，AtMYB20蛋白可以與AtPP2CA基因啟動子上的MYB識別序列（TAACTG）結合，降低ABI1、ABI2和AtPP2CA基因的表達水平，使ABA信號途徑增強以抵抗鹽脅迫。Reyes和Chua（2007）研究表明，miR159靶向MYB，ABA能夠誘導miR159依賴ABI3并部分依賴ABI5途徑增加自身表達量。Li和Lu（2013）研究發(fā)現(xiàn)，SmMYB80主要在花中表達，它由miR159/319和miR858共同調控。

當噴施外源ABA時，番茄中miR159的表達量下調，對應靶基因MYB上調（Cheng et al.，2016）。MYB上調表達可以提高植物對逆境的抵抗能力（Ambawat et al.，2013）。張穎等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊遭受ABA脅迫誘導后，miR398的表達經(jīng)歷先上調、后下調、再上調的與擬南芥相反的動態(tài)變化，這可能是由于不同物種應答ABA脅迫的方式不同導致（Sunkar et al.，2012）。但無論在擬南芥還是在毛果楊中，miR398的表達與其靶基因超氧化物歧化酶基因（CSD）的表達均呈負相關（Jia et al.，2009）。

2.3干旱脅迫

miRNA可通過調控ABA依賴型和ABA非依賴型兩類靶基因響應干旱脅迫（Niu et al.，2016）。在干旱脅迫下，對13個物種的34個miRNAs進行芯片雜交試驗，發(fā)現(xiàn)這些miRNAs的靶基因中大部分都含有ABA響應元件（Liya & Zuxin，2009）。miR159靶基因是MYB轉錄因子，干旱脅迫處理后，抑制miR159降解的MYB33和MYB101以及miR159都上調表達（Song et al.，2011）。干旱脅迫下，miR528和miR167靶基因POD、PLD的表達量上調，啟動ABA誘導的氣孔運動和抗氧化防御（Cheng et al.，2016）。

利用PEG6000模擬干旱脅迫誘導試驗發(fā)現(xiàn)，水稻中miR169g是唯一一個被干旱誘導的miR169成員，也是最早發(fā)現(xiàn)的與干旱相關的miRNA，家族中包含17個成員（Zhao et al.，2007）。并且miR169g在根部的表達量遠遠高于嫩枝，說明同一家族中基因序列雖然相似，但在生理學上各成員卻有不同的作用。Zhang等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下番茄葉片中的miR169c通過靶向SIMRP1調控氣孔運動。miR169的靶基因GmNFYA3受ABA、干旱等非生物脅迫的誘導，擬南芥GmNFYA3過表達植株中參與ABA 合成、ABA信號通路和干旱響應的基因均上調表達，從而減輕葉片失水，增強抗旱能力，增加對高鹽和外源ABA的敏感性（Ni et al.，2013）。干旱使miR168通過靶基因MAPK在種子中上調表達，說明miR168參與了種子體內的新陳代謝，進而調控耐干旱脅迫過程（Li & Lu，2013）。擬南芥的miR394超表達植株比野生植株更能抵抗干旱脅迫，在響應干旱脅迫中發(fā)揮重要作用（Song et al.，2013）。利用qRT-PCR分析番茄中的miR397，證明其響應干旱、ABA和鹽害脅迫（向娟 等，2016），推測miR397可能通過ABA信號途徑響應干旱脅迫。

2.4其他非生物脅迫

miRNA在高鹽、重金屬、紫外線照射等其他形式的非生物脅迫下，同樣存在調節(jié)植物生長和生理活動的過程。例如，鹽脅迫條件下，miR161和miR173在細胞質中穩(wěn)定表達，在細胞核中負調控表達（Dolata et al.，2016）。土壤重金屬含量過高時，miR398通過與靶基因CSD相互作用，調節(jié)植物體內的銅素平衡。同樣，miR398也是植物響應氧化脅迫的主要miRNA，在氧化脅迫時下調表達，并與靶基因CSD相互作用行使功能（Sunkar et al.，2006）。柑橘中miR397通過調節(jié)LAC7（miR397的靶基因Laccase7，漆酶）減輕硼脅迫（Jin et al.，2016）。但miRNAs并不是直接參與非生物脅迫，而是通過調控靶基因發(fā)揮抗逆境的作用（表1）。

表1 植物miRNA對逆境脅迫的應答

3 啟動子順式作用元件分析

為驗證這些miRNAs的靶基因與哪些非生物脅迫相關，筆者挑選番茄中4個miRNAs（miR160、miR162、miR166、miR397）的8個靶基因進行啟動子分析，從Ensemble數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl. org/index.html）中提取這些靶基因上游啟動子序列。將啟動子提交PlantCARE（http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/），將其中的順式作用元件進行分析。

利用PlantCARE將靶基因上游3 000 bp序列進行啟動子元件分析（表2）：8個靶基因上游均具有CAAT-box、TATA-box等啟動子基本元件，說明這些基因可能都具有表達活性。但不同基因啟動子區(qū)的順式作用元件存在差異，這些基因可能在表達方式上出現(xiàn)分化，它們以不同方式參與逆境脅迫、光信號轉導與光形態(tài)建成等不同生理過程的調控。例如：miR160和miR162的靶基因含有脫落酸響應元件ABRE，miR160、miR162、miR166和miR397都含有干旱響應元件MBS，miR160和miR162含有光響應元件Box 4，miR160、miR162、miR166和miR397都含有低溫響應元件LTR，這都與前人的研究結果一致（Martin et al.，2010；馬風勇 等，2012）。

表2 番茄8個靶基因啟動子中的順式作用元件

但也有一些miRNA功能是未知的，如番茄中miR162的靶基因中含有ABA響應元件ABRE，但在擬南芥或其他物種中還沒有證明它是如何響應ABA或參與ABA信號途徑，有待于進一步驗證。

4 展望

綜上所述，有關miRNA在許多非生物脅迫下的研究取得了很大進展，但依賴ABA途徑響應非生物脅迫的機制還不是很明確。miRNA是調控真核生物基因表達和探究基因功能的重要手段，對于逆境分子生物學領域的研究，發(fā)現(xiàn)響應逆境脅迫的植物miRNA成為一項重大突破，并為了解植物逆境脅迫下基因和基因表達調控本質提供強有力工具。通過對不同物種的探究，未來會挖掘出更多新的miRNAs及其對應的靶基因，并通過轉基因技術來驗證miRNAs和靶基因的功能及信號調控網(wǎng)絡，為深入研究植物的基因水平和對逆境環(huán)境的抵抗能力提供理論依據(jù)，miRNA依賴ABA信號響應非生物脅迫也會得到進一步的驗證和探究。

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The Research Advance of Plant miRNAs Response to Abiotic Stress

LIU Yu-feng1，WANG Xiao1，CHEN Hai-yin1，LIU Kun1，LIU Yang1，QI Ming-fang1，NING Xiaofeng2，LI Tian-lai1*
（1College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Key Lab of Protected，Ministry of Education，Collaborative Innovation Center of Protected Vegetable Surround Bohai Gulf Region，Shenyang 110866，Liaoning，China；2College of Engineering，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，Liaoning，China）

MicroRNAs（miRNAs）are 20-24 nt non-coding RNA，which plays a very important role by targeting mRNA under abiotic stress. This paper focused on the low temperature，exogenous ABA and drought stress in the regulation mechanism of miRNA，and to further clarify the mechanism of miRNAs in response to abiotic stress.

miRNA；Low temperature；Exogenous ABA；Drought；Review

劉玉鳳，女，博士，碩士生導師，主要從事設施蔬菜栽培生理研究，E-mail：lyf-3939@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：李天來，男，博士，博士生導師，主要從事設施蔬菜栽培生理研究，E-mail：tianlaili@126.com

2016-10-21；接受日期：2016-12-27

國家重點研發(fā)計劃支持項目（2016YFD0201004），遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（2015040），農業(yè)部現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設專項（CARS-25），中央財政農業(yè)科技推廣項目（GCNTLN-17）