健腦益智膠囊不同純化工藝對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織炎癥反應的影響

郭東艷 范 妤 趙曉平 覃鴻恩

(陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046)

健腦益智膠囊不同純化工藝對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織炎癥反應的影響

郭東艷 范 妤 趙曉平1覃鴻恩

(陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046)

目的 研究不同純化工藝制備的健腦益智膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應和神經元凋亡的影響。方法 120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、原藥液組、醇沉組、殼聚糖組、膜分離組，給藥組提前給藥1 w(給藥劑量按健腦益智膠囊內容物為0.6 g·100 g-1·d-1，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1)。建立大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注損傷模型，尼氏染色后觀察大鼠缺血側大腦皮質神經元形態變化；檢測缺血側腦組織白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和細胞間黏附分子(ICAM)-1的含量；免疫組化法檢測腦組織中凋亡相關蛋白Fas、FasL的表達。結果 不同純化工藝制備的健腦益智膠囊均能保護神經元結構，減輕神經元損傷，顯著降低腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量，下調 Fas、FasL蛋白的表達，其中醇沉組改善作用更為明顯。結論 健腦益智膠囊通過抑制炎癥反應，阻斷神經細胞凋亡，實現神經保護組作用。

健腦益智膠囊；腦缺血再灌注損傷；炎癥因子；凋亡

健腦益智膠囊由水蛭、葛根、郁金、石菖蒲、白茅根等藥味組成，具有豁痰開竅、活血化瘀、通脈益智的功效，臨床上主要用于預防和治療外部顱腦損傷、缺血性腦損傷、腦震蕩及腦水腫等腦部疾病〔1～4〕。為了提高健腦益智膠囊質量，降低臨床服藥量，本實驗擬在前期提取工藝研究的基礎上〔5〕，考察不同純化工藝制備的健腦益智膠囊對大鼠腦缺血再灌注模型炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品 葛根(批號：121101；產地： 廣西)、白茅根(批號：130401 ；產地：陜西)、郁金(批號：130101；產地： 廣西)、石菖蒲(批號：130401 ；產地：四川)，以上飲片均購自西安盛興中藥飲片有限責任公司，經陜西中醫學院王繼濤老師鑒定，分別為葛根為葛根豆科植物野葛(Willd.)的干燥根，白茅根為禾本科植物白茅(Nees)的干燥根莖，郁金為姜科植物溫郁金的干燥塊根，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖；葛根素對照品(供含量測定用，批號：110752-201313)來源于中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖(69047438，生化試劑BR，國藥集團化學試劑有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器 UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津)，L-520型離心機(湖南賽特湘儀離心機有限公司)，恒溫水浴鍋(HH-2型，北京科偉永興儀器有限公司)，梅特勒電子天平(GB204 瑞士)，生物顯微鏡(Leica DM4000B，德國徠卡公司)，GQ76管式離心機(上海市離心機械研究所有限公司)，PFT-A500電子天平(福州華志科學儀器有限公司)。

1.3 實驗試劑 白細胞介素(IL)-1β、 腫瘤壞死因子(TNF)-α和細胞間黏附分子(ICAM)-1試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Fas、FasL一抗、SABC試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 實驗動物 雄性SD大鼠120只，體重300～350 g，飼養環境為SPF級，購于西安交通大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(陜)2013-003。

1.5 方法

1.5.1 不同純化工藝健腦益智膠囊的制備 按處方比例稱取白茅根、葛根、郁金和石菖蒲，其中郁金、石菖蒲兩味藥材加入10倍量的水，浸泡2 h，提取揮發油6 h，收集揮發油和水溶液備用；藥渣與白茅根、葛根兩味加入10倍量水，煎煮2次，每次2 h，水煎液和蒸餾后的水溶液合并，過濾，即得水提液。將水提液分成4等份，一份備用，其余3份進行醇沉〔6〕、殼聚糖〔7〕和膜分離〔8〕三種工藝處理，另將揮發油分成四等份，分別加入原水提液及三種不同精制工藝后的溶液中，混勻。按處方比例稱取水蛭，分成兩份，一份粉碎，過40目篩，用60%乙醇回流提取1 h，提取2次，濾過，濾液濃縮至無醇味，分成4等份，分別加入上述四種溶液中，混勻；取另一份水蛭，粉碎，過100目篩，分成4等份，分別加入上述四種溶液中，混勻、干燥、粉碎、填充、即得不同純化工藝制備的健腦益智膠囊。

1.5.2 動物分組與給藥 120只大鼠隨機分成6組，即假手術組、模型組、原藥液組、醇沉組、殼聚糖組、膜分離組，每組20只。給藥組提前給藥1 w，給藥劑量按健腦益智膠囊內容物為0.6 g·100 g-1·d-1，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1。

1.5.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備 將經1.5.2方法處理后的大鼠提前禁食12 h，照常給水。參照Zea Longa改良法建立左側大腦中動脈缺血(MCAO)模型：大鼠稱重后腹腔注射10% 水合氯醛 3 ml/kg麻醉，于頸部偏右側切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，結扎右CCA近心端、ECA及其分支動脈。分離右側ICA，沿ICA向下分離翼顎動脈，根部結扎該動脈分支。在CCA近心端備線，另一端加動脈夾，在距離頸動脈分叉0.5 cm處剪開一小口，將處理后的漁線經ECA插入ICA進入大腦中動脈分支處，以阻斷大腦中動脈所有血流來源。缺血1.5 h后，拔出漁線，再灌注48 h。假手術組只做動脈分離暴露，不插拴線，其余步驟相同。手術過程中大鼠保持體溫在37℃左右。

1.5.4 尼氏染色檢測腦組織病理學變化 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，快速斷頭取出大腦，置于10%甲醛溶液中固定，包埋切片，脫蠟至水后，0.1%甲苯胺藍染色10 min，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照，觀察神經元胞體內尼氏體變化。正常細胞不同程度的含有尼氏體，經甲苯胺藍染色后呈藍色，細胞凋亡后，細胞質內尼氏體減少甚至消失。

1.5.5 ELISA法檢測大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量 取備用血清，嚴格按照 ELISA 試劑盒說明操作，測定 450 nm吸光度值，制定標準曲線。標準及檢測標本均采用復孔，復孔測定的吸光度值取均數減去零標準孔吸光度值的均數作為該濃度標準濃度或檢測標本的測定值，進一步通過標準曲線和稀釋倍數計算出濃度。

1.5.6 免疫組化法檢測缺血側腦組織Fas、FasL表達水平 大鼠灌流固定后，取缺血側腦組織,常規固定、脫水、石蠟包埋后，制作標本切片，采用免疫組化SABC法染色,DAB顯色，光鏡(×400)下觀察陽性細胞個數。每張切片隨機取大腦皮質5個不重疊視野計數陽性細胞，計數不分細胞種類。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 不同純化工藝健腦益智膠囊對腦缺血再灌注后大鼠腦組織病理變化的影響 缺血側大腦皮質尼氏染色后光學顯微鏡下觀察神經元胞體內尼氏體變化，結果顯示：假手術組神經元胞體內尼氏體清晰可辨，呈紫藍色斑塊狀，數量多，體積大；模型組尼氏體明顯減少呈細顆粒狀，染色淺，部分神經元內尼氏體消失；與模型組比較，不同純化工藝制備的健腦益智膠囊預處理組尼氏體明顯增多，體積增大，紫藍色染色清晰。膜分離組尼氏體數量較少。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織尼氏染色(甲苯胺，×200)

2.2 不同純化工藝健腦益智膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織IL-1β、IL-6和ICAM-1的影響 腦缺血再灌注48 h后腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1水平均顯著升高(P<0.01)，健腦益智膠囊不同純化工藝組均能降低腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的表達(P<0.05)，其中，醇沉組對IL-1β和TNF-α的表達抑制作用更為明顯(P<0.01)。見表1。

2.3 不同純化工藝健腦益智膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織Fas、FasL表達的影響 與假手術組比較，模型組Fas、FasL蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，健腦益智膠囊不同純化工藝組均能減低Fas、FasL蛋白的表達(P<0.05)。見表2。圖2。

表1 健腦益智膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織IL-1β、 TNF-α和ICAM-1的影響

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

表2 健腦益智膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織Fas、 FasL表達的影響

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

圖2 大鼠大腦皮質中Fas的陽性表達(×400)

3 討 論

腦缺血及再灌注損傷的病理生理機制復雜，目前認為存在多種機制相互作用形成的復雜調控網絡，包括炎癥損害、自由基損傷、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載等，直接或間接導致神經細胞凋亡或死亡，導致神經功能障礙。 大量研究表明炎癥反應與腦缺血再灌注損傷關系密切。在炎癥反應中，有許多炎性因子參與，IL-1和TNF-α是由單核/巨噬細胞產生的單核因子〔9〕。IL-1可以協助白細胞遷移和刺激內皮細胞的各種反應,通過激活血管內皮細胞而增強內皮細胞黏附分子(ECAM)表達,增強白細胞與內皮細胞的黏附，破壞血腦屏障的通透性，加重腦組織損傷；同時TNF-α與細胞膜上的死亡受體結合細胞膜死亡受體結合，激活Fas/FasL凋亡蛋白，導致細胞凋亡〔10，11〕。本實驗結果顯示：健腦益智膠囊不同純化工藝組均能降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中炎性細胞因子IL-1、TNF-α和ICAM-1的含量，下調凋亡蛋白Fas/FasL的表達，說明健腦益智膠囊通過降低炎性因子與黏附分子的含量抑制炎癥反應，阻斷神經細胞凋亡，實現腦缺血再灌注后的神經保護功能。

1 張寶麗，范小璇，趙曉平.健腦益智膠囊對基底節區腦出血術后的療效觀察〔J〕.陜西中醫學院學報，2007；30(5):10-1.

2 范小璇，趙曉平，梁格婷.健腦益智膠囊對外傷性腦出血患者IgG-CSF的影響〔J〕.中國中醫急癥，2011；20(10):1552-4.

3 周振國，范小璇，趙曉平，等.健腦益智膠囊對顱腦損傷大鼠血漿 NPY 含量的影響〔J〕.現代中西醫結合雜志，2012；21(31):3437-9.

4 暢 濤，趙曉平，周振國.健腦益智膠囊治療腦震蕩療效觀察〔J〕.遼寧中醫藥大學學報，2008；10(11):120-1.

5 趙曉平，呂 楊，范小璇，等.健腦益智膠囊提取工藝研究〔J〕.陜西中醫學院學報，2013；36(5):83-5.

6 郭東艷，覃鴻恩，趙曉平，等.健腦益智膠囊水提部位精制工藝研究〔J〕.陜西中醫學院學報，2014；37(5)：66-9.

7 楊偉平，郭東艷，覃鴻恩，等.殼聚糖澄清劑對健腦益智膠囊水提部位的純化工藝研究〔J〕.現代中醫藥，2014;34(6)：70-2.

8 郭東艷，覃鴻恩，趙曉平，等.ZrO2無機陶瓷膜微濾技術精制健腦益智膠囊水提部位的研究〔J〕.現代中醫藥，2014；34(5)：69-72.

9 袁立霞.當歸拈痛湯對類風濕性關節炎作用機理及配伍的實驗研究〔D〕.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2006.

10 王 軍，張紅霞，賈士奇，等.生姜對全腦缺血再灌注大鼠腦組織炎性細胞因子和黏附分子含量的影響〔J〕.醫藥論壇雜志,2011；32(15):12-4,18.

11 劉永剛,李芳君,王 婧,等.銀杏內酯B對大鼠腦缺血-再灌注損傷炎癥反應的影響〔J〕.中藥材，2010；33(4)：578-80.

〔2015-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

陜西省科技廳資助項目(No.2011KTCL03-02)

郭東艷(1973-)，女，教授，博士，主要從事中藥提取工藝及其藥效學研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)03-0538-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.007

1 陜西中醫學院附屬醫院