黃芪甲苷對早期骨關節炎軟骨細胞基質金屬蛋白酶-1表達的影響

劉建紅 孟慶剛 胡佳卉 石康樂

(青海大學，青海 西寧 810016)

黃芪甲苷對早期骨關節炎軟骨細胞基質金屬蛋白酶-1表達的影響

劉建紅 孟慶剛1胡佳卉1石康樂1

(青海大學，青海 西寧 810016)

目的 探討黃芪甲苷作用于早期骨關節炎退變軟骨細胞后基質金屬蛋白酶(MMP)-1表達的變化。方法 采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度黃芪甲苷作用不同時間關節炎退變軟骨細胞的存活率；qRT-PCR法檢測黃芪甲苷不同濃度不同作用時間處理關節炎退變軟骨細胞后MMP-1 基因表達情況；酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測黃芪甲苷處理關節炎退變軟骨細胞后細胞上清液中 MMP-1的表達；Western印跡檢測黃芪甲苷處理后MMP-1蛋白表達。結果 黃芪甲苷處理后關節炎軟骨細胞存活率提高，20～100 mmol/L濃度內呈劑量依賴，黃芪甲苷用量100 mmol/L效果最佳；隨著培養時間的延長，細胞的存活率增加，在12 h～3 d內，第3天達到存活率最高。與對照組未經黃芪甲苷處理的軟骨細胞相比，黃芪甲苷處理后的細胞中MMP-1基因表達量下降，黃芪甲苷濃度20～60 mmol/L，培養2 d內，MMP-1基因的表達量與黃芪甲苷的作用濃度與作用時間呈負相關；100 mmol/L時，第2天時MMP-1基因表達量最低。ELISA結果顯示正常軟骨組織中MMP-1少量表達，關節炎軟骨組織中MMP-1的濃度為正常組織中的2倍，處理后正常軟骨組織中 MMP-1濃度并未發生變化，黃芪甲苷處理后的關節炎軟骨組織中MMP-1濃度降低為處理前的0.5倍，但仍高于正常軟骨組織中MMP-1的濃度。Western印跡檢測結果顯示正常軟骨組織中MMP-1蛋白少量表達，關節炎軟骨組織中MMP-1蛋白大量表達，與對照組相比，黃芪甲苷處理后軟骨組織中MMP-1蛋白表達量降低，但仍高于正常骨組織。結果 黃芪甲苷抑制早期骨關節炎退變軟骨細胞與MMP-1表達下降相關。

黃芪甲苷；關節炎;退變軟骨細胞；基質金屬蛋白酶-1

膝骨關節炎(KOA)是一種慢性退行性骨關節病,關節軟骨發生改變、關節間隙變小，從而引發骨質增生等疾病〔1〕。關節軟骨的胞外基質由Ⅱ型膠原組成，主要支持和保護細胞〔2〕?；|金屬蛋白酶(MMPs)是廣泛存在于軟骨中的蛋白酶家族,能降解關節軟骨的胞外基質,當發生KOA時,軟骨組織局部MMPs表達量升高，破壞細胞外基質的平衡狀態,導致軟骨逐漸出現糜爛、潰瘍增生等一系列退行性變化〔3〕。黃芪甲苷屬于豆科草本植物黃芪的干燥提取物，具有抗腫瘤、增強免疫、促進生長等功效。有研究表明黃芪甲苷能夠抑制MMPs活性，延緩KOA的臨床癥狀〔4〕。本文采用不同濃度的黃芪甲苷對骨關節炎(OA)退變軟骨細胞進行干預，研究黃芪甲苷處理后對軟骨細胞MMP-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 軟骨細胞來自青海大學附屬醫院收集的10例早期KOA患者的軟骨組織。試劑及儀器：黃芪甲苷(Solarbio)，胎牛血清(FBS，杭州沃森生物技術有限公司)，雙抗、DEME(Gibco公司)，MTT(南京都萊生物技術有限公司)，CO2培養箱(德國IRM公司)，Annexin-FITC、Propidiuym Iodide(上海勱瑞生物科技有限公司)，二抗：辣根過氧化物酶標記IgG(上海研卉生物科技有限公司)，Triton-100細胞裂解液膜蛋白試劑盒(TIANGEN公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MMP-1 ELISA 試劑盒(R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將患者的軟骨組織置于加入雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗3次，用無菌剪刀剪成1 mm3的組織塊，放入培養皿中，加入含10% FBS的DEME培養液中，37℃ 5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長后更換新培養液，待細胞數目增殖至80%，除去上層的培養液，用PBS溶液清洗，加入0.25%胰酶溶液，室溫消化5 min終止細胞生長，加入DEME培養液后將細胞吹打混勻，800 r/min離心5 min，收集細胞，按照1∶3比例進行傳代培養。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測軟骨組織細胞活性 取對數期的細胞接種于96孔細胞培養板中，加入100 μl 10%FBS的DEME培養液，實驗分為五組，每三孔為一組，分別接入不同濃度黃芪甲苷進行處理：對照組加入DEME培養液；另外4組分別加入20、40、60、100 mmol/L的黃芪甲苷，均培養1 d。二氧化碳培養箱培育1 d，加入20 μl MTT,37℃反應4 h，800 r/min離心5 min，小心吸取上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO),室溫反應10 min，570 nm下進行OD值測定。按照公式：(OD樣品-OD空白)/OD空白×100%計算細胞存活率。

1.2.3 MTT法檢測軟骨組織細胞的最佳培養時間 根據上述實驗，選取最佳黃芪甲苷濃度進行培養，方法同上，分別培養12 h、1、2、3 d。采用MTT法測定其細胞存活率。

1.2.4 采用qRT-PCR法檢測MMP-1 基因表達情況 按照黃芪甲苷作用細胞的最佳濃度及培養時間進行細胞的培養，對照組不加黃芪甲苷。反應結束后進行細胞膜RNA的提取，反轉錄為cDNA,設計MMP-1 基因qRT-PCR引物，上游：AGAGCAAGATGTGGAGATGG，下游：CTTGACAGGTCTGGTGTGTA，以甘油醛-3-磷酶脫氫酶(GAPDH)為內參，上游引物：TGATCCATTCATTGACCTCC;下游：GTTCACGCCCATCACAAACA，反應體系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，DEPC水8 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，各種不同處理的cDNA模板1 μl。在Bio-Red熒光定量PCR儀上按照反應程序：94℃ 3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40個循環進行反應，采用2-ΔΔCT算法進行基因表達的數據分析。

1.2.5 ELISA 法檢測細胞上清液中 MMP-1的表達 將試劑盒中的標準樣品(濃度：10 000 pg/ml) 稀釋2、4、8、16、32倍，同時將MMPs抗體、過氧化物酶復合物稀釋100倍，實驗分為6組，對照組只加待測樣品，實驗組為不同梯度的標準品加100 μl的細胞上清液。37℃反應1.5 h，加入MMPs抗體稀釋液100 μl，37℃反應1 h，反應結束后加入PBS溶液漂洗3次，加入100 μl ABC工作液，對照組不加，37℃反應30 min，PBS溶液漂洗3次，每孔加入顯色液90 μl，黑暗條件下反應20 min，加入四甲基聯苯胺(TMB)終止顯色液，450 nm測定OD值。

1.2.6 檢測黃芪甲苷處理后MMP-1的蛋白表達 對反應后的細胞進行細胞膜蛋白的提取，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，對照組不加黃芪甲苷處理。配制12.5%分離膠與5%濃縮膠，保證每孔蛋白上樣量保持一致，Marker 2.5 μl，樣品在濃縮膠時電壓為80 V，進入分離膠后電壓調至120 V，待反應結束后，將蛋白凝膠置于PBS中漂洗3次，每次10 min，在4℃過夜進行NC轉膜，反應結束后在含5%脫脂牛奶的PBS中進行過夜封閉，加入 PBS稀釋的一抗，4℃過夜，PBS洗滌3次，每次約10 min，加入PBS稀釋后的二抗，4℃過夜，PBS清洗3次，采用熒光掃描儀進行掃描，保存實驗結果。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1 MTT法檢測不同濃度黃芪甲苷處理后細胞的存活率 與對照組〔(27.36±4.57)%〕相比，黃芪甲苷處理后關節炎軟骨細胞存活率提高，在20～100 mmol/L濃度范圍內與黃芪甲苷作用濃度呈劑量依賴，20 mmol/L存活率為(32.56±5.62)%，40 mmol/L為(40.52±5.38)%，60 mmol/L為(47.36±6.42)%，100 mmol/L效果最佳(62.43±6.48)%。

2.2 MTT法檢測軟骨組織細胞的最佳培養時間 隨著培養時間的延長，細胞的存活率增加，在12 h～3 d內，第3天達到存活率最高〔(49.68±5.76)%〕，12 h為(27.69±4.23)%，1 d為(33.75±5.28)%，2 d為(42.71±4.68)%，對照組為(24.75±3.74)%，黃芪甲苷第3天對病變軟骨細胞治療效果最佳。

2.3 黃芪甲苷處理后細胞內MMP-1基因表達情況 與對照組相比，黃芪甲苷處理后的細胞中MMP-1基因表達量均下降，MMP-1基因的表達量隨著黃芪甲苷的作用濃度與作用時間的增加而下降。100 mmol/L時，第2天時MMP-1基因表達量最低，第3天時有上升的趨勢，有可能是黃芪甲苷的使用濃度過高導致。見表1。

2.4 ELISA 法檢測細胞上清液中 MMP-1的表達 未進行處理的軟骨組織中，正常軟骨組織中MMP-1少量表達，關節炎軟骨組織中MMP-1的濃度為正常組織中的2倍，處理后正常軟骨組織中 MMP-1濃度并未發生變化，黃芪甲苷處理后的關節炎軟骨組織中MMP-1濃度降低為處理前的0.5倍，但仍高于正常軟骨組織中MMP-1的濃度。見表2。

表1 黃芪甲苷處理后細胞內MMP-1基因表達±s)

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

表2 黃芪甲苷處理后細胞上清液中 MMP-1 濃度的變化

與對照組比較：1)P<0.01 ，與正常軟骨組織組比較：2)P<0.05

2.5 Western印跡檢測黃芪甲苷處理后MMP-1的蛋白表達 正常軟骨組織中MMP-1少量表達，關節炎軟骨組織中MMP-1蛋白大量表達，與對照組相比，黃芪甲苷處理后軟骨組織中MMP-1蛋白表達量降低，但仍高于正常骨組織。見圖1。

a：正常軟骨組織；b：關節炎軟骨組織；c：黃芪甲苷處理后的軟骨組織圖1 黃芪甲苷處理后MMP-1蛋白表達

3 討 論

KOA主要表現為關節軟骨改變、軟骨組織受到損害、骨質增生，常見于老年人群中，發病時關節腫痛，甚至難以行走，目前還沒有能夠較好地治療KOA的藥物，經常用的藥物為非甾體抗炎藥(NSAIDS)。雖然NSAIDS治療KOA起到很好的消炎作用，但是藥物的副作用很大。近年來中藥治療KOA取得了較好的成就，如獨活寄生湯、姜黃素等。黃芪甲苷具有降壓、增強免疫、抑制骨組織磨損等功效〔5〕，湯曉晨等〔6〕研究表明黃芪甲苷能夠抑制退變軟骨細胞合成白細胞介素(IL)-1β，降低軟骨細胞退變的速度。孟祥奇等〔7〕研究表明黃芪甲苷通過升高軟骨細胞Ⅱ型膠原(ColⅡ)及ACAN的表達進而降低KOA關節軟骨細胞衰變的速度。KOA主要是由于軟骨細胞合成減少而凋亡過度，與正常細胞的凋亡不同，細胞凋亡加速會導致軟骨組織和細胞的破壞〔8〕，丁輝等〔9〕研究表明在OA晚期沉默調節因子(SIRT)1表達量升高使軟骨細胞凋亡率升高進而破壞骨組織。因此，抑制OA軟骨組織細胞的過度凋亡，是延緩KOA加劇的一種方法。本研究結果表明黃芪甲苷處理后OA軟骨組織細胞存活率提高，與黃芪甲苷作用濃度呈劑量依賴，并隨著作用時間的延長而增加，表明黃芪甲苷能夠通過抑制OA退變軟骨細胞的死亡，延緩骨組織的破壞。MMPs參與機體正常生理活動如分娩、乳腺退化、傷口修復、骨組織吸收等〔10〕，MMPs升高會導致很多疾病的發生，如動脈粥樣化、骨肉瘤等，在軟骨組織局部MMPs表達量升高破壞細胞外基質的平衡狀態,導致軟骨逐漸出現糜爛、潰瘍增生等一系列退行性變化〔11〕。研究發現MMPs在正常機體內表達量較低，當關節發生炎癥或病變時，MMPs表達量迅速上升，并激活大量酶原降解細胞外基質，使骨組織發生損傷〔12〕。有研究表明，在KOA組織中，MMP-1高度表達，可能參與細胞基質ColⅡ型膠原降解，且表達量越高，軟骨組織退變程度越嚴重〔13〕。本實驗結果表明，正常軟骨組織中MMP-1也表達，在KOA軟骨組織中，MMP-1大量表達，黃芪甲苷作用后其表達量下降，并與作用時間和作用濃度呈負相關，而且黃芪甲苷治療KOA與MMP-1蛋白下調相關。ELISA 原理主要是使酶標記的抗原抗體反應在固相表面檢測特異性抗原或抗體。反應后待測物發生顏色變化，利用酶標儀測定待測物的量與底物的量相關〔14〕。ELISA 檢測OA患者滑液中蛋白多糖(PG)的含量高于正常骨組織，透明質酸(HA)含量低于正常組；檢測KOA患者和正常人血清IL-1和IL-6含量，KOA患者的IL-1和IL-6含量高于正常人，進而推測KOA患者的病情程度〔15〕。

綜上所述，本研究結果表明黃芪甲苷能夠抑制OA退變軟骨組織細胞MMP-1的表達，進而抑制MMP類金屬降解酶對軟骨組織細胞外基質的破壞，從而降低骨組織的損傷，減緩OA。本文只是從細胞生物學的角度進行基礎性研究，對于其分子機制有待進一步深入研究。

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〔2016-03-26修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金(No.81473800)

1 北京中醫藥大學

孟慶剛(1964-)，男，博士，教授，主要從事中醫基礎研究。

劉建紅(1972-)，女，碩士，副教授，主要從事中西醫結合研究。

R394.2

A

1005-9202(2017)03-0532-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.005