參苓白術(shù)散治療大鼠脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制

周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生理教研室，安徽 合肥 230601)

參苓白術(shù)散治療大鼠脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制

周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的 探討參苓白術(shù)散對(duì)脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上鈣池調(diào)控的鈣離子通道(SOC)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流變化的影響及可能機(jī)制。方法 64只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術(shù)散組， 每組16只。首先復(fù)制脾虛濕困型UC大鼠模型；采用fura-2熒光測(cè)定各組細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的變化；用生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄各組結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化；用免疫組織化學(xué)的方法觀察各組結(jié)腸平滑肌上瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(TRPC)1蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果 ①在無(wú)鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i低于正常對(duì)照組(P<0.05)。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，模型組低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組均高于模型組(P<0.05)。②模型組結(jié)腸平滑肌張力低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組張力高于模型組(P<0.05)。③各組結(jié)腸平滑肌上均有TRPC1細(xì)胞表達(dá)，其中模型組結(jié)腸組織TRPC1表達(dá)的平均光密度低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而柳氮磺嘧啶組和參苓白術(shù)散組高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 參苓白術(shù)散通過(guò)促進(jìn)SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流治療脾虛濕困型UC，其分子實(shí)質(zhì)是上調(diào)TRPC1的表達(dá)。

參苓白術(shù)散；鈣通道；脾虛濕困；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)主要侵及結(jié)腸黏膜，是一種慢性非特異性炎性疾病，多首發(fā)于左半結(jié)腸，常呈進(jìn)行性加重累及結(jié)腸近端及全結(jié)腸〔1〕。目前西醫(yī)對(duì)于本病的治療，一般多采取以水楊酸類(lèi)藥物、激素、免疫抑制劑等為主的藥物治療〔2〕。由于作用局限，毒副作用大，病人難以堅(jiān)持治療。國(guó)內(nèi)多采用中醫(yī)藥進(jìn)行干預(yù)〔3〕。中醫(yī)治療常采用參苓白術(shù)散，具有健脾滲濕之效，取得了良好的效果。研究證實(shí)，在結(jié)腸平滑肌上鈣池調(diào)控鈣離子通道(SOC)有瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(TRPC)1的表達(dá)〔4〕。本研究探討參苓白術(shù)散對(duì)脾虛濕困型UC大鼠結(jié)腸平滑肌中SOC介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流變化的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級(jí)Wistar大鼠64只， 雌雄均可，體質(zhì)量(210±20)g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術(shù)散組，每組 16只，室溫控制 在18℃～25℃， 大鼠適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)3 d。參苓白術(shù)散水煎液組方嚴(yán)格按照《藥典》執(zhí)行；柳氮磺吡啶腸溶片購(gòu)自上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司。 主要試劑和儀器：TRPC1 IgG兔抗人多克隆抗體(美國(guó)生物科技公司)、二抗試劑盒PV-6000 (北京欣興唐生物科技有限公司)、恒溫干燥箱(上海火諾電爐設(shè)備有限公司)、電子天平(常州市宏衡電子儀器廠)、生物信號(hào)采集系統(tǒng)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。960MC-熒光分光光度計(jì)(上海現(xiàn)科分光儀器有限公司) 。

1.2 脾虛濕困型UC大鼠模型制備 借鑒環(huán)境與飲食干預(yù)聯(lián)合2，4，6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)/乙醇灌腸法,每天保證大鼠在2 cm深的水中和有效睡眠時(shí)間均為8 h。單雙日不規(guī)律飲食，造成脾胃功能失調(diào)。如單日禁食, 只灌服4℃生理鹽水2 ml，雙日則保證充足飼料供給，并灌服4 ml豬油，此種干預(yù)方式連續(xù)3 w。 在最后1 d,大鼠禁食不禁水, 用10%水合氯醛麻醉,然后將TNBS與乙醇混合物注入肛門(mén)上段, 隨即將大鼠頭部向下持續(xù)倒置約60 s，保證溶液進(jìn)入大鼠腸腔內(nèi),待自然清醒后自由飲食。

1.3 干預(yù)措施 正常對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水2 ml。并參照造模方法給予肛門(mén)灌腸相同劑量的生理鹽水。 模型組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水2 ml。參苓白術(shù)散組：參苓白術(shù)散煎劑灌胃，劑量為12 g·kg-1·d-1。柳氮磺吡啶組：柳氮磺吡啶灌胃，劑量為0.5 g·kg-1·d-1,均連續(xù)14 d。

1.4 平滑肌〔Ca2+〕i的變化 采用酶解法并結(jié)合密度離心法分離4組(每組選6只)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(SMC),制備新鮮結(jié)腸SMC懸液，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排斥試驗(yàn)，證明細(xì)胞成活率≥90%。標(biāo)記fura-2熒光染料后，將細(xì)胞懸液分別置于無(wú)鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，并分別向其中加入1 μmol/L毒胡蘿卜內(nèi)酯sigargin預(yù)處理30 min，然后再引入濃度分別為1.5和3.0 mmol/L的含鈣HEPES緩沖液，從而引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+上升被認(rèn)為是SOC功能的一個(gè)指標(biāo)，定義為〔Ca2+〕i。

1.5 結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化 每組6只大鼠擊頭致昏后，立即進(jìn)行解剖，暴露腹腔后，在距肛門(mén)約5 cm處采集一段約2 cm的結(jié)腸，放入4℃Krebs液中，并持續(xù)通入混有95%O2和5% CO2的氣體。去除腸管黏膜層后沿縱向肌制備成規(guī)格為10 mm×5 mm的肌條標(biāo)本，兩端用手術(shù)線扎牢后將其置入含有37℃ Krebs 液的恒溫浴槽中，用95% O2和5% CO2混合氣體飽和。標(biāo)本兩端分別固定在浴槽底部和張力換能器上。收縮張力信號(hào)通過(guò)后者與生理記錄儀相連，并通過(guò)電腦顯示出來(lái)。標(biāo)本前負(fù)荷為0.5 g，每20 min換液一次，平衡1 h后，將結(jié)腸平滑肌條置于無(wú)鈣Krebs溶液中，并分別用1 μmol/L毒胡蘿卜內(nèi)酯預(yù)處理35 min，然后再加入含2.5 mmol鈣Krebs溶液，所引起的張力幅度的明顯增加，即由SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流所致。

1.6 結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白質(zhì)表達(dá)情況 每組處死4只大鼠，開(kāi)腹，截取距大鼠肛門(mén)約5 cm處的結(jié)腸組織，然后放入10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切成約5 μm 的組織薄片，常規(guī)脫蠟，采用非生物素二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV6001)測(cè)定TRPC1蛋白的表達(dá)。分別滴加一抗和二抗，其中一抗?jié)饪s型TPRC1 IgG兔抗人多克隆抗體工作濃度為1∶300,二抗采取的是通用型二抗PV-6000，顯色后脫水、封片，用光鏡觀察，采集圖像，并計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中的平均光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間單向方差分析，兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組平滑肌〔Ca2+〕i的變化 在無(wú)鈣HEPES緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i明顯較正常對(duì)照組低。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，各組〔Ca2+〕i均有所增加，與正常對(duì)照組相比，模型組較低(P<0.05)。與模型組相比，柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組較高(P<0.05)。柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同緩沖液中平滑肌〔Ca2+〕i的變化

組別無(wú)鈣HEPES含鈣HEPES(1.5mmol/L)含鈣HEPES(3.0mmol/L)正常對(duì)照組269.34±5.45403.32±9.671002.55±7.65模型組150.54±2.121)368.34±12.231)723.33±6.651)柳氮磺吡啶組265.23±12.542)398.34±8.572)993.65±5.602)參苓白術(shù)散組268.32±10.432)405.45±9.592)998.65±5.602)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化 模型組結(jié)腸平滑肌張力〔(40.22±23.31)mN/mm2〕比正常對(duì)照組〔(90.01±12.35)mN/mm2〕低(P<0.05);柳氮磺吡啶組〔(88.23±19.34)mN/mm2〕與參苓白術(shù)散組〔(89.83±17.54)mN/mm2〕較模型組高(P<0.05)。

2.3 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)情況 結(jié)腸平滑肌中TRPC1的陽(yáng)性細(xì)胞多表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，多呈棕黃色或褐色表達(dá)。模型組結(jié)腸組織TRPC1表達(dá)的平均觀密度較正常對(duì)照組低(P<0.05)，柳氮磺嘧啶組和參苓白術(shù)散組比模型組高(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)(SP，×400)表2 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)平均 光密度比較

組別陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均光密度正常對(duì)照組21.45±4.670.791±0.079模型組12.34±5.231)0.412±0.0251)柳氮磺吡啶組19.34±5.242)0.785±0.0842)參苓白術(shù)散組18.57±2.592)0.779±0.0752)

3 討 論

UC一般以慢性復(fù)發(fā)型居多，病變大多局限，經(jīng)治療預(yù)后較好。小于20歲或超過(guò)60歲的患者由于病情癥狀較重，病變范圍廣，若不及時(shí)治療，具有極高的致死率〔5〕。然而，UC的臨床癥狀并不典型，常錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，且病程超過(guò)10年以上者，具有極高的癌變可能〔6〕。關(guān)于的UC的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為其與感染、免疫、遺傳等因素有關(guān)，治療上多采用消炎、免疫抑制等療法〔7〕。中醫(yī)學(xué)里并無(wú)UC一說(shuō)，本病在中醫(yī)領(lǐng)域?qū)儆凇按箴埂狈懂牎?〕，目前臨床分型尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多認(rèn)為脾虛濕盛為本病的發(fā)病關(guān)鍵，所以治療上也以健脾滲濕為主則〔9〕。鈣通道參與大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮〔10〕。UC發(fā)病時(shí)腸道動(dòng)力紊亂與SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流下降有一定的相關(guān)性。在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上，胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭后才可激活細(xì)胞膜上兩種Ca2+通道〔11〕，即L-型Ca2+通道和SOC。為排除L-型Ca2+通道對(duì)本文結(jié)果的干擾，把新鮮結(jié)腸平滑肌細(xì)胞懸液分別置于無(wú)鈣HEPES緩沖液中，并分別預(yù)處理后再引入含鈣HEPES緩沖液，導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+上升即被認(rèn)為是反映SOC通道功能的一個(gè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)提示脾虛濕盛型UC大鼠的結(jié)腸平滑肌收縮力下降的確與SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少有關(guān)。本文再次佐證鈣通道參與大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮。由SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是胃腸道平滑肌對(duì)許多激素或遞質(zhì)生理反應(yīng)的一部分〔12～14〕，平滑肌收縮性下降可能與SOC功能低下有關(guān)。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可以治療炎癥性腸病所致的黏膜出血，并愈合黏膜表面創(chuàng)口〔15〕。Yang等〔16〕探討TRPA1 通道是否參與冷刺激引起的大鼠結(jié)腸平滑肌收縮及其可能機(jī)制，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)在大鼠升結(jié)腸和降結(jié)腸的平滑肌層均有TRPA1的mRNA表達(dá)。本文結(jié)果提示脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織TPRC1表達(dá)明顯減弱，而經(jīng)過(guò)柳氮磺嘧啶和參苓白術(shù)散治療可顯著增強(qiáng)其TRPC1的表達(dá)水平。

綜上，脾虛濕盛型UC大鼠的結(jié)腸平滑肌收縮力下降與SOC通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少有關(guān)，其分子實(shí)質(zhì)是TRPC1的下調(diào)。而參苓白術(shù)散可能上調(diào)TRPC1的表達(dá)水平。

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〔2015-07-19修回〕

(編輯 苑云杰)

安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013SQRL118ZD)

周 華(1979-)，女，碩士，講師，主要從事消化道生理與藥理研究。

R965

A

1005-9202(2017)03-0547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.011