芥藍耐熱性鑒定及耐熱轉錄因子MBF1c表達分析

王浩偉 陳國菊 陳長明 曹必好 鄒麗芳 雷建軍

（華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642）

芥藍耐熱性鑒定及耐熱轉錄因子MBF1c表達分析

王浩偉 陳國菊 陳長明 曹必好 鄒麗芳 雷建軍*

（華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642）

芥藍喜涼性氣候，耐高溫能力較弱，夏秋季栽培高溫逆境往往使其生長發育不良，影響其產量、品質。本試驗采用人工氣候箱高溫處理的方法，測定10份芥藍材料在不同高溫脅迫下的生長指標和生理生化指標，分析10份芥藍材料在不同高溫脅迫下各項指標的相對變化率。結果表明：高溫脅迫下芥藍的熱害指數與生長指標（地上部鮮質量、地下部鮮質量、節間長）可以簡單、較好地反映出芥藍材料間耐熱性差異；37 ℃/25 ℃、40 ℃/32 ℃處理的生理生化指標相對變化率能較好地反映出芥藍材料間的耐熱性差異；高溫能誘導MBF1c轉錄因子的表達，使其表達量升高，且耐熱性強的材料相對表達量較高，該轉錄因子的表達可能對芥藍耐熱性起到一個正調控作用。綜合評價結果表明，矮腳香菇在這10份芥藍材料中耐熱性最強。

芥藍；耐熱性；MBF1c

芥藍（Brassica alboglabra L. H. Bailey）是十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，在我國廣東、福建等地廣為種植；以肥嫩的花薹、嫩葉或嫩株作為主要食用器官，營養價值豐富、質地脆嫩，可炒食或涼拌；已傳入日本等東南亞各國和美洲、大洋洲、歐洲等地區（秦耀國 等，2009）。芥藍是喜涼性蔬菜作物，在高溫脅迫下生長和發育都會受到不同程度的影響，一般在秋冬季溫度較低的時候栽培，早春也可以栽培，夏季栽培由于溫度較高，雖然也能生長，但是產量比較低、品質會變差（楊暹和楊運英，2002）。如果能通過品種選育方法選育出耐高溫的芥藍品種，在高溫條件下種植其產量、商品性不會受到太大的影響，則可顯著提高芥藍的經濟效益。

在植物中MBF1與逆境脅迫有密切的關系，多種逆境都會誘導MBF1表達增強。在煙草和擬南芥中發現，高溫和干旱同時處理可以使MBF1基因誘導表達（Ludmila et al.，2002）。在小麥研究中，以TAM107為材料克隆獲得了在高溫脅迫下上調表達劇烈的乙烯應答轉錄共激活因子TaMBF1c，通過轉化酵母發現在48 ℃高溫下重組酵母的耐熱性明顯強于轉空載體（秦丹丹 等，2013）。轉錄因子MBF1c在擬南芥耐熱過程中是十分重要的，它可以在熱激反應中控制36種不同轉錄因子的表達來介導植物對高溫的耐性（Suzuki et al.，2008）。

篩選耐熱芥藍原始材料是選育強耐熱性芥藍品種最重要的環節。以往在大白菜、蘿卜、辣椒、黃瓜等蔬菜作物上的耐熱性研究較多，并取得了很大的進展，但關于芥藍耐熱性材料篩選的研究鮮見報道。本試驗在前人研究基礎上，對10份芥藍材料的與耐熱性有關的生長指標和生理生化指標進行了測定，篩選出耐熱芥藍材料，以期為選育耐熱性強的芥藍品種提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2015年4月至2016年2月在華南農業大學園藝學院進行。供試材料為芥藍品種中花芥藍（1號）、小香菇（22號）、矮腳香菇（25號）、長葉早種（32號）、快大黃花芥藍（36號）、粗條芥藍（37號）、雛葉芥藍（44號）、新會芥藍（48號）、早格藍（49號）及通過游離小孢子培養獲得的59號，均為多代自交獲得的穩定自交系。

1.2試驗方法

1.2.1 高溫對芥藍幼苗生長量的影響 2015年11月，將10份芥藍材料分別播種于72孔育苗盤中，在適宜溫度（24 ℃）條件下生長至5～7片真葉；移入光照培養箱中，進行37 ℃/25 ℃（晝/夜，下同）高溫處理；高溫處理7 d后，每處理隨機選取3株幼苗，測定地上部、地下部鮮質量及節間長。以在適溫（24 ℃/12 ℃）條件下生長的各相應芥藍材料為對照，每處理3次重復。

1.2.2 熱害指數鑒定 2015年11月，將10份芥藍材料分別播種于72孔育苗盤中，在適宜溫度（24℃）條件下生長至4～5片真葉；每份材料取30株幼苗，分成3次重復，采用完全隨機排列的方法置于光照培養箱中，進行40 ℃、12 h高溫處理；處理4 d后，調查全部幼苗的熱害情況，計算熱害指數。熱害指數越高，表明該材料耐高溫脅迫的能力越差。

參考尹賢貴等（2001）的方法，制定熱害分級標準：0級，無黃葉出現，沒有熱害癥狀；1級，有1片黃葉出現；3級，有2片黃葉出現；5級，有3片黃葉出現；7級，有4～5片黃葉出現；9級，整株死亡。

1.2.3 高溫對芥藍幼苗生理生化指標的影響 2015年4月，將10份芥藍材料分別播種于72孔育苗盤中，在適宜溫度（24 ℃）條件下生長至5～6片真葉；然后放入人工氣候培養箱中，設置3個高溫處理水平，分別為34 ℃/20 ℃、37 ℃/25 ℃、40℃/32 ℃，以24 ℃/12 ℃為對照，每處理3次重復；高溫處理3 d后，每處理隨機選取6株幼苗，測定生理生化指標。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；電導率測定采用電導儀；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外吸收法（李合生，2000）。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 將10份芥藍材料幼苗（5～6片真葉）放入人工氣候培養箱中，每份材料10株，37 ℃高溫處理1 h；每份材料隨機選取3株，剪取相同部位葉片，提取RNA并反轉成cDNA。以24 ℃/12 ℃條件下生長的各相應芥藍材料為對照。

PCR擴 增 體 系（10 μL）：SYBR Premix Ex TagⅡ（2 x）5 μL，Actin為內參基因，特異引物（上游引物：5′-AAAAGCGGTAAACCAAGC-3′，下游引物：5′-GTCTCACATCCACAGGCA-3′）各0.5 μL，稀釋后的cDNA（50 ng）1 μL，ddH2O 3 μL。

PCR擴增程序：采用兩步擴增法，94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環，在每個循環結束后進行熒光信號采集；所有循環結束后進行溶解曲線分析（65～95 ℃）。以高溫處理和對照樣品的cDNA（稀釋后）為模板進行實時定量PCR檢測，每個樣品進行3次技術重復，同時設置無模板的陰性對照。

1.2.5 綜合評價 依照盛業龍等（2014）采用的模糊數學中的隸屬函數數值法，計算10份芥藍材料各指標的隸屬函數值，并進行累加，綜合比較各芥藍材料的耐高溫脅迫能力。

式中：X為某芥藍材料某一指標的測定值；Xmax為所有參試材料某一指標測定值的最大值；Xmin為所有參試材料某一指標測定值的最小值。

本試驗中，不同處理各項指標相對值均用該指標的變化率表示。

相對變化率=（處理-對照）/對照×100%

1.3數據處理

采用WPS軟件和SPASS軟件對試驗數據進行整理及顯著性測驗、多重比較等。

2 結果與分析

2.1高溫對芥藍幼苗生長量的影響

從表1可以看出，供試各芥藍材料經37 ℃高溫處理后生長量相對變化率存在顯著差異。59號地上部鮮質量、地下部鮮質量、節間長的相對變化率分別為25.16%、28.57%、27.42%，均高于其他材料；25號地上部鮮質量、地下部鮮質量、節間長的相對變化率分別為2.27%、4.35%、4.71%，是10份芥藍材料中最低的；22號和1號地上部鮮質量、地下部鮮質量、節間長的相對變化率也較低。害指數分別為63%和58%；1號、22號、25號受熱害影響較輕，熱害指數分別為19%、13%、5%；除32號和44號材料間熱害指數無顯著差異外，其他各材料間差異均達顯著水平。

表1 高溫對芥藍幼苗生長量的影響

2.2熱害指數鑒定結果

由圖1可見，參試各芥藍材料間熱害指數差異顯著，熱害表現最明顯的是59號，熱害指數高達66%；36號、37號受熱害脅迫也比較嚴重，熱

相對變化率如圖3所示。34 ℃/20 ℃處理下，相對變化率最大的是59號，為223%；相對變化率較小的是25號和22號，分別為22%和26%。37℃/25 ℃處理下，相對變化率最大的還是59號，

圖1 不同芥藍材料的熱害指數

2.3高溫對芥藍幼苗生理生化指標的影響

由圖2可見，隨著溫度的升高，各芥藍材料的相對電解質滲透率均逐漸升高；在24 ℃/12 ℃條件下各材料間相對電解質滲透率相差不大，但隨著溫度的升高各材料間相對電解質滲透率的差異越來越大。從增長趨勢來看，24 ℃/12 ℃到34 ℃/20 ℃、37 ℃/25 ℃到40 ℃/32 ℃這兩個溫度段間相對電解質滲透率的增加幅度較大，34 ℃/20 ℃到37 ℃/25℃溫度段間增加幅度較為平緩。

圖2 不同芥藍材料高溫脅迫下的相對電解質滲透率

圖3 不同芥藍材料高溫脅迫下相對電解質滲透率的相對變化率

各芥藍材料高溫脅迫下相對電解質滲透率的為238%；相對變化率較小的是22號、32號和44號，分別為59%、60%和62%。40 ℃/32 ℃處理下，相對變化率最大的亦是59號，為324%；相對變化率最小的是32號，為88%。

從表2可以看出，無論是在適溫下還是在高溫下，各芥藍材料間脯氨酸含量都有顯著差異；隨著溫度的升高，各材料脯氨酸含量都呈增加的趨勢。3個高溫處理下25號的脯氨酸含量相對變化率均為最高，分別為163.40%、625.06%、731.12%。34℃/20 ℃處理下，22號、25號、37號、44號的脯氨酸含量相對變化率顯著高于其他材料；37 ℃/25℃處理下，脯氨酸含量相對變化率最高的是25號，其次是59號、32號、44號、1號，最小的是36號；40 ℃/32 ℃處理下，脯氨酸含量相對變化率由高到低依次為：25號、44號、1號、22號、32號、59號、49號、36號、48號、37號；25號、44號和1號在37 ℃/25 ℃和40 ℃/32 ℃處理下脯氨酸含量相對變化率都較高。

從表3可以看出，隨著溫度的升高，各芥藍材料的丙二醛含量都有不同程度的升高，且各材料間丙二醛含量差異顯著；59號在3個高溫處理下丙二醛含量都較高，而25號的丙二醛含量都較低。37 ℃/25 ℃處理下，各材料的丙二醛含量相對變化率由高到低依次為：59號、36號、37號、44號、32號、49號、1號、48號、22號、25號；其中，59號、36號、37號的丙二醛含量相對變化率較高，25號和22號較低。

從表4可以看出，各芥藍材料的可溶性蛋白含量均隨溫度的升高而逐漸遞增，且不同材料間可溶性蛋白含量差異顯著，但是變化幅度不一；各溫度處理下59號的可溶性蛋白含量都較低，而37號的可溶性蛋白含量都較高。34 ℃/20 ℃處理下，可溶性蛋白含量相對變化率較高的是25號和44號，分別為95.41%和94.17%，而32號和49號的相對變化率較低；37 ℃/25 ℃處理下，可溶性蛋白含量相對變化率最高的是32號，為128.82%，相對變化率最低的是49號；40 ℃/32 ℃處理下，各材料的可溶性蛋白含量相對變化率呈增加的趨勢，25號和32號的相對變化率較高，分別為130.73%和131.42%，而49號的相對變化率最低。

表2 不同芥藍材料高溫脅迫下脯氨酸含量及相對變化率

表3 不同芥藍材料高溫脅迫下丙二醛含量及相對變化率

從表5可以看出，各個溫度下不同芥藍材料間SOD活性都有顯著差異，且隨著溫度的升高各材料的SOD活性均呈逐漸上升的趨勢。25號和1號在3個高溫處理下的SOD活性相對變化率都較高，分別為197.08%、232.61%、338.36%和102.67%、429.68%、481.54%；而59號的SOD活性相對變化率最低；40 ℃/32 ℃處理下，各芥藍材料SOD活性相對變化率由高到低依次為：1號、25號、48號、32號、22號、37號、44號、36號、49號、59號。

不同溫度條件下各芥藍材料的POD活性變化如表6所示。各材料的POD活性均隨溫度的升高呈上升的趨勢，且各材料間POD活性差異顯著。25號在24 ℃/12 ℃處理下的POD活性不高，只有1.33 μg·g-1，但在高溫脅迫下酶活性急劇上升，34 ℃/20 ℃、37 ℃/25 ℃、40 ℃/32 ℃處理下的POD活性分別為3.97、6.21、8.71 μg·g-1，相對變化率分別達198.92%、366.76%、557.47%；其次是22號，37 ℃/25 ℃、40 ℃/32 ℃處理下的POD活性相對變化率分別為198.25%和222.65%；59號在3個高溫處理下的POD活性相對變化率都較低。

表4 不同芥藍材料高溫脅迫下可溶性蛋白含量及相對變化率

表5 不同芥藍材料高溫脅迫下SOD活性及相對變化率

表6 不同芥藍材料高溫脅迫下POD活性及相對變化率

從表7可以看出，參試10份芥藍材料的CAT活性均隨著溫度的升高呈上升趨勢，且各材料間CAT活性差異顯著；24 ℃/12 ℃處理下，22號的CAT活性最高，其次是25號、36號和1號；3個高溫處理下，22號和25號的CAT活性較高，而59號的CAT活性較低。48號在3個高溫處理下的CAT活性相對變化率均為最高，分別達到了885.39%、1 051.40%、1 399.73%，而59號的CAT活性相對變化率均較低；40 ℃/32 ℃處理下，各芥藍材料CAT活性相對變化從大到小依次為：48號、22號、25號、44號、1號、36號、49號、32號、37號、59號。

表7 不同芥藍材料高溫脅迫下CAT活性及相對變化率

表8 不同芥藍材料高溫脅迫下生理生化指標相對變化率的隸屬函數值

2.4隸屬函數綜合法評價結果

綜合各測定指標的隸屬函數值，25號綜合排名第1，59號綜合排名最后；各芥藍材料的耐熱性由高到低依次為：25號、32號、44號、1號、48號、22號、49號、37號、36號、59號（表8）。

2.5高溫對芥藍幼苗MBF1c表達量的影響

由圖4可見，37 ℃高溫處理1 h后，除37號外其他各芥藍材料的MBF1c表達量都呈增加趨勢；25號在受到高溫脅迫后，MBF1c表達量急劇上升，上升幅度最大。

圖4 高溫脅迫對芥藍幼苗MBF1c表達量的影響

3 結論與討論

高溫脅迫能使植物生長受阻，使植物的生長量減少，葉片變黃枯萎，幼苗徒長，根系發育受阻；此外，在熱脅迫下通過測定植物生理生化指標的變化也可以鑒定植物的耐熱性，且在大白菜（司家鋼等，1995）、番茄（王冬梅，2003）、蘿卜（梁超英，2006）、黃瓜（李建建，2006）上都有報道。

本試驗結果表明，高溫脅迫會使芥藍幼苗徒長，且耐熱材料的相對變化率要小于不耐熱材料。這與劉燕燕等（2005）在不結球白菜、陳日遠等（2006）在芥藍上的研究結果一致。經過40 ℃高溫處理后，10份芥藍材料都出現了不同程度的熱害癥狀。比較熱害指數與生長量的相對變化率，發現高溫對芥藍的生長量有一定影響，熱害指數低的芥藍材料地上部、地下部鮮質量減少量較小，節間長增加量較大；熱害指數高的芥藍材料地上部、地下部鮮質量減少量較大，節間長增加量較小。

電解質滲透率在植物耐熱性鑒定中應用較早，是能反映植物耐熱性的一個重要指標。高溫脅迫下植物細胞膜易受到傷害，導致細胞膜通透性增加，電解質外滲，電導率升高，從而使植物體受到損傷（潘光輝 等，2001）。本試驗中，不同高溫處理下，24 ℃/12 ℃到34 ℃/20 ℃、37 ℃/25 ℃到40 ℃/32℃這兩個溫度段間電導率增長幅度比34 ℃/20 ℃到37 ℃/25 ℃溫度段間的大，前者可能是由于溫度區間跨度大，細胞膜受損嚴重；后者則可能是因為處理溫度較高，細胞膜受損更嚴重。研究各芥藍材料的電解質滲透率在不同溫度條件下的變化規律發現，在34 ℃/20 ℃處理下各芥藍材料的電解質滲透率相對變化率排列順序與熱害指數大致相符，采用此溫度下測定的電解質滲透率能簡單地反映出芥藍的耐熱性。

在高溫脅迫下，丙二醛含量的積累量變化反映了細胞膜脂過氧化程度，在一定程度上反映了植物的耐熱性；耐熱性強的芥藍材料丙二醛含量的積累量變化小，耐熱性較差的芥藍材料丙二醛含量的積累量變化大。本試驗中發現：在高溫脅迫下，耐熱性強的芥藍材料脯氨酸含量相對變化率較大，耐熱性差的芥藍材料相對變化率較小，說明在高溫脅迫下細胞中會大量積累脯氨酸，作為滲透調節物質使細胞結構穩定，對作物起到一定的保護作用。

本試驗通過熒光定量法測定MBF1c的表達量，發現在短時間高溫處理后，9份芥藍材料的MBF1c表達量都有不同程度的升高，說明高溫會誘導MBF1c表達；耐熱性強的芥藍材料表達量上升幅度更大，說明MBF1c可能對芥藍的耐熱性起正調控作用。如果能在沉默MBF1c后再對各芥藍材料的耐熱性指標進行一次綜合鑒定，觀察各芥藍材料在MBF1c沉默后各項指標是否發生相應的變化，更能進一步說明MBF1c與芥藍耐熱性的關系。

植物的耐熱性往往是由外界環境溫度和植物體內許多復雜代謝因素共同作用的結果，不能單憑某一指標就判定植物的耐熱性。高溫脅迫對植物的影響最直觀的是表現在外部形態和生長情況上，而在植物體內由于不同耐熱機制發揮的效果不同而導致各項生理指標對鑒定耐熱性的貢獻有所不同。本試驗全面地測定了與植物耐熱性有關的生長指標和生理指標，設置不同脅迫溫度用于探索能簡單準確地反映出芥藍耐熱性的方法，發現室內鑒定中各指標的絕對含量不能較好的反映出芥藍材料間的耐熱性差異，而使用相對變化率較為準確。綜合評價結果表明，矮腳香菇（25號）在這10份芥藍材料中耐熱性最強。

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Identification of Heat Tolerance in Chinese Kale and the Expression Analysis of Heat Tolerance Transcription Factor MBF1c

WANG Hao-wei，CHEN Guo-ju，CHEN Chang-ming，CAO Bi-hao，ZOU Li-fang，LEI Jian-jun*
（College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

Chinese kale（Brassica alboglabra L. H. Bailey）is a thermophilic vegetable，which can’t well grow at high temperature．High temperaturewould prevent Chinese kale from growing and result in poor quality of its seedlings，seriously influence yield and quality in later period in summer and autumn．Taking 10 Chisnses kale lines as experimental materials，the growth indexs and physiology indexs under different high temperature stress were measured．The relative change rate of 10 Chinese kale lines under different high temperature stress was analyzed．The results showed that heat damage index and relative growth could be used to determine the heattolerance ability of Chinese kale lines，which can be most quick and convenient．The difference in heat tolerance among the varieties could be indicated by physiological and chemical index under 37℃/25 ℃ or 40℃/32 ℃．After the treatment of 37 ℃for 1 hour the expression variation of MBF1c was increased．According to the comprehensive analysis，‘Aijiaoxianggu’was the most heat-tolerant lines.

Chinese kale；Heat tolerance；MBF1c

王浩偉，男，碩士研究生，專業方向：芥藍育種及分子生物學，E-mail：503469851@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：雷建軍，男，教授，博士生導師，專業方向：芥藍、辣椒育種及分子生物學，E-mail：jjlei@scau.edu.cn

2016-07-16；接受日期：2016-10-16

廣東省科技廳項目（2013B051000069，2015B020202009），廣州市科創委項目（201508030021）