參苓白術散治療大鼠脾虛濕困型潰瘍性結腸炎的機制

周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫學高等專科學校生理教研室，安徽 合肥 230601)

參苓白術散治療大鼠脾虛濕困型潰瘍性結腸炎的機制

周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫學高等專科學校生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的 探討參苓白術散對脾虛濕困型潰瘍性結腸炎(UC)大鼠結腸平滑肌細胞上鈣池調控的鈣離子通道(SOC)介導的Ca2+內流變化的影響及可能機制。方法 64只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術散組， 每組16只。首先復制脾虛濕困型UC大鼠模型；采用fura-2熒光測定各組細胞外Ca2+內流的變化；用生物信號采集系統記錄各組結腸平滑肌收縮張力的變化；用免疫組織化學的方法觀察各組結腸平滑肌上瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)1蛋白質表達情況。結果 ①在無鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i低于正常對照組(P<0.05)。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，模型組低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術散組均高于模型組(P<0.05)。②模型組結腸平滑肌張力低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術散組張力高于模型組(P<0.05)。③各組結腸平滑肌上均有TRPC1細胞表達，其中模型組結腸組織TRPC1表達的平均光密度低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺嘧啶組和參苓白術散組高于模型組(P<0.05)。結論 參苓白術散通過促進SOC介導的Ca2+內流治療脾虛濕困型UC，其分子實質是上調TRPC1的表達。

參苓白術散；鈣通道；脾虛濕困；潰瘍性結腸炎

潰瘍性結腸炎(UC)主要侵及結腸黏膜，是一種慢性非特異性炎性疾病，多首發于左半結腸，常呈進行性加重累及結腸近端及全結腸〔1〕。目前西醫對于本病的治療，一般多采取以水楊酸類藥物、激素、免疫抑制劑等為主的藥物治療〔2〕。由于作用局限，毒副作用大，病人難以堅持治療。國內多采用中醫藥進行干預〔3〕。中醫治療常采用參苓白術散，具有健脾滲濕之效，取得了良好的效果。研究證實，在結腸平滑肌上鈣池調控鈣離子通道(SOC)有瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)1的表達〔4〕。本研究探討參苓白術散對脾虛濕困型UC大鼠結腸平滑肌中SOC介導Ca2+內流變化的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級Wistar大鼠64只， 雌雄均可，體質量(210±20)g，隨機分為正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術散組，每組 16只，室溫控制 在18℃～25℃， 大鼠適應性常規喂養3 d。參苓白術散水煎液組方嚴格按照《藥典》執行；柳氮磺吡啶腸溶片購自上海信誼嘉華藥業有限公司。 主要試劑和儀器：TRPC1 IgG兔抗人多克隆抗體(美國生物科技公司)、二抗試劑盒PV-6000 (北京欣興唐生物科技有限公司)、恒溫干燥箱(上海火諾電爐設備有限公司)、電子天平(常州市宏衡電子儀器廠)、生物信號采集系統(安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司)。960MC-熒光分光光度計(上海現科分光儀器有限公司) 。

1.2 脾虛濕困型UC大鼠模型制備 借鑒環境與飲食干預聯合2，4，6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)/乙醇灌腸法,每天保證大鼠在2 cm深的水中和有效睡眠時間均為8 h。單雙日不規律飲食，造成脾胃功能失調。如單日禁食, 只灌服4℃生理鹽水2 ml，雙日則保證充足飼料供給，并灌服4 ml豬油，此種干預方式連續3 w。 在最后1 d,大鼠禁食不禁水, 用10%水合氯醛麻醉,然后將TNBS與乙醇混合物注入肛門上段, 隨即將大鼠頭部向下持續倒置約60 s，保證溶液進入大鼠腸腔內,待自然清醒后自由飲食。

1.3 干預措施 正常對照組：常規飼養，每日灌胃生理鹽水2 ml。并參照造模方法給予肛門灌腸相同劑量的生理鹽水。 模型組：常規飼養，每日灌胃生理鹽水2 ml。參苓白術散組：參苓白術散煎劑灌胃，劑量為12 g·kg-1·d-1。柳氮磺吡啶組：柳氮磺吡啶灌胃，劑量為0.5 g·kg-1·d-1,均連續14 d。

1.4 平滑肌〔Ca2+〕i的變化 采用酶解法并結合密度離心法分離4組(每組選6只)結腸平滑肌細胞(SMC),制備新鮮結腸SMC懸液，通過錐蟲藍排斥試驗，證明細胞成活率≥90%。標記fura-2熒光染料后，將細胞懸液分別置于無鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，并分別向其中加入1 μmol/L毒胡蘿卜內酯sigargin預處理30 min，然后再引入濃度分別為1.5和3.0 mmol/L的含鈣HEPES緩沖液，從而引起的細胞內Ca2+上升被認為是SOC功能的一個指標，定義為〔Ca2+〕i。

1.5 結腸平滑肌收縮張力的變化 每組6只大鼠擊頭致昏后，立即進行解剖，暴露腹腔后，在距肛門約5 cm處采集一段約2 cm的結腸，放入4℃Krebs液中，并持續通入混有95%O2和5% CO2的氣體。去除腸管黏膜層后沿縱向肌制備成規格為10 mm×5 mm的肌條標本，兩端用手術線扎牢后將其置入含有37℃ Krebs 液的恒溫浴槽中，用95% O2和5% CO2混合氣體飽和。標本兩端分別固定在浴槽底部和張力換能器上。收縮張力信號通過后者與生理記錄儀相連，并通過電腦顯示出來。標本前負荷為0.5 g，每20 min換液一次，平衡1 h后，將結腸平滑肌條置于無鈣Krebs溶液中，并分別用1 μmol/L毒胡蘿卜內酯預處理35 min，然后再加入含2.5 mmol鈣Krebs溶液，所引起的張力幅度的明顯增加，即由SOC介導的Ca2+內流所致。

1.6 結腸平滑肌TRPC1蛋白質表達情況 每組處死4只大鼠，開腹，截取距大鼠肛門約5 cm處的結腸組織，然后放入10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切成約5 μm 的組織薄片，常規脫蠟，采用非生物素二步法免疫組化檢測試劑盒(PV6001)測定TRPC1蛋白的表達。分別滴加一抗和二抗，其中一抗濃縮型TPRC1 IgG兔抗人多克隆抗體工作濃度為1∶300,二抗采取的是通用型二抗PV-6000，顯色后脫水、封片，用光鏡觀察，采集圖像，并計算每100個細胞中的平均光密度。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行多組間單向方差分析，兩兩比較LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組平滑肌〔Ca2+〕i的變化 在無鈣HEPES緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i明顯較正常對照組低。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，各組〔Ca2+〕i均有所增加，與正常對照組相比，模型組較低(P<0.05)。與模型組相比，柳氮磺吡啶組與參苓白術散組較高(P<0.05)。柳氮磺吡啶組與參苓白術散無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組不同緩沖液中平滑肌〔Ca2+〕i的變化

組別無鈣HEPES含鈣HEPES(1.5mmol/L)含鈣HEPES(3.0mmol/L)正常對照組269.34±5.45403.32±9.671002.55±7.65模型組150.54±2.121)368.34±12.231)723.33±6.651)柳氮磺吡啶組265.23±12.542)398.34±8.572)993.65±5.602)參苓白術散組268.32±10.432)405.45±9.592)998.65±5.602)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組結腸平滑肌收縮張力的變化 模型組結腸平滑肌張力〔(40.22±23.31)mN/mm2〕比正常對照組〔(90.01±12.35)mN/mm2〕低(P<0.05);柳氮磺吡啶組〔(88.23±19.34)mN/mm2〕與參苓白術散組〔(89.83±17.54)mN/mm2〕較模型組高(P<0.05)。

2.3 各組結腸平滑肌TRPC1蛋白表達情況 結腸平滑肌中TRPC1的陽性細胞多表達于細胞核或細胞質內，多呈棕黃色或褐色表達。模型組結腸組織TRPC1表達的平均觀密度較正常對照組低(P<0.05)，柳氮磺嘧啶組和參苓白術散組比模型組高(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組結腸平滑肌TRPC1蛋白表達(SP，×400)表2 各組結腸平滑肌TRPC1蛋白表達平均 光密度比較

組別陽性細胞數平均光密度正常對照組21.45±4.670.791±0.079模型組12.34±5.231)0.412±0.0251)柳氮磺吡啶組19.34±5.242)0.785±0.0842)參苓白術散組18.57±2.592)0.779±0.0752)

3 討 論

UC一般以慢性復發型居多，病變大多局限，經治療預后較好。小于20歲或超過60歲的患者由于病情癥狀較重，病變范圍廣，若不及時治療，具有極高的致死率〔5〕。然而，UC的臨床癥狀并不典型，常錯過最佳治療時機，且病程超過10年以上者，具有極高的癌變可能〔6〕。關于的UC的發病機制尚未闡明，目前認為其與感染、免疫、遺傳等因素有關，治療上多采用消炎、免疫抑制等療法〔7〕。中醫學里并無UC一說，本病在中醫領域屬于“大瘕泄”范疇〔8〕，目前臨床分型尚無統一標準，多認為脾虛濕盛為本病的發病關鍵，所以治療上也以健脾滲濕為主則〔9〕。鈣通道參與大鼠遠端結腸平滑肌收縮〔10〕。UC發病時腸道動力紊亂與SOC介導的Ca2+內流下降有一定的相關性。在結腸平滑肌細胞上，胞內鈣庫耗竭后才可激活細胞膜上兩種Ca2+通道〔11〕，即L-型Ca2+通道和SOC。為排除L-型Ca2+通道對本文結果的干擾，把新鮮結腸平滑肌細胞懸液分別置于無鈣HEPES緩沖液中，并分別預處理后再引入含鈣HEPES緩沖液，導致的細胞內Ca2+上升即被認為是反映SOC通道功能的一個指標。本實驗提示脾虛濕盛型UC大鼠的結腸平滑肌收縮力下降的確與SOC介導的Ca2+內流減少有關。本文再次佐證鈣通道參與大鼠遠端結腸平滑肌收縮。由SOC介導的Ca2+內流是胃腸道平滑肌對許多激素或遞質生理反應的一部分〔12～14〕，平滑肌收縮性下降可能與SOC功能低下有關。通過調節細胞內Ca2+濃度可以治療炎癥性腸病所致的黏膜出血，并愈合黏膜表面創口〔15〕。Yang等〔16〕探討TRPA1 通道是否參與冷刺激引起的大鼠結腸平滑肌收縮及其可能機制，通過逆轉錄聚合酶鏈反應發現在大鼠升結腸和降結腸的平滑肌層均有TRPA1的mRNA表達。本文結果提示脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織TPRC1表達明顯減弱，而經過柳氮磺嘧啶和參苓白術散治療可顯著增強其TRPC1的表達水平。

綜上，脾虛濕盛型UC大鼠的結腸平滑肌收縮力下降與SOC通道介導的Ca2+內流減少有關，其分子實質是TRPC1的下調。而參苓白術散可能上調TRPC1的表達水平。

1 Ho GT，Boyapati R，Satsangi J.Ulcerative colitis〔J〕.Medicine，2015；43(5)：276-81.

2 Rogler G.Chronic ulcerative colitis and colorectal cancer〔J〕.Cancer Lett，2014；345(2)：235-41.

3 龍再菊，關露春.參苓白術散加味治療潰瘍性結腸炎臨床觀察〔J〕.遼寧中醫藥大學學報，2014；16(3)：173-4.

4 Kassan M，Zhang W，Aissa KA，etal.Differential role for stromal interacting molecule 1 in the regulation of vascular function〔J〕.Pflügers Arch Eur J Physiol，2015；467(6)：1195-202.

5 Willenbucher RF，Zelman SJ，Ferrell LD，etal.Chromosomal alterations in ulcerative colitis-related neoplastic progression〔J〕.Gastroenterology，2014；113(3)：791-801.

6 Dulai PS，Mosli M，Khanna R，etal.Vedolizumab for the treatment of moderately to severely active ulcerative colitis〔J〕.Pharmacotherapy，2015；35(4)：412-23.

7 Macken L，Blaker PA.Management of acute severe ulcerative colitis (NICE CG 166)〔J〕.Clin Med，2015；15(5)：473-6.

8 辛 群，孫 擎，葛現才，等.參苓白術散與美沙拉嗪對潰瘍性結腸炎患者血清IL-17、IL-23及TNF-α水平的影響〔J〕.現代生物醫學進展，2015；15(9)：1663-5.

9 穆麗萍，肖 明.參苓白術散治療潰瘍性結腸炎長期應用的療效與安全性〔J〕.遼寧中醫雜志，2016；43(2)：309-11.

10 柯道平，周 華，李忠穩，等.庫容性Ca2+內流介導大鼠遠端結腸平滑肌收縮〔J〕.中國藥理學通報，2006；22(3)：344-8.

11 楊 勇.鈣庫操縱的鈣內流在老年動物平滑肌細胞中的改變及其對收縮功能的影響〔D〕.合肥：安徽醫科大學，2015.

12 Peng G，Li S，Hong W，etal.Corrigendum：chronic hypoxia increases intracellular Ca2+concentration via enhanced Ca2+entry through receptor-operated Ca2+channels in pulmonary venous smooth muscle cells〔J〕.Circ J，2015；79(9)：2058-68.

13 Yan M，Peng Z，Jie L，etal.Epoxyeicosatrienoic acids act through TRPV4-TRPC1-K Ca 1.1 complex to induce smooth muscle membrane hyperpolarization and relaxation in human internal mammary arteries〔J〕.Biochim Biophys Acta，2015；1852(3)：552-9.

14 Cully TR，Choi RH，Shannon TR，etal.Ryanodine receptor activity regulates the levels of Ca2+extrusion and store-operated Ca2+entry in skeletal muscle〔J〕.Biophys J，2016；110(3)：183.

15 Magro CG，Recio LE.Fit model between participation statement of exhibitors and visitors to improve the exhibition performance〔J〕.Intangible Capital，2015；11(2)：234-44.

16 董 楊，石海蓮，施建蓉，等.瞬時感受器電位A1通道參與冷刺激引起的離體大鼠結腸平滑肌收縮〔J〕.生理學報，2010；62(4)：349-56.

〔2015-07-19修回〕

(編輯 苑云杰)

安徽省優秀青年人才基金重點項目(No.2013SQRL118ZD)

周 華(1979-)，女，碩士，講師，主要從事消化道生理與藥理研究。

R965

A

1005-9202(2017)03-0547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.011