環氧合酶-2選擇性抑制劑塞來昔布防治大鼠創傷性異位骨化的機制

曾榮東 柳明忠 陳巧鳳 陳小青 許志通 張志珊 鄭錦陽 連 濤

(福建醫科大學附屬泉州市第一醫院骨科，福建 泉州 362000)

環氧合酶-2選擇性抑制劑塞來昔布防治大鼠創傷性異位骨化的機制

曾榮東 柳明忠 陳巧鳳 陳小青 許志通 張志珊1鄭錦陽2連 濤3

(福建醫科大學附屬泉州市第一醫院骨科，福建 泉州 362000)

目的 探究環氧合酶(Cox)-2選擇性抑制劑塞來昔布對大鼠創傷性異位骨化的防治機制。方法 創傷性異位骨化大鼠予塞來昔布治療，分別采取喂食2、6、10 w的不同方案，治療后觀察各組肢體的皮溫、腫脹程度及X線表現，并通過實時定量PCR及Western印跡實驗，檢測跟腱組織骨形態發生蛋白(BMP)-4的表達含量。結果 塞來昔布組皮溫、腫脹程度、新骨形成均顯著低于對照(生理鹽水處理)組(P<0.05)。同時，隨著塞來昔布處理時間的延長，皮溫均明顯降低、腫脹程度及新骨形成情況均明顯減輕；實時定量PCR及Western印跡檢測顯示：與對照組比較，塞來昔布組跟腱組織BMP-4的表達明顯下調，并且隨時間的延長，BMP-4的表達也相應下調。結論 塞來昔布可通過降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達以干預異位骨化。

塞來昔布；異位骨化；骨形態發生蛋白(BMP)-4

異位骨化(HO)是一種非腫瘤性反應性病變，病理特征表現為局部纖維組織增生、鈣化及化生，伴有異位新骨形成〔1〕，可導致該關節活動受限、強直、功能喪失。基因和自由基清除劑治療還沒有應用于臨床，有待進一步的深入研究〔2〕。非甾體類抗炎藥(NSAIDs)是目前臨床公認的預防HO最有效的藥物，但是約30%的患者因胃腸道反應而不能耐受〔3〕。有研究發現選擇性環氧合酶 (Cox)-2抑制劑，如塞來昔布、美洛昔康等用于預防HO同樣有效，且胃腸道反應小〔4〕。間充質細胞和骨形態發生蛋白(BMP)是誘導HO的主要活性介質〔5〕。林霖〔6〕直接注射骨形態發生蛋白(BMP)-4重組腺病毒在裸鼠肌肉內成功誘導HO，提示BMP-4與HO發生關系密切。本研究探討COX-2選擇性抑制劑預防大鼠HO的作用及使用療程。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、試劑 60只SD級體重(100±10)g大鼠，雌雄各半，隨機分為6組各10只，均購于上海斯萊克動物實驗中心。塞來昔布(美國Gibco輝瑞公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒，蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑(碧云天公司)，多克隆抗體(美國Santa公司)。

1.2 創傷性HO模型制備 大鼠以2%氯胺酮80～100 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上，手術區域脫毛，碘伏消毒手術部位，無菌手術刀片沿大鼠右跟腱縱行切開1 cm皮膚切口，顯露跟腱止點，垂直切口方向橫行切斷近止點部跟腱，術后全層縫合切口。

1.3 治療 術后第1天開始給藥，塞來昔布各亞組予塞來昔布10 mg·kg-1·d-1喂食2、6、10 w，對照組各亞組喂食2 ml生理鹽水2、6、10 w。各組均每天灌胃1次，術后第1周隔天觀察1次，1 w后每周觀察1次。

1.4 治療結果評定 ①在術后第10周后觀察各組肢體的皮溫、腫脹程度，并在麻醉狀態下攝右后肢側位X 線片，觀察新骨形成情況。皮溫計平均值。腫脹程度：腫脹位于損傷點計1分，位于膝關節計2分，位于膝關節以上計3分，無腫脹計0分；新骨情況：有計1分，無計0分。②在術后第10周檢測各組跟腱組織BMP-4含量。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測BMP-4含量 0.25%胰蛋白酶收集大鼠跟腱組織，加入適量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min離心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水，存于-70℃。提取總RNA反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR。反應條件：95℃預變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40個循環，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進行相對定量分析，檢測BMP-4的表達含量，GAPDH為內參。

1.6 Western印跡檢測樣本BMP-4含量 收集大鼠跟腱組織，提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度；取等量蛋白上樣電泳，轉膜，封閉，加入抗大鼠BMP-4，4℃孵育過夜；37℃二抗(山羊抗小鼠IgG)孵育1 h后，電化學發光(ECL)顯色；GAPDH作為內參。一抗：GAPDH配置比例為1∶10 000，BMP-4為1∶200；二抗，GAPDH配置比例為1∶10 000、BMP-4為1∶5 000。蛋白表達含量采取Biomad Western分析儀自動分析。

1.7 統計學方法 應用Graph Pad6.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 HO特異性指標 塞來昔布組皮溫、腫脹程度、新骨形成均顯著低于對照組(P<0.05)。同時，隨著處理時間延長，皮溫均明顯降低、腫脹程度及新骨形成情況均明顯減輕(P<0.05)，但對照組三個指標卻未見明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.2 各組跟腱組織BMP-4蛋白和mRNA水平比較 相比于對照組，塞來昔布組2、6、10 w跟腱組織BMP-4蛋白和mRNA水平明顯下調(P<0.05)；并且隨著時間的延長，BMP-4蛋白和mRNA水平也相應下調。見表2，圖1。

表1 塞來昔布可明顯干預大鼠異位性骨化(n=10)

與對照組比較：1)P<0.05

表2 各組跟腱組織BMP-4的表達

圖1 各組BMP-4表達

3 討 論

HO是一種非腫瘤性反應性病變，病理特征表現為局部纖維組織增生、鈣化及化生，伴有異位新骨形成〔1〕。臨床上肘、髖關節外傷后經過治療，后期常出現創傷性HO，導致該關節活動受限、強直、功能喪失。目前研究認為其發生機制是在創傷和手術刺激時，局部產生出血、滲出和炎癥細胞浸潤，再在各類活性細胞和骨生長因子的共同參與下，通過軟骨內化骨或膜內化骨的誘導，血腫逐漸機化為骨組織，影響肌肉收縮的功能，導致關節僵硬〔1〕。臨床上主要采用的防治方法有NSAIDs、放射治療、二鹽酸鹽類藥物、手術切除、物理治療、自由基清除劑、基因治療等。因放療的副作用較多，二磷酸鹽長期使用可導致骨質軟化，一旦停藥又易形成“反跳性骨化”。手術治療應用于較嚴重的HO。而對于物理治療，部分學者認為可能會加重骨化。基因和自由基清除劑治療還沒有應用于臨床，有待深入研究〔2〕。因此，NSAIDs是目前臨床公認的預防HO最有效的藥物。Fijn等〔3〕研究指出NSAIDs能使全髖關節置換術后HO的發生率降低50%，使臨床癥狀明顯的HO降至0%～2%。目前，臨床常用的預防HO的藥物是吲哚美辛，其用藥時間為2～6 w，強調在術后1～2 d開始給藥；如果術后5～7 d開始給藥，則不能阻止HO形成。但是約30%的患者因胃腸道反應而不能完成療程〔4〕。臨床常規用藥時間為2～6 w，但文獻報道，從2～12 w均有應用〔2〕，吳江〔7〕發現按照塞來昔布10 mg/kg劑量給予10 w能有效降低大鼠HO。

間充質細胞和BMP是誘導HO的主要活性介質〔8〕。脫鈣的骨基質可以誘導HO，BMP是真正的誘導物〔9〕，其中BMP-4在遺傳型HO和創傷后HO形成中起重要作用〔10〕。向孝兵〔11〕在證實清化散對創傷性HO大鼠BMP-4的影響中，將口服塞來昔布(西樂葆)作為對照組，結果顯示口服西樂葆會降低BMP-4的含量，但造模后18 d才服藥，與以往報道〔12〕不同。本研究提示塞來昔布可通過下調BMP-4分子以干預大鼠HO的機制。

1 陳 銳.創傷性異位骨化臨床治療研究進展〔J〕.中醫臨床研究，2011；3(13)：113-4.

2 閔紅巍.異位骨化預防與治療的新進展〔J〕.中國康復理論與實踐，2010；19(10)：250-3.

3 Fijn R，Koorevaar RT，Brouwers JR.Prevention of heterotopic ossification after total hip replacement with NSAIDs〔J〕.Pharm Word Sci，2003；25(4)：138-45.

4 朱仕文.吲哚美辛預防髖臼骨折術后異位骨化的臨床研究〔J〕.中華創傷骨科雜志，2006；8(7)：613-6.

5 徐步國.選擇性COX-2抑制劑和非選擇性COX-1和COX-2抑制劑在預防全髖關節置換術后異位骨化的Meta分析〔J〕.中國骨傷，2014；27(7)：609-14.

6 林 霖.骨形態發生蛋白4、脫鈣骨基質和切斷跟腱誘導的異位骨化動物模型的研究〔J〕.中國運動醫學雜志，2008；27(4)：408-11.

7 吳 江.選擇性與非選擇性環氧化酶2抑制劑預防大鼠跟腱異位骨化的實驗研究〔J〕.中國修復重建外科雜志，2014；28(3)：371-2.

8 Okayama A，Futani H，Kyo F，etal.Usefulness of ultrasonography for early recurrent myositis ossificans〔J〕.J Orthop Sci，2003；8(2)：239-42.

9 Aoki H，Fujii M，Imamura T,etal.Synergistic effects of different bone mohogenetic protein type Ⅰ receptors on alkaline phosphatase induction〔J〕.J Cell Sci，2001；114(Pt 81)：1483-8.

10 Shafritz A，Kaplan F.Differential expression of bone and cartilage related genes in fibrodysplasia ossificans progressiva，myositis ossificans traumatica and osteogenic arcoma〔J〕.Clin Orthop，1998；346：46-52.

11 向孝兵.清化散對創傷 性異位骨化模型大鼠BMP-4 的影響〔J〕.遼寧中醫藥大學學報，2010；12(10)：25-8.

12 葉勇光.兩種異位骨化造模方法的比較研究〔J〕.中國中醫骨傷科雜志，2010；18(2)：9-11.

〔2015-04-11修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省自然科學基金資助項目(No.2016J01610)

曾榮東(1970-)，男，副主任醫師，主要從事骨科疾病研究。

R683.13

A

1005-9202(2017)03-0540-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.008

1 檢驗科 2 病理科 3 影像科