慢病毒表達系統(tǒng)介導的RNAi技術靶向沉默Bi-1基因對鼻咽癌細胞生物學特性的影響

皮 文 于長華 劉志標

(淮安市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 淮安 223300)

慢病毒表達系統(tǒng)介導的RNAi技術靶向沉默Bi-1基因對鼻咽癌細胞生物學特性的影響

皮 文 于長華1劉志標

(淮安市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 淮安 223300)

目的 探討B(tài)i-1 基因的生物學功能及其與鼻咽癌發(fā)生與發(fā)展的相關性。方法 首先構建以Bi-1 為靶基因的RNA干擾(RNAi)質粒載體,采用慢病毒表達系統(tǒng)將其導入細胞，利用RNAi 技術在細胞內誘導特異序列的基因沉默以觀察對鼻咽癌細胞生長增殖的影響。結果 靶向Bi-1 沉默的慢病毒感染鼻咽癌細胞后能有效抑制細胞的生長增殖并誘導其凋亡，在熒光顯微鏡下可見經靶向Bi-1沉默的慢病毒處理后的鼻咽癌細胞呈現(xiàn)出細胞皺縮、核固縮、核斷裂等典型的凋亡細胞形態(tài)，而且DNA凝膠電泳圖譜呈現(xiàn)“梯狀”現(xiàn)象；此外，Bi-1 基因的沉默可有效地抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生長。結論 靶向沉默鼻咽癌細胞中的Bi-1表達，可抑制細胞生長增殖，并誘導細胞發(fā)生凋亡。

鼻咽癌；Bi-1；RNA干擾；慢病毒

細胞凋亡是由基因編程控制的一種細胞生理性死亡，是多細胞生物體維持正常生長、組織動態(tài)平衡等正常生理活動的需要〔1〕。細胞凋亡涉及體內代謝的多個分子、多條途徑，因此其發(fā)生機制和影響因素復雜多樣，迄今其機制并未完全清楚。Bi-1 基因作為細胞內的凋亡抑制基因，已被發(fā)現(xiàn)其在體內組織的表達隨著組織的發(fā)展而發(fā)生改變，說明Bi-1 基因的表達可能與細胞生長增殖密切相關〔2〕。本研究擬探討B(tài)i-1 基因與鼻咽癌細胞發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株、菌株和質粒：人鼻咽癌細胞株CNE-1、SUNE-1 和病毒包裝細胞293T 均由廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所保存，大腸桿菌E.coli XL-blue 為本研究所保存。慢病毒包裝系統(tǒng)包括一個轉移載體pLUNIG 和三個包裝載體pMDL-G/p-RRE，pRSV-REV 和pMK-VSVG。

主要試劑：Bi-1 山羊IgG 多克隆抗體，β-actin小鼠IgG 單克隆抗體，山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)，兔抗山羊IgG-HRP；ECL 試劑(Santa Cruz)；SS-PAGE 低分子量標準蛋白質(BIO-RAD)；瓊脂糖(Amresco)；PrimeScriptTMRT試劑盒Kit，SYBRR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR 試劑盒，限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ和CalⅠ，T4 DNA 連接酶(TaKaRa)；100 bp DNA marker，4，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)，聚偏氟丙烯(PVDF)膜(Sigma)；質粒抽提試劑盒(Giagen)；DNA ladder 檢測試劑盒(Merck)；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染鼻咽癌細胞 將含有Bi-1 干擾片段的慢病毒(lenti-shBi-1)和對照慢病毒(lenti-shLuc)分別感染CNE-1 和SUNE-1細胞。具體操作：按病毒滴度，在一個1.5 ml EP 管中加入適量的轉染病毒，并用培養(yǎng)基補充為100 μl后加入1 μl 100倍聚凝胺混勻，置室溫孵育5 min，加入到24孔板中培養(yǎng)的鼻咽癌細胞中；同時加入培養(yǎng)基(200 μl)與100倍聚凝胺(2 μl)的混合液，輕輕混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日更換為新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，感染48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光，并通過熒光細胞數(shù)推算病毒感染效率。

1.2.2 熒光定量 RT-PCR鑒定病毒感染鼻咽癌細胞中Bi-1的表達 具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行，相對定量實驗使用的分析方法為比較Ct值法。

1.2.3 Western印跡法鑒定病毒感染鼻咽癌細胞中Bi-1蛋白的表達 分別用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染2種鼻咽癌細胞株CNE-1和SUNE-1，感毒感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h 后收集細胞，以預冷至0℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2)洗滌2次，具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行，用Leica QWin圖像分析軟件進行光密度積分值(IOD)分析。每個圖像均重復分析3 次，取平均值。

1.2.4 噻唑藍比色實驗(MTT法)檢測細胞增殖能力 感染后，每孔1×103個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl，每組做5 個平行孔，同時設空白對照(僅加培養(yǎng)基)，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μl/孔的DMSO，室溫孵育10 min，脫色搖床上振蕩10 min，置酶標儀上于490 nm處測定各孔吸光度值(A490 nm)。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 DAPI熒光染色法檢測細胞形態(tài)學改變 分別用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 72 h后，盡可能棄去上清，用胰酶消化后，800 r/min 離心5 min收集細胞，用適量的75%乙醇進行固定，4℃固定10 min，吸取1滴加到載玻片上，加入1.0 μl的DAPI 染料，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變以區(qū)分出正常細胞與凋亡細胞并拍照。

1.2.6 凋亡細胞DNA ladder檢測 分別收集用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc 慢病毒感染72 h后的鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1，按照Merck公司的DNA ladder檢測試劑盒提取細胞DNA，具體實驗按說明書操作進行。

2 結 果

2.1 重組質粒 pU6-Bi-1-shRNA的PCR鑒定 經PCR擴增后，陽性克隆得到一條較對照組大82 bp的條帶，pU6-Bi-1-shRNA重組質粒成功構建。見圖1。

M:100 bp marker;1:陽性單克隆;2:pU6圖1 pU6-BI-1-shRNA重組質粒的 PCR鑒定

2.2 靶向 Bi-1沉默的慢病毒成功包裝 將含靶基因shRNA 的慢病毒轉移載體LunIG 與3 個病毒包裝載體pMDL-G/p-RRE、pRSV-REV 和pMK-VSVG 混勻并轉染293T 細胞后，可包裝產生兩種慢病毒，即含Bi-1shRNA 序列的慢病毒(lenti-shBi-1)和對照慢病毒(lenti-shLuc)。293T 細胞包裝產生的慢病毒，經梯度稀釋法測定得到病毒滴度。測定結果顯示，lenti-shBi-1 慢病毒的滴度為6.5×105TU/ml，對照組慢病毒(lenti-shLuc)滴度為4.3×106TU/ml，兩種病毒的滴度均能滿足實驗的需要。

2.3 慢病毒 lentivirus-shBi-1可明顯抑制鼻咽癌細胞 Bi-1的表達 將包裝產生的慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染CNE-1 和SUNE-1 細胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察到大多數(shù)細胞發(fā)出綠色熒光，結合可見光下的細胞總數(shù)，推算出病毒的轉染效率高達90%以上。熒光定量PCR結果顯示，用慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染CNE-1 和SUNE-1 細胞后，細胞中Bi-1 mRNA表達水平(0.048±0.014,0.092±0.010)顯著降低，與未處理組細胞(設為1)相比差異顯著(P<0.01)；而用慢病毒顆粒lentivirus shLuc 感染的細胞中Bi-1 mRNA 表達水平(1.063±0.044，1.063±0.044)與未處理組細胞相比基本上趨于一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 慢病毒感染后發(fā)綠色熒光的 CNE-1細胞(×100)

Western印跡檢測結果顯示，慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 72h后，細胞中Bi-1 的蛋白表達水平(0.108，0.167)顯著降低，與未處理組細胞(1.061，1.032)相比差異顯著(P<0.01)。而用慢病毒顆粒lentivirus-shLuc感染鼻咽癌細胞后，細胞中Bi-1 蛋白表達(0.998，1.087)與未處理組細胞相比沒有明顯改變。同時，根據(jù)各條帶的Bi-1 蛋白灰度值與β-actin 蛋白灰度值比率，可計算出lentivirus-shBi-1 感染的CNE-1 和SUNE-1 細胞中Bi-1 的表達率分別為10.2%和16.2%，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。說明慢病毒介導的siRNA(lentivirus-shBi-1)可以明顯抑制細胞中Bi-1 的表達，結果與熒光定量PCR的結果一致。見圖3。

1:CNE-1;2:CNE-1-shLuc;3:CNE-1-shBi-1;4:SUNE-1;5:SUNE-1-shLuc;6:SUNE-1-shBi-1圖3 Western印跡法檢測鼻咽癌細胞 CNE-1及SUNE-1中 Bi-1蛋白的表達

2.4 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌細胞 CNE-1和 SUNE-1的生長增殖 分別用不同病毒感染鼻咽癌CNE-1 和SUNE-1 后，不同處理的三組細胞的體外增殖能力差異顯著(P<0.01)。與未處理組細胞和lentivirus-shLuc 慢病毒處理組細胞相比，慢病毒lentivirus-shBi-1 處理的細胞生長增殖速度顯著減慢，表明干擾Bi-1 基因表達后抑制了鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 的體外增殖。見表1。

表1 lentivirus-shBi-1體外抑制鼻咽癌細胞的生長增殖

2.5 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌細胞 CNE-1和 SUNE-1凋亡 DAPI 細胞熒光染色結果顯示：分別用慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1和SUNE-1 細胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，包括胞體縮小、核固縮、核碎裂。而lentivirus-shLuc 慢病毒處理的鼻咽癌細胞中未見凋亡細胞的產生。DNA ladder 實驗結果顯示，慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1 和SUNE-1 細胞72 h后，在瓊脂糖凝膠電泳圖片上呈現(xiàn)出較明顯的“梯狀”條帶；但與DAPI 染色一樣，用lentivirus- shLuc 慢病毒處理的鼻咽癌細胞中未見DNA“梯狀”條帶的出現(xiàn)。見圖4，圖5。

圖4 DAPI 細胞熒光染色結果(×200)

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結果

3 討 論

基因治療是通過引入遺傳物質到特定的組織或細胞從而達到疾病治療的一種實驗性處理方法〔3〕。RNAi是一種定向基因沉默技術，屬于轉錄后基因沉默機制〔4〕，它由雙鏈RNA 啟動，降解與雙鏈RNA 具有相同序列的同源mRNA，進而高效、特異地阻抑細胞內源或外源性靶基因的表達，引起基因沉默。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，長度為21～23 nt的siRNA 能引起特異性基因沉默，又不影響體內其他非目的基因的表達〔5〕。目前，RNAi 作為一種成熟的基因沉默技術已被廣泛地運用到科研實踐中，并取得了較好的基因沉默效果〔6〕。趙景宏等〔7〕利用RNAi技術成功地抑制了胰腺癌細胞中stathmin 基因而抑制了腫瘤細胞的生長，其抑制的特異性和效率都高達90%以上。還有研究發(fā)現(xiàn)，RNAi 在抑制Ⅰ型胰島素樣生長因子BP7(IGFBP7)基因表達時，能快速且特異地誘導惡性黑色素瘤細胞凋亡〔8〕。這些都說明采用RNAi 技術封閉癌基因在誘導某些癌細胞凋亡、抑制其復發(fā)和遠處轉移方面發(fā)揮至關重要的作用。

細胞的增殖、分化和凋亡之間的平衡是組織穩(wěn)定性的先決條件，如果細胞凋亡受抑，細胞增殖與凋亡的平衡調節(jié)被破壞，結果導致細胞數(shù)目不斷增加，表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。Bi-1 作為細胞凋亡通路上受Bcl-2和Bax 調控的調節(jié)蛋白，在惡性腫瘤中，其過度表達或表達不足導致Bi-1/Bcl-XL/Bcl-2 和Bax 蛋白失去平衡，引起凋亡不足，細胞增殖與凋亡的平衡調節(jié)被破壞，與腫瘤的發(fā)生密切相關，而且可影響腫瘤的惡性行為如浸潤、轉移、惡性生長。雖然Bi-1 在動物的睪丸、肺、前列腺、心臟、腦、胎盤、肝、骨骼肌、脾、腎和胰腺等組織中廣泛表達，但是與相應的正常細胞相比，Bi-1基因在前列腺癌、原發(fā)性乳腺癌細胞中的表達上調4～10倍。另外，在子宮癌、卵巢癌、胃癌和肺腺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)Bi-1 基因表達的上調，這些表明Bi-1基因過表達可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，有望成為腫瘤治療的新靶點。然而，Bi-1 與其他腫瘤的關系尚未見報道，還需要進行深入的研究。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，當某些癌細胞(如乳腺癌、鼻咽癌)中高表達的Bi-1 基因被特異性地沉默后能抑制其生長增殖并誘導細胞發(fā)生凋亡甚至死亡，這就提示Bi-1 基因在腫瘤的基因治療中可能有著重要的意義〔9〕。

本研究選取Bi-1 基因明顯高表達的鼻咽癌細胞株CNE-1 和SUNE-1 為靶細胞，以復制缺陷型慢病毒作為載體，首先成功構建可特異性沉默Bi-1 基因表達并帶有GFP 報告基因的慢病毒載體LunIG-Bi-1-shRNA，并得到了較高滴度的慢病毒lenti-shBi-1。重組病毒顆粒感染兩種鼻咽癌細胞后，經熒光定量PCR 和Western印跡驗證可明顯抑制細胞中Bi-1 基因的表達，抑制率可達85%以上，這為進一步研究Bi-1 基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用提供了有效工具。

1 羅海清,李祥勇,蔡宏華,等.奈達鉑聯(lián)合 BI-1基因沉默對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2015;36(10):1416-8.

2 王會敏,何柯新,徐建華,等.利用 RNAi阻抑 hTERT 和Bi-1雙基因表達的RNAi作用效果的研究〔J〕.重慶醫(yī)學,2015；44(8):1012-6.

3 李桂源，劉華英，周 鳴,等.鼻咽癌癌變的分子機理〔J〕.生物化學與生物物理進展，2006;33(10):922-31.

4 宗永生,吳秋良,林素暇,等.Eb 病毒相關性疾病病理學研究的進展〔J〕.中山大學學報:醫(yī)學科學版,2005;26(5):481-7.

5 張美紅,李祥勇,周克元,等.bi-1 短發(fā)夾狀RNA 重組真核表達質粒對鼻咽癌細胞和卵巢癌增殖的影響〔J〕.腫瘤防治研究,2008;35(5):321-4.

6 Yuan JS,Reed A,Chen F,etal.Statistical analysis of real-time PCR data〔J〕.BMC Bioinformatics,2006;7(1):85-96.

7 趙景宏,黃 嵐,晉 軍,等.造影劑誘導腎小球內皮細胞凋亡的caspase-3 機制〔J〕.中國藥理學通報,2006;22(9):1111-4.

8 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894)：244-51.

9 Chou MI,Hsieh YF,Wang M,etal.In vitro and in vivo targeted delivery of IL-10 interfering RNA by JC virus-like particles〔J〕.J Biomed Sci,2010;24(1):17-51.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

皮 文(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉腫瘤臨床診治研究。

R76

A

1005-9202(2017)03-0555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.014

1 淮安市第一人民醫(yī)院放療科